結核分枝桿菌cfDNA在結核病診斷中的發展現狀和挑戰

彭利君 方婷婷 蔡龍

當前，結核病(tuberculosis，TB)仍然是嚴重危害人類健康的重大傳染病，特別是新型冠狀病毒肺炎的全球大流行給全球TB的防控帶來了新的挑戰[1-2]。據估計約有40%的TB患者由于診斷率過低而未能及時確診和報告[3]。因此，TB的快速診斷對于患者早診斷、早治療、臨床預后和傳播極為重要。結核分枝桿菌循環游離DNA(Mycobacteriumtuberculosiscirculating free DNA，MTB-cfDNA)可表明病原體的存在，是TB診斷和治療監測有吸引力的生物標志物。本文將對血液、尿液及胸、腹腔積液和腦脊液標本的檢測現狀進行綜述，綜合評價MTB-cfDNA對TB的診斷效果，并對基于cfDNA的TB檢測開發的主要挑戰進行總結。

一、常用TB檢測方法和新的cfDNA檢測

分枝桿菌培養是TB診斷的金標準，但檢測周期較長；痰涂片顯微鏡檢查和血清結核抗體便宜、簡單、快速，且后者生物風險低，但兩者敏感性均較低；γ-干擾素釋放試驗的敏感度和特異度良好，但結果易受宿主年齡、疾病和免疫狀態的影響，也不能確定是否為活動性TB[4]。而尚處于研究階段的血清蛋白檢測因與其他慢性肺部疾病有重疊，缺乏診斷特異性，通常需要檢測一組蛋白才能進行結核病診斷[5-6]。近年來，已經開發了較多針對MTB基因組DNA的快速分子檢測方法，例如實時定量PCR，以及世界衛生組織認可的環介導等溫擴增技術、GeneXpert MTB/RIF和Xpert Ultra等[7-8]。然而，這些方法通常檢測痰液等呼吸道標本，對難以提供痰液的肺結核(pulmonary tuberculosis，PTB)患者(如兒童、長期臥床等咳痰困難患者)和通常需要侵入性活檢的非呼吸道標本的肺外結核(extrapulmonary tuberculosis，EPTB)患者的適用性有限，而現有的診斷方法并未針對這些樣本進行優化。

cfDNA也被稱為細胞游離DNA(cell-free DNA)或無細胞DNA，于1948年首次在人類血液中被發現[9]。cfDNA是存在于人體血液和其他體液的無細胞部分的核酸片段[10]，即將死亡的人類細胞和微生物分解時將cfDNA釋放入血液，隨著血液循環進入體液的各個組分，可通過PCR或測序進行分析。cfDNA的特征和數量可在不同的生理和疾病條件下發生改變，這可能是由于宿主細胞在惡性腫瘤、生理狀態(如妊娠)和存在傳染源(如病毒、細菌或寄生蟲)等情況下的過度損傷或更替導致[9]。cfDNA在癌癥檢測[11-13]、器官移植監測[14]、產前基因篩查[15]等方面的應用已較為成熟，如早在1999年就有使用cfDNA檢測EB病毒篩查鼻咽癌的報道[16]，在診斷侵襲性真菌[17]、寄生蟲和HIV等感染方面也有報道[10, 18-19]。對于TB診斷，cfDNA是一種很有潛力的生物標志物，在胸腔積液、腹腔積液和腦脊液等體液樣本中檢測MTB-cfDNA顯示出比GeneXpert MTB/RIF等基因組DNA更高的TB診斷準確度[20-27]，而血液和尿液中檢測MTB-cfDNA適用于任何年齡組患者，尤其是無痰的PTB患者和EPTB患者。

二、血液標本的MTB-cfDNA檢測

血液cfDNA診斷TB的敏感度在不同的研究中差異較大，介于27%～100%之間[28-34]，可能與多個原因相關。其一，MTB-cfDNA在血液中含量甚微，易受血液中含量較高的核酸(包括DNA、rRNA、mRNA等)、蛋白質及其他物質的影響，使目標核酸提取不足[28, 30]。其二，檢測靶標和檢測方法不一致也可能是一個原因。從以往的研究來看，以IS6110為靶標能獲得更好的檢測敏感度和特異度，相對于其他檢測方法數字PCR的檢測結果更好(表1)。2021年Pan等[33]的前瞻性研究證實，在2名結核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)者的血液中檢出MTB-cfDNA，這提示血液中MTB-cfDNA的檢測可用于篩查LTBI者，但需要更大規模的隊列研究或使用更敏感的方法來評估其在該人群中的應用價值。

三、尿液標本的MTB-cfDNA檢測

70%以上的血漿cfDNA小于300 bp，峰值長度為160～167 bp[35-37]，這將允許其穿過腎小球屏障進入尿液中，且尿液中的MTB-cfDNA平均片段長度(19～52 bp)明顯短于人基因組cfDNA(42～92 bp)[38]。尿液MTB-cfDNA診斷TB的敏感度和特異度分別為43%～83.7%和89%～100%的范圍內[39-43]，且檢測的敏感度隨著擴增產物長度的減少而增加[40]。但不同的提取方法在捕獲尿液中短、微量cfDNA的能力上存在較大差異[37]，其中Oreskovic和Lutz[40]、Oreskovic等[41]開發的一種超靈敏探針雜交方法表現優異。該方法使用固定在磁珠上的序列特異性寡核苷酸捕獲探針來提取10 ml尿液樣本中的MTB-cfDNA，有效捕獲和擴增短至25 bp的片段，檢測限可達0.5 copies/ml，敏感度和特異度分別達到了83.7%和100%。

與傳統的PTB診斷標本類型相比較，尿液是一種易于收集、樣本量大、生物安全風險低的樣本，從尿液中檢出MTB可能可以發現許多未得到充分檢測的TB人群，尤其是那些細菌載量低的人群，包括兒童和患有EPTB的人群，尿液cfDNA是十分有潛力的MTB診斷生物標志物。但由于尿液中MTB-cfDNA 的片段短，應該更加關注cfDNA的富集和提取，因此，設計針對超短片段的樣本制備和擴增方法至關重要。

四、胸、腹腔積液和腦脊液標本的MTB-cfDNA檢測

胸、腹腔積液和腦脊液cfDNA診斷TB的敏感度為53%～100%，特異度為96%～100%[20-22]，其敏感度高于培養和GeneXpert MTB/RIF約2～4倍，可能由以下兩個原因造成：首先，胸、腹腔積液和腦脊液處于相對封閉的環境，大部分MTB被體內免疫細胞吞噬后，經溶酶體降解釋放出大量的cfDNA，由于胸膜和腹膜都有半透膜特性，cfDNA不易透過，使得cfDNA濃度較高；而GeneXpert MTB/RIF檢測的是沉淀中完整菌體的基因組DNA，相對MTB-cfDNA而言濃度更低，這可能是其敏感度低于MTB-cfDNA檢測的主要原因[21-24]。其次，GeneXpert MTB/RIF檢測的是RNA聚合酶rpoB基因的81 bp耐藥決定區的單拷貝基因，而MTB-cfDNA 檢測的是MTB特異性多拷貝重復插入序列IS6110。Haldar等[24-25]研究表明，結核性腦膜炎患者腦脊液的沉淀物檢測MTB的敏感度較濾液低2～3倍，提示濾液較沉淀物是更好的診斷疑似結核性腦膜炎的分子檢測樣本。

五、綜合評價MTB-cfDNA對TB的診斷效能

考慮到是世界衛生組織發布的目標產品的特性，推薦非痰標本生物標志物檢測的最低可接受敏感度和特異度分別為65%和98%、最佳敏感度和特異度分別為80%和98%[44]，依據目前研究的性能結果，MTB-cfDNA未來極有可能成為TB檢測主要的生物標志物。表1總結了國內外MTB-cfDNA診斷TB研究的性能評估，數據顯示不同樣本類型的MTB-cfDNA診斷敏感度不同，用途也可能不同。對于獲得呼吸道樣本有困難的人群，檢測其尿液和血液的MTB-cfDNA會更有優勢，預測未來尿液樣本的cfDNA檢測有可能用于常規TB篩查，而血液cfDNA檢測有可能在LTBI篩查方面有所突破；另外，相比于GeneXpert MTB/RIF等基因組DNA診斷TB，檢測胸、腹腔積液和腦脊液的cfDNA 看起來是更好的選擇。

六、開發基于cfDNA診斷TB檢測方法的主要挑戰

cfDNA廣泛用于臨床需要進一步提高其敏感度，面臨的挑戰主要包括以下幾個方面：

1.標準化的前處理程序：體液中的cfDNA濃度較低，當進行PCR檢測時，其效率主要取決于分離方法的質量控制和穩健性。進行適當的樣品前處理(即在擴增和檢測步驟之前進行樣品處理)是提高檢測敏感度的關鍵點之一[45]。cfDNA的前處理程序包括：樣品采集(采集多大樣本量、使用何種收集管)、樣品儲存(防腐劑)、cfDNA 提取(最佳的提取試劑盒/方法)及其提取物的儲存(-20 ℃和-80 ℃可以儲存多長時間)。

表1 國內外結核分枝桿菌cfDNA診斷結核病的性能評估

樣本離心取上清或用0.22 μm濾膜過濾的前處理步驟可以避免提取到沉淀中的基因組DNA稀釋cfDNA。目前市售的提取試劑盒對MTB-cfDNA的提取都是非特異性的，參考Oreskovic和Lutz[40]、Oreskovic等[41]開發的特異捕獲病原cfDNA的核酸富集方式，為提高以cfDNA為靶標診斷其他疾病的敏感度提供了新的思路。Murugesan等[46]對影響血液和尿液中病原體cfDNA分析前的變量的研究表明，對于血液標本最好使用K2EDTA抗凝的采血管，而尿液標本最好使用Tris-EDTA作為防腐劑。使用防腐劑后血液和尿液標本可以在室溫下延遲處理24 h。在-80 ℃保存24周后，新鮮和解凍血漿與尿液間沒有觀察到顯著差異，且使用更大的樣本量能獲得更多cfDNA。EI Messaoudi等[45]建議血液樣本進行兩次離心，而Murugesand等[46]發現兩次離心(第一次500×g、第二次16 000×g)會使血液樣本的cfDNA濃度下降，這可能是由于第二次離心力過大導致白細胞基因組DNA釋放，降低cfDNA的比例，造成cfDNA被稀釋。這些發現表明，使用防腐劑后延遲24 h處理大容量單次離心的K2EDTA血漿和Tris-EDTA尿液可能會優化cfDNA檢測。此外，也需要MTB-cfDNA標準品作為質量控制，以驗證cfDNA不同的檢測方法，最終實現以檢測體液MTB-cfDNA 濃度來進行臨床診斷和治療監測。

2.需要大規模的臨床驗證：從患者數量來看，既往研究的患者數量不多，需要更大規模的隊列研究進行臨床驗證來評估MTB-cfDNA在TB中的應用價值。從研究人群來看，在特定人群中的研究，特別是基于MTB-cfDNA的HIV感染者診斷的研究數量有限，針對兒科患者的研究更是極少。對于這些難以留取痰液的人群，更適合檢測體液中MTB-cfDNA進行診斷，因此更需要進行大規模的臨床驗證。

七、展望

由于新型冠狀病毒肺炎的大流行，我國的集中檢測能力有所提高，未來TB的快速分子篩查可能受益于這些進步。cfDNA可以識別身體任何部位的結核感染，并有可能檢測出目前傳統微生物學方法無法識別的疾病狀態(如LTBI)。除了檢測MTB外，分析cfDNA還可以使我們更深入地了解其遺傳特征[47]，如耐藥基因等，以指導臨床用藥。但值得注意的是，病原體cfDNA不如基因組DNA穩定，尤其在患者治療后，其體內病原體cfDNA會很快被免疫細胞清除[43]，若仍可檢測到MTB-cfDNA，則很可能是新釋放到體液循環中的MTB，故認為檢測MTB-cfDNA可用于反映當前的疾病狀況，對治療有監測作用。

總之，cfDNA作為TB診斷生物標志物的研究仍處于起步階段，未來需要更大型、納入患者類型更全面的臨床研究來評估其效用。隨著檢測cfDNA方法的進一步優化，其敏感度和特異度將進一步提高，有助于改善TB診斷，并很可能使其成為“游戲規則的改變者”。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻彭利君：文章撰寫和修改；方婷婷：文獻查找；蔡龍：文章修改和審閱