非熱加工消減水產(chǎn)品致敏性及其評價方法的研究進展

鐘航宇，王滿生 ，鄭鍵欣，成軍虎,3,

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640；2.中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所，湖南長沙 410205；3.華南理工大學現(xiàn)代食品工程研究中心，廣東廣州 510640）

水產(chǎn)品大多富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸，具有很高的營養(yǎng)價值，在人們?nèi)粘Ｉ攀持姓紦?jù)著重要地位。水產(chǎn)品中的魚類和甲殼類具有較高的致敏性，都屬于聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）公布的八大類過敏原之一。2020 年，全國水產(chǎn)品總產(chǎn)量6549.02 萬噸，人均占有量46.39 kg，水產(chǎn)品過敏人群超過1000 萬，但是目前絕大多數(shù)水產(chǎn)品加工企業(yè)并未對水產(chǎn)品中的過敏原做特殊處理，為保障消費者的飲食安全，利用食品加工技術消減水產(chǎn)品致敏性已成為研究重點。

食品加工技術可分為熱加工和非熱加工，雖然熱處理對部分水產(chǎn)品過敏原可以起到較好的致敏性消減作用，但是有研究表明，相同條件下的熱處理會對不同過敏原產(chǎn)生相反的影響，同時熱處理所使用的高溫會引起非酶褐變，導致食品營養(yǎng)的流失。非熱加工技術不僅可以改變水產(chǎn)品過敏原的構象以消減致敏性，還能夠保留水產(chǎn)品原有的特性。而致敏性評價是衡量脫敏效果好壞的標準，只有準確、統(tǒng)一的標準才能使評價結果具有科學性和嚴謹性。目前國內(nèi)對水產(chǎn)品過敏評價體系的研究較為匱乏，國外文獻中涉及的模型紛繁復雜，難以選擇。故本文簡單介紹了食物過敏，綜述了非熱加工技術消減水產(chǎn)品致敏性及其評價方法，以期促進低致敏性水產(chǎn)品的研究和開發(fā)。

1 食物過敏

1.1 食物過敏機制

過敏反應的途徑一共有三種，包括免疫球蛋白E（Immunoglobulin E，IgE）介導的超敏反應、非IgE介導的超敏反應、IgE 和非IgE 共同介導的超敏反應。大部分水產(chǎn)品的過敏反應屬于IgE 介導的超敏反應（Ⅰ型超敏反應），其作用機制包括初始致敏、激發(fā)、效應三個階段，具體作用過程如圖1 所示。

圖1 Ⅰ型超敏反應機制圖Fig.1 Mechanism of type I hypersensitivity

過敏交叉反應是指過敏原（或抗體）除與其相應抗體（或過敏原）發(fā)生特異性反應外，還與其他抗體（或過敏原）發(fā)生反應，種屬關系越近，過敏交叉反應越強。研究表明，有38%的受試者對甲殼類水產(chǎn)品過敏，并且有14%的人同時對甲殼類及軟體類水產(chǎn)品過敏，說明過敏交叉反應在水產(chǎn)品過敏中廣泛存在。

1.2 水產(chǎn)品中主要的過敏原及其特性

小清蛋白（Parvalbumin，PV）是魚類主要過敏原之一，分子量通常為10～13 kDa，具有極高的熱穩(wěn)定性。作為魚體內(nèi)一種維持細胞內(nèi)鈣離子交換的鈣結合蛋白，PV 由其低分子量和高水溶性的特點而得名。不同的魚類中的PV 具有相似性較高的氨基酸序列，其較高的同源性會誘導機體產(chǎn)生過敏交叉反應。

原肌球蛋白（Tropomyosin，TM）是蝦、蟹等甲殼類水產(chǎn)品中最主要的過敏原，分子量在34～38 kDa之間，TM 包含多個肌動蛋白結合位點的穩(wěn)定超螺旋結構，使其具有耐高溫的特性。TM 也具有很高的氨基酸序列同源性，會引起機體的過敏交叉反應。

近年研究中，有許多新型的水產(chǎn)品過敏原被發(fā)現(xiàn)：精氨酸激酶（Arginine kinase，AK）、肌球蛋白輕鏈（Myosin light chain，MLC）、膠原蛋白（Collagen）、血藍蛋白（Hemocyanin）等。已報道的部分新型水產(chǎn)品過敏原見表1。

表1 新型水產(chǎn)品過敏原Table 1 New allergens of aquatic products

2 非熱加工對水產(chǎn)品致敏性的消減作用

2.1 非熱加工技術

非熱加工技術是指采用非加熱的方法處理食品，使食品達到某種特定要求的加工技術。相比起傳統(tǒng)的熱加工技術，非熱加工技術可以在常溫條件下改變過敏原的結構，從而降低水產(chǎn)品過敏原的致敏性。牟慧在研究輻照與熱處理對蝦免疫原性的影響時，發(fā)現(xiàn)熱處理不僅不能降低過敏原Pen al 的致敏性，反而隨著加熱時間的延長，致敏性不斷增強，但是輻照可以在不加熱的情況下顯著降低Pen al 的致敏性。

非熱加工技術可分為物理性、化學性和生物性，其中物理性非熱加工技術占據(jù)主要地位。目前已報道的應用在水產(chǎn)品致敏性研究領域的物理性非熱加工技術主要包括超高壓、超聲波、低溫等離子體、輻照等。除了單純的物理性非熱加工技術，化學、生物性非熱加工技術也在蓬勃發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)，酶解法、糖基化修飾等能夠?qū)λa(chǎn)品過敏原起到降低致敏性的作用。表2 列舉了常用的非熱加工技術。

表2 非熱加工技術Table 2 Non-thermal processing technologies

2.2 非熱加工對水產(chǎn)品致敏性的消減作用

2.2.1 輻照技術 有研究表明輻照處理（1、3、5、7、9 kGy）蟹過敏原TM 之后，其二級和三級結構發(fā)生變化，-螺旋和-轉角含量下降，-折疊和無規(guī)則卷曲含量上升，蛋白結構由折疊變?yōu)檎归_，表面疏水性增強，低劑量輻照對致敏性影響不大，但是隨著處理強度的增強致敏性不斷下降。另有報道稱對蝦中過敏原TM 進行輻照處理可使其結構中的-螺旋遭到破壞，部分解旋為-折疊或無規(guī)卷曲，二級結構中的無序結構比例上升，表面疏水性增強，最終導致TM 致敏性下降。此外，張立敏研究發(fā)現(xiàn)輻照劑量為10 kGy 時，PV 的致敏性降低了95.9%，這表明在安全劑量范圍內(nèi)的輻照能顯著降低部分水產(chǎn)品過敏原的致敏性。

2.2.2 超高壓技術 超高壓技術是食品非熱加工技術發(fā)展以來應用最為廣泛的技術。Zhang 等的研究表明超高壓技術可以有效降低魚類過敏原PV的致敏性，表現(xiàn)在二級結構中-螺旋減少和-折疊增加。張意鋒用超高壓技術處理魷魚過敏原血藍蛋白，使其二級和三級結構變化，表面疏水性增強，致敏性下降。此外，張意鋒等研究了雙循環(huán)高靜壓對魷魚中的TM 致敏性的影響，結果表明200 MPa以上的雙循環(huán)高靜壓都可以有效降低TM 的致敏性。

2.2.3 低溫等離子體技術 低溫等離子體技術是一種新興的食品非熱加工技術，目前其對于水產(chǎn)品過敏原致敏性的影響研究較少。Ekezie 等利用低溫等離子體處理改變了蝦過敏原TM 的二級結構，使其-螺旋含量下降，-折疊和無規(guī)則卷曲含量上升，同時二硫鍵形成，自由巰基含量減少，最終使得TM的IgE 和IgG 結合能力下降，故低溫等離子體技術可以降低水產(chǎn)品致敏性。

2.2.4 超聲波技術 有研究發(fā)現(xiàn)超聲波對三文魚過敏原Sal s 1 的二級結構影響不大，但是超聲波使其表面疏水性增加，氨基酸殘基暴露，致敏性隨著處理時間增加而不斷下降。另有研究表明經(jīng)過高強度超聲波處理后的TM 中-螺旋含量下降，-折疊和-轉角含量上升，TM 的致敏性降低。過敏原普遍對超聲波較為敏感，并且溫度對超聲波處理過敏原的效果有很大影響，如果能夠解決參數(shù)設置的難題并加以合適的控制，超聲波有望成為大規(guī)模應用的食品非熱加工技術。

2.2.5 糖基化處理（美拉德反應） 糖基化處理（美拉德反應）是最常用的化學性非熱加工技術。糖基化處理對水產(chǎn)品過敏原致敏性的消減程度會受到多糖種類、處理時間和溫度、過敏原和多糖的比例以及pH 等多種因素影響。Zhang 等研究了糖基化對蝦過敏原TM 致敏性的影響，發(fā)現(xiàn)使用不同多糖對TM 進行糖基化處理時的致敏性消減效果差距較大，使用麥芽糖對TM 進行糖基化基本不影響致敏性，而使用麥芽七糖對TM 進行糖基化可以大幅度降低致敏性。Shen 等的研究也證明了糖基化可以降低蝦過敏原TM 的致敏性，并且降低程度隨著處理時間的延長而不斷提高。

2.2.6 酶解法 大部分水產(chǎn)品過敏原都是蛋白質(zhì)，所以目前酶解法的研究大多集中在蛋白酶對過敏原致敏性的消減效果。酶解法的效果主要受到酶的種類和酶解條件的影響。有研究表明不同酶介導的酶解處理對魚類過敏原PV 的致敏性消減效果有很大的差異，堿性蛋白酶能夠顯著改變PV 的二級和三級結構，可消除其90%的致敏性，而胰蛋白酶對PV 的二級和三級結構影響較小，致敏性削減效果較差。還有研究用酶解法處理膠原蛋白，使其線性表位和構象表位均遭到破壞，在合適的酶解條件下，膠原蛋白的致敏性基本消失。

3 水產(chǎn)品致敏性評價方法

3.1 血清學方法

過敏原與IgE 結合是過敏原發(fā)揮生物活性的中心環(huán)節(jié)，因此測定過敏原特異性IgE 抗體在過敏癥診斷及過敏原評價中具有重要地位，其中酶聯(lián)免疫吸附法和免疫印跡法是最常用的方法。

3.1.1 酶聯(lián)免疫吸附法 酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是利用抗體分子和抗原分子間的特異性結合特征實現(xiàn)物質(zhì)的分離檢測的一種固相酶分子免疫分析法。ELISA 分類標準并不統(tǒng)一，但可以根據(jù)試劑來源、標本形狀和檢測條件等分為夾心法、間接法、競爭法和捕獲法4 種方法。圖2 所示是競爭ELISA 的實驗流程圖。

圖2 競爭ELISA 實驗流程圖Fig.2 Flow chart of competitive ELISA experiment

目前ELISA 已經(jīng)廣泛應用于食品過敏原致敏性的評估并且ELISA 針對不同過敏原可采取不同種類的方法。Zhang 等使用間接ELISA 研究了HHP（200 MPa、20 min）對大西洋鱘魚過敏原PV 致敏性的影響，結果表明HHP 處理使IgE 和IgG 結合能力相比對照組降低了67%，證明HHP 處理后蛋白質(zhì)的致敏性顯著降低。Li 等探討了電子束輻照（1、3、5、7、10、13 kGy）對大菱鲆過敏原PV 致敏性的影響，競爭ELISA 實驗結果表明特異性IgE 結合百分率降低程度隨著電子束輻照劑量的增加而先增大后減小，在10 kGy 劑量下達到最大值91.3%，PV致敏性基本消失。Dong 等使用夾心ELISA 探究了高強度超聲波（400 W、20 kHz）對蝦過敏原 TM 致敏性的影響，結果顯示在20 min 高強度超聲處理下TM 致敏性降低76%，這意味著高強度超聲波能夠顯著降低TM 的致敏性。ELISA 在致敏性評價實驗中體現(xiàn)出了靈敏性強、操作簡單等優(yōu)點，但ELISA 也有其缺陷，一是交互反應發(fā)生的概率較高，二是部分抗體不適合做標記。

3.1.2 免疫印跡法 免疫印跡法（Western blotting，WB）是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學分析技術相結合的雜交技術。免疫印跡法分三個階段進行，包括電泳、電轉移和酶免疫定位，具體過程如圖3 所示。

圖3 免疫印跡法流程圖Fig.3 Flow chart of western blotting

ELISA 和WB 是評價水產(chǎn)品致敏性時最常用的血清學方法，在進行過敏原致敏性評估時，WB 常與ELISA 聯(lián)合使用以提高結果的準確度。Mou 等從蝦中提取過敏原Pen a1，研究了-輻照（0 ℃，7、10 kGy）對過敏原的影響，通過WB 和ELISA 分析研究了5 個抗原表位的免疫原性，結果證明輻照可以減少pen a1 的致敏性且輻照劑量越高效果越好。Liu 等通過WB 和ELISA 研究了電子束輻照（3、5、7、10 kGy）對TM 致敏性的影響，兩種實驗的結果都表明，低劑量的電子束輻照會提高TM 的致敏性，而高劑量的電子束輻照降低了TM 的致敏性。程華峰使用WB 和ELISA 研究了微波、超高壓、超聲波等不同加工處理方式對中華絨螯蟹中TM 致敏性的影響，結果表明這些加工方式都能降低TM的致敏性。WB 具有分析容量大、敏感度高和特異性強的優(yōu)點，但是WB 也有缺點，一是操作費時，二是在電轉移過程中轉移參數(shù)設置容錯率低，溫度過高或者時間過長都會使膜被燒糊。

3.2 細胞實驗

細胞實驗是一種體外實驗，即在活生物體之外的環(huán)境中借助細胞進行操作的實驗。并不是所有細胞都可以用于致敏性評估實驗，在評價過敏原致敏性時，肥大細胞和嗜堿性粒細胞因為它們在過敏反應中扮演著效應細胞的角色而得到較為廣泛的應用。因為肥大細胞在食物過敏反應過程所起到的脫粒作用，所以通過檢測血清中組胺等物質(zhì)的濃度就可以評價過敏原的致敏性。而嗜堿性粒細胞的細胞質(zhì)內(nèi)含有嗜堿性顆粒，經(jīng)抗原刺激后可釋放組胺和其他活性物質(zhì)，通過檢測血清中這些活性物質(zhì)的濃度也可以評價過敏原的致敏性。

大鼠嗜堿性白血病粒細胞系（rat basophil leukemia，RBL）中的一個亞系是 RBL-2H3 細胞，其主要功能和特征與肥大細胞類似，因此常用于水產(chǎn)品過敏反應方面的研究。圖4 所示是RBL-2H3 細胞實驗的流程圖。Huang 等以藍圓鲹為原料，研究了超聲波處理（200 W）、紫外線處理（302 nm、15 W）等不同非熱處理方法對PV 致敏性的影響，RBL-2H3 細胞實驗的結果表明上述處理方法均可降低PV 致敏性并且美拉德反應和高壓聯(lián)合處理對PV 致敏性的消減最明顯。Zhang 等通過RBL-2H3 細胞實驗證明了糖基化可以降低TM 的致敏性，表現(xiàn)在組胺和-氨基己糖苷酶釋放的減少。RBL-2H3 細胞實驗目前已經(jīng)廣泛應用于評價水產(chǎn)品過敏原致敏性的研究中，并表現(xiàn)出可操作性強、均一性好等優(yōu)點。與傳統(tǒng)的食物致敏性評價方法的結果相比，RBL-2H3 細胞實驗的結果也顯示出良好的一致性，但是有研究證明一些非免疫性刺激也可以導致RBL-2H3 細胞釋放組胺等炎癥介質(zhì)，故其有效性還需進一步驗證。

圖4 RBL-2H3 細胞實驗流程圖Fig.4 Flow chart of RBL-2H3 cell experiment

3.3 體外模擬消化試驗

食物中過敏原的致敏性取決于兩個方面，一是過敏原蛋白在通過消化道時的消化穩(wěn)定性，二是消化產(chǎn)物中具有免疫刺激能力的過敏原表位的豐度。體外模擬消化試驗正是通過過敏原在胃腸道中的消化穩(wěn)定性來間接判斷其致敏性。體外模擬消化根據(jù)消化單元可分為口腔模擬消化、胃和小腸模擬消化以及大腸模擬消化。

在食物過敏原致敏性評價中最常用的是模擬胃腸液的消化試驗。Jin 等探究了HHP 處理（20 min，200、400 和600 MPa）對TM 致敏性的影響，該研究使用模擬胃液消化和模擬腸液消化試驗來測定TM消化穩(wěn)定性的變化，對消化后的產(chǎn)物進行分析，發(fā)現(xiàn)TM 隨著消化片段的形成而逐漸減少，證明HHP 確實降低了TM 的致敏性。另有研究探討了高強度超聲波處理（100～800 W、15 min）對TM 致敏性的影響，通過模擬腸胃液消化試驗證明了高強度超聲波處理顯著降低了TM 的致敏性。體外模擬消化實驗雖然無法對體內(nèi)消化過程做到高度還原，但其具有操作簡單、快速、價格低廉、實驗周期短、可重復性高等優(yōu)點。因此，目前許多過敏原致敏性的研究中都會使用體外模擬消化來進一步研究其致敏性的變化。

3.4 動物實驗

動物實驗是指利用具有人類疾病模擬表現(xiàn)的動物進行實驗的實驗方法。圖5 所示為動物實驗基本流程圖。小鼠是最常用的實驗動物，這不僅是因為小鼠繁殖周期短、易飼養(yǎng)，也是因為小鼠擁有和人相近的生理學表現(xiàn)。應用于水產(chǎn)品致敏性評價的小鼠品系包括C57BL/6、C3H/HeJ、DBA2、BALB/c 等。

圖5 動物實驗基本流程圖Fig.5 Basic flow chart of animal experiment

BALB/c 小鼠起源于小家鼠，是近交高IgE 應答品系，優(yōu)先產(chǎn)生Th2 型免疫應答和IgE 抗體，是最常被用來判定蛋白質(zhì)致敏性的小鼠品系。Zhang 等使用雌性BALB/c 小鼠模型研究了糖基化處理對蝦中TM 致敏性的影響，與TM 相比，經(jīng)過糖基化處理的TM 致敏性顯著降低并且使用麥芽五糖進行糖基化的TM 致敏性降低程度最高。Zhang 等通過雌性BALB/c 小鼠模型試驗研究了糖基化和脫糖基化處理對TM 致敏性的影響，實驗結果表明脫糖基化加重了TM 的致敏性，糖基化則降低了TM 的致敏性。孫佳益等使用BALB/c 小鼠模型試驗探究了利用無花果蛋白酶酶解TM 對其致敏性的影響，發(fā)現(xiàn)酶解使得IgE 的結合能力降低77.83%，表明使用無花果蛋白酶進行酶解是一種有效降低TM 致敏性的方法。

動物實驗是深入研究過敏原致敏性時必不可少的一種實驗方法，其優(yōu)勢在于避免了在人體上進行實驗所帶來的風險并且實驗結果更接近實際情況。但是只采用一種類型的小鼠用于致敏性評價動物實驗存在一定缺陷，Morafo 等研究發(fā)現(xiàn)給予BALB/c小鼠和C3H/HeJ 小鼠灌胃過敏原，后者的特異性IgE 水平在致敏后的第6 周顯著性升高，而前者特異性IgE 水平只略高于對照組小鼠。因此，在進行動物實驗時最好能夠利用不同種類的小鼠進行實驗以確保實驗結果的準確性。此外，致敏途徑也會影響動物實驗結果的準確性，在設計實驗時要合理選擇致敏途徑，有研究表明腹腔注射TM 比口服灌胃更易使BALB/c 小鼠致敏，更適合于構建用于食物致敏性評價的動物模型。

4 總結

綜上所述，雖然非熱加工技術能夠有效降低水產(chǎn)品致敏性，但是目前用于消減水產(chǎn)品過敏原致敏性的技術都存在一定的局限性，通過研究不同非熱加工技術降低水產(chǎn)品致敏性的機理，開發(fā)綜合性加工方法以完全消除水產(chǎn)品致敏性并確保水產(chǎn)品的安全性是今后研究的重點方向。從過敏反應的過程著手并結合水產(chǎn)品過敏原構象的變化，通過血清學方法、體外模擬消化和細胞實驗以及體內(nèi)動物實驗構建多級致敏性評價模式，深入研究過敏原構象變化和致敏后炎癥介質(zhì)變化之間的關聯(lián)性，從而進一步揭示非熱加工對水產(chǎn)品致敏性的影響規(guī)律，為有效降低水產(chǎn)品致敏性提供理論依據(jù)。