程序性細胞死亡蛋白1/程序性細胞死亡配體信號通路在結核病免疫調控中的研究進展

劉琪 梁建琴

結核病是嚴重威脅人類健康的主要傳染性疾病之一，全球及我國疫情依然嚴峻[1]。結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)的免疫識別、免疫應答和免疫調節決定了結核病的發生、發展和結局[2]。所以，近年來結核病免疫調控及免疫治療成為研究熱點。程序性細胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)，也稱為程序性死亡受體，是一種重要的免疫抑制分子，為免疫球蛋白超家族成員，最初是從凋亡的小鼠T細胞雜交瘤2B4.11克隆出來[3]。程序性細胞死亡配體(programmed cell death ligand,PD-L)包括程序性細胞死亡配體1(programmed cell death ligand-1,PD-L1)和PD-L2，通常與PD-1結合發揮作用，也可作為靶點發揮免疫調節作用[3]。PD-1/PD-L1、PD-L2通路的免疫調節作用對抗腫瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意義[4]。目前根據PD-1/PD-L1、PD-L2通路研發的抗腫瘤單抗藥物在臨床應用中取得顯著的治療效果[5]。研究發現，PD-1/PD-L1、PD-L2通路在結核病的免疫應答中發揮著重要作用。本文就PD-1/PD-L1、PD-L2的結構和功能及其在結核病發生發展和轉歸過程中的免疫調控作用進行綜述。

PD-1/PD-L1、PD-L2的結構與功能

PD-1也稱作PDCD1和CD279，是由PDCD1基因編碼的288個氨基酸殘基組成的相對分子質量為50 000～55 000的Ⅰ型跨膜蛋白，屬于 B7-CD28 受體超家族[3,6]。它的結構包括4 個部分：免疫球蛋白可變區(IgV)、跨膜區、免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs,ITIM)、免疫受體酪氨酸轉換基序(immunoreceptor tyrosine-based switch mo-tifs,ITSM))，其在骨髓細胞、樹突狀細胞、自然殺傷(natural killer, NK)細胞、單核細胞、胸腺CD4-CD8-雙陰性細胞、調節性T細胞、B細胞以及抗原呈遞細胞(antigen-presenting cell,APC)等多種免疫細胞表面均有表達，兩個基序是PD-1發揮免疫抑制功能必需的受體[7-8]。PD-1有兩個配體分別為PD-L1(CD274)和PD-L2(CD273)，它們分別是由290個與270 個氨基酸殘基組成的Ⅰ型跨膜蛋白，同屬于B7家族，并且具有37%的同源序列。PD-L1由IgV和IgC樣胞外區、跨膜區、短的胞質尾區3個部分組成，在抗原呈遞細胞、非淋巴器官和多種腫瘤細胞上表達[9-10]。雖然PD-L1與PD-L2都是PD-1的配體，但PD-L2 表達范圍相對較窄，而且主要表達在樹突狀細胞、單核細胞等免疫細胞上。PD-1/PD-L1信號通路的激活廣泛參與T細胞的激活、增殖和凋亡等一系列過程，抑制T細胞介導的細胞免疫反應，是目前研究的熱點。PD-1/PD-L1的異常活化及表達在腫瘤的發生發展、慢性感染、自身免疫性疾病中起著重要作用。

PD-1/PD-L1信號通路在結核病免疫應答中的作用

一、PD-1/PD-L1通路在結核病肺泡巨噬細胞中的作用

肺泡巨噬細胞可以清除肺泡表面的細菌，同時保護呼吸系統免受微生物感染[11]。肺泡巨噬細胞通過抑制人或動物體內的PD-1/PD-L1信號通路，對MTB感染的先天免疫反應的初始階段起重要作用，PD-1/PD-L1信號通路高表達與MTB感染之間存在相關性[12-13]。(1)在感染MTB的肺泡巨噬細胞中，PD-1和PD-L1水平升高，絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)，又稱蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)和哺乳動物靶標雷帕霉素(mammalian trget of rapamycin,mTOR)水平降低。AKT和mTOR具有宿主抗菌功能，AKT和mTOR水平的抑制是CD4+T細胞激發宿主廣泛功能損傷的顯著因素[14]。推測AKT和mTOR水平降低有助于MTB在激活的肺泡巨噬細胞中的存活[15]。(2)H37Rv和卡介苗(BCG)感染可以促進M1巨噬細胞的功能，從而提高CD11c、CD16和CD86蛋白水平和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)、白細胞介素17(interleukin-17,IL-17)、IL-2、IL-6、IL-17A和γ-干擾素(IFN-γ)的分泌，提高活性氧(reactive oxygen species,ROS)的陽性水平。TNF-α在MTB感染過程中對巨噬細胞的活化、凋亡以及趨化因子和細胞因子的產生起重要作用[16]。TNF-α通過NF-κB激活上調PD-L1水平，PD-L1可以介導NF-κB信號通路，參與MTB感染的免疫應答[17-18]。IL-17A具有通過誘導自噬并動員嗜中性粒細胞激活巨噬細胞消滅MTB的作用[19]；IFN-γ主要由激活的CD4+T細胞、CD8+T細胞等產生，對MTB感染的控制起重要作用[20]；IL-2 主要作用是促進CD8+T細胞活化為細胞毒性T細胞，具有殺滅MTB的功能[21]。IL-2與IFN-γ具有協同作用，IFN-γ、IL-2激活巨噬細胞通過氧依賴途徑殺死MTB[22]，同時可促進 Th1 細胞增殖，Th1 細胞免疫在抵抗MTB過程中起到了決定性的作用[23]。IL-6抑制IFN-γ誘導的結核分枝桿菌H37Rv感染巨噬細胞自噬；ROS的產生是宿主細胞對MTB入侵最早的先天免疫反應之一，因為氧自由基能夠抵御病原體在組織中定植，從而殺滅MTB[24-25]。(3)阻斷PD-L1有助于增加體外抗原特異性CD8+T細胞對IFN-γ激活的巨噬細胞的細胞毒性。在感染MTB的肺泡巨噬細胞中，B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)相關X蛋白(Bax)水平升高，Bcl-2水平降低，而抑制PD-1/PD-L1信號通路時，可以發生逆轉作用。Bax作為Bcl-2家族的促凋亡成員，通過與Bcl-2同源二聚作用介導細胞凋亡[26]。Bcl-2蛋白家族調控細胞凋亡，參與組織穩態、發育和維持免疫[27]。Bcl-2的細胞保護作用來自于其抵抗Bax的能力，從而阻止肺泡巨噬細胞的凋亡。

推測PD-1/PD-L1信號通路促巨噬細胞凋亡的原因可能是，PD-1和PD-L1的相互作用導致PD-1胞內結構域的ITIM和ITSM磷酸化，使T細胞抗原受體(T cell antigen receptor,TCR)信號通路中的蛋白脫磷酸化，并抑制TCR下游的磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositol 3-kinase,PI3K)、PKB、mTOR、大鼠肉瘤(rat sarcoma,RAS)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulatory protein kinases,ERPK)等信號通路，進而抑制相關基因的轉錄，阻礙巨噬細胞周期的進程和相關蛋白的表達，使Bcl-2中的促凋亡和抗凋亡蛋白表達比例失衡而導致巨噬細胞的凋亡[28]。以上結果表明，抑制PD-1/PD-L1信號通路可以增強肺泡巨噬細胞對MTB的先天免疫反應，可能會減弱肺泡巨噬細胞中的MTB，提示其有可能成為結核病治療的新靶點。

二、PD-1/PD-L1 通路在結核病不同T細胞亞群中的作用

PD-1被確定為一種新的免疫衰竭標志物，可抑制效應T細胞反應[29-30]。最近在HIV、丙型肝炎病毒和結核病等傳染病中觀察到PD-1與其配體之間相互作用在抑制T細胞反應中的作用[31-36]。人類研究的數據顯示，PD-1在結核病發病機制中具有免疫抑制作用[36-37]。PD-1/PD-L1在結核病患者的T細胞、B細胞和單核細胞上表達均增強，阻斷PD-1/PD-L1通路可促進T細胞增殖和IL-2、IFN-γ等細胞因子的分泌，誘導Th1反應以控制胞內MTB，有效的抗結核藥物可以降低PD-1的表達水平[37-38]。

研究表明，PD-1+和PD-L1+細胞頻率不僅在CD4+T細胞上顯著提高，而且在不同的CD4+T細胞亞群上也顯著提高[39-40]。(1)有效藥物治療后，反應性T細胞和效應性T細胞的PD-1表達均下降，即隨著結核病治療的成功，CD8+T、CD4+T和NK細胞上PD-1的表達下降，為PD-1在結核病發病機制中的免疫抑制作用提供了強有力的證據。(2)PD-1在調節性T細胞(Treg)亞群上的表達在治療前后均無差異，說明PD-1在Treg發育和功能維護中具有特殊作用。 Treg是一類具有顯著免疫抑制作用的以表達叉頭框P3(forxhead boxP3, Foxp3)轉錄因子、CD25、CD4為細胞表型特征的T細胞亞群，它能夠抑制其他細胞的免疫應答，在維持自身耐受、自身穩定中起了極其重要的作用，PD-1介導的Treg細胞對同種異體T細胞具有抑制作用[39-40]。研究表明，PD-1/PD-L1通路可能通過一種新機制負向調控Treg增殖及其抑制功能，包括阻止IL-2驅動信號傳導及轉錄激活蛋白5(signal transducer and activator of trascription 5, STAT5)磷酸化的機制[41]。在活動性結核病患者中，CD4+CD25-T細胞(Tresp)和CD4+CD25+Foxp3-低表達的效應性T細胞(Teff)亞群上PD-L1的表達高于健康人群，但其確切作用尚不清楚。阻斷富集Treg細胞上表達的PD-1可以恢復保護性細胞因子(如IFN-γ)的產生，而且在Treg細胞上抑制PD-1的表達可防止產生T細胞的抗原特異性IFN-γ的凋亡。(3)PD-L1在樹突狀細胞上增加，對Treg細胞的增殖有促進作用[42]。PD-1對Treg細胞的上調可能與肺結核中Treg的增殖有關。此外，經過有效抗結核治療后臨床改善與Tresp和Teff細胞中PD-1表達的明顯降低相關，但在Treg細胞上PD-1的表達不明顯。因此，研究PD-1/PD-L1通路在不同 T細胞亞群中的表達特征和動態變化，可用作預測抗結核治療臨床療效的候選藥物。CD4亞群中PD-1/PD-L1通路的調節可能為結核病的控制提供免疫治療靶點[43]。

不同結核病分類中PD-1/PD-L1、PD-L2信號通路的免疫調控作用

一、PD-1/PD-L1、PD-L2 信號通路在結核性胸膜炎中的作用

一項有關結核性胸膜炎的研究顯示，當胸膜間皮細胞(pleural mesenchymal cells,PMC)與來自不相干供體的胸膜CD4+T細胞共培養時，CD4+T細胞的增殖可以被抑制，而與抗PD-L1和(或)抗PD-L2單抗共培養可消除PMC誘導的抑制，這表明PD-1/PD-L1、PD-L2途徑抑制了CD4+T細胞的增殖，而未表明PD-1/PD-L1、PD-L2途徑以影響CD4+T細胞的凋亡。與漏出性積液相比，結核性胸膜炎的PMC的PD-L1、PD-L2表達要高得多，而且IFN-γ不僅上調了PD-1在CD4+T細胞上的表達，而且上調了PD-L1、PD-L2在PMC上的表達。因此，IFN-γ有可能作為結核性胸膜炎的診斷標志物[44]。

有數據顯示，PD-1單抗促進了CD4+T細胞黏附，而沒有上調相應的細胞黏附分子和血管細胞黏附分子受體，說明PMC上的PD-1/PD-L1、PD-L2通路選擇性抑制CD4+T細胞的增殖和黏附活性。在結核性胸膜炎中，PD-1的濃度、CD4+T細胞上PD-1的表達以及PMC上PD-L1、PD-L2 的表達都增加了，并且MTB特異性抗原刺激釋放IFN-γ也促進了結核性胸膜炎中PD-1/PD-L1、PD-L2 的上調[45-46]。

二、PD-1/PD-L1、PD-L2信號通路在粟粒性肺結核中的作用

由PD-1介導的異常/過度抑制可能會損傷宿主對MTB的免疫力，從而導致粟粒性肺結核。在分枝桿菌抗原的作用下活化Th1細胞產生IFN-γ和TNF-α，這對巨噬細胞活化和控制細菌復制至關重要[47]。各種T細胞亞群和抗原呈遞細胞之間的作用對于誘導T細胞反應很重要。

和健康對照組比較，在粟粒性肺結核支氣管肺泡灌洗液中表達PD-1、PD-L1和PD-L2陽性CD3 T細胞明顯升高，表達PD-L1陽性CD19 B細胞明顯增加，說明PD-1和PD-L1 對粟粒性肺結核病變部位的局部免疫反應抑制起著關鍵性作用。阻斷PD-1通路，粟粒性肺結核患者的外周血和支氣管肺泡灌洗液中MTB特異性T細胞的凋亡明顯減少。這表明PD-1在結核病患者肺部病變環境中的過度表達誘導效應T細胞凋亡率升高。

在粟粒性肺結核患者病變部位，PD-1選擇性地抑制具有保護作用的MTB特異性T細胞，反而使產生抑制性IL-4因子細胞免受損傷，從而使局部免疫功能狀態更加惡化，破壞了保護性Th1反應，抑制宿主免疫力，導致無法在粟粒性肺結核的病變部位引發足夠水平的效應免疫。阻斷PD-1后，粟粒性肺結核患者的支氣管肺泡灌洗液中產生抗原特異性IFN-γ的T細胞增加是最明顯的，這表明PD-1介導對產生IFN-γ的效應T細胞的抑制程度最高，PD-1與產生IFN-γ、TNF-α和IL-2和加快細胞凋亡的細胞數量減少有關。阻斷PD-1通路后明顯提高了產生TNF-α因子和IFN-γ因子CD4+T細胞的頻率，可明顯提高粟粒性肺結核患者支氣管肺泡灌洗液中的多功能T細胞(IFN-γ/TNF-α和IFN-γ/IL-2)水平。抑制PD-1通路不僅恢復了產生單個細胞因子的T細胞，更重要的是恢復了粟粒性肺結核病變部位的多功能效應T細胞。阻斷PD-1/PD-L1通路會恢復保護性T細胞反應。因此，MTB通過PD-1/PD-L1、PD-L2通路改變粟粒性肺結核病變部位的Th1和Th2平衡，逃避宿主免疫應答，從而有利于疾病播散[48]。阻斷PD-1/PD-L1、PD-L2通路有利于粟粒性肺結核患者的免疫力恢復和疾病的康復，將成為未來控制和治療粟粒性肺結核的新方法。

PD-1/PD-L1、PD-L2通路對結核病治療的影響

一、PD-L1 抗體可抑制結核病復發

有研究顯示，結核病治療后CD4+T細胞表面的PD-1表達降低[49]。結核病治療強化期PD-1、PD-L1和PD-L2表達下降，治愈的結核病患者血液中PD-L1和PD-L2表達細胞的頻率降低，每個細胞的PD-L1和PD-L2表達減少[38]。另一項研究同樣顯示，在活動性結核病患者中，PD-1在B細胞、單核細胞和T細胞表面的表達升高，化療可導致PD-1通路的負向調節[37]。孫萌萌等[50]利用功能性PD-L1單抗阻斷巨噬細胞介導的 PD-1/PD-L1通路，研究其對小鼠結核治療后復發的免疫干預作用和機制。結果顯示，小鼠感染H37Rv 2周后，當異煙肼和異煙肼聯合PD-L1單抗分別治療4周之后，肺、脾和肝荷菌量均較模型對照組明顯降低，肉芽腫樣病變也明顯減輕，但是兩個治療組之間差異無統計學意義。而在復發期，相比較于異煙肼治療組，異煙肼聯合PD-L1單抗治療組能夠明顯降低復發期組織荷菌量，減輕病理改變。可見，PD-L1 抗體能促進結核感染的巨噬細胞凋亡，顯著抑制結核病復發；但目前尚不完全清楚結核分枝桿菌潛伏感染、健康接觸者和結核病患者PD-1表達差異不大，但在結核病治療2個月后PD-1表達卻明顯下降的原因，推測可能是由于結核病患者表達PD-1的CD4+T細胞凋亡明顯增多，隨著抗原刺激的去除，凋亡T細胞逐漸從循環中消失，并且需要更長時間才能補充；CD8+T細胞PD-1 水平隨著結核病治療的成功而下降，其下降方式比CD4+T細胞更明顯，但程度低于NK細胞。

二、有效抗結核強化治療可抑制PD-1/PD-L1表達

活動性結核病和分枝桿菌感染導致PD-1/PD-L1在NK細胞上的表達更高，從而導致其效應功能(如細胞因子的產生)受到抑制[36]，在強化治療階段，NK細胞和T細胞顯示出從免疫系統抑制中恢復，發揮其效應功能，結核病明顯好轉。另一項研究也發現同樣的機制，即NK細胞PD-1表達水平與新診斷結核病患者的MTB負荷相關，治療可致PD-1表達下降[51]。PD-1表達可導致產生IFN-γ的NK細胞的凋亡，但不會導致產生IL-4的細胞凋亡。在小鼠體外實驗證實，PD-1通過抑制Th1細胞因子分泌和T細胞發育的T盒轉錄因子、GATA結合蛋白3(GATA-3)和轉錄調節因子Eomesodermin來影響CD4+和CD8+T細胞效應器功能[52]。在結核病治療有效的強化階段，外周血中PD-1/PD-L1 在T細胞和NK細胞的表達下降，這種下降的程度可能取決于每種細胞類型在結核病免疫反應中的作用。與結核分枝桿菌潛伏感染者相比，活動性結核病患者中的PD-L1表達較高，有效的強化抗結核治療可以抑制PD-1/PD-L1信號通路作用的發揮。

三、PD-1/PD-L1、PD-L2抗體可導致MTB再激活

通過對PD-1基因敲除小鼠的研究表明，感染MTB的小鼠的存活率降低[53-55]。可能是由于PD-1敲除動物中異常升高的炎癥反應，伴有過度的中性粒細胞浸潤和壞死，對其生存產生致命影響[56]。有研究發現用一種對PD-1具有高親和力的單克隆抗體以不同劑量阻斷PD-L1和PD-L2的相互作用，反而促進了MTB的生長，而這種生長可以通過應用抗TNF-α抗體而發生逆轉，這證實了過量的TNF-α是PD-1抑制劑引起MTB生長加快的主要驅動因素[57]。PD-1/PD-L1通路抑制劑的劑量依賴性可能在促炎反應和抗炎反應之間起到微妙的平衡作用。這種平衡是不引起病理改變的必要條件。不同的模型也證實，過量的TNF-α會引起炎癥反應；有研究表明，TNF-α抑制斑馬魚巨噬細胞和人肺泡巨噬細胞的MTB生長[58-59]。而在人類細胞中，過量的TNF-α可以增加MTB的生長[60-61]。在活動性結核病患者中，MTB特異性T細胞的TNF-α表達增加與影像學表現嚴重程度具有相關性[62-65]。同樣，使用PD-1阻斷劑治療癌癥患者后發展成為肺結核的病例已有報道，例如，鼻咽癌患者在使用PD-1阻斷治療后死于播散性結核病；Merkel細胞癌患者中檢測MTB特異性免疫反應陽性，該患者發展成為PD-1/PD-L1檢查點阻斷劑相關聯的結核病；晚期非小細胞肺癌患者使用PD-1抑制劑后合并肺結核，患者在接受Pembrolizumab 單抗藥物免疫治療后發展成為肺結核，可能是在免疫功能低下狀態，PD-1抑制劑進一步抑制免疫細胞功能所致[66]；Lee等[67]對霍奇金淋巴瘤患者使用PD-1抑制劑使結核病再激活，表明PD-1在結核病不同階段的穩態作用被打亂。在接受抗PD-1治療后，血液中產生IFN-γ的MTB特異性CD4+T細胞增多，并且幾個月后出現了結核瘤，表明阻斷PD-1通路可促進Th1功能過表達，可能會增加人類結核病的風險或嚴重程度[68]。綜上，阻斷PD-1/PD-L1、PD-L2通路可引起異常升高的炎癥反應，導致MTB再激活。進一步深入探索PD-1/PD-L1通路抑制劑的治療劑量，維持促炎反應和抗炎反應之間的平衡，防止MTB再激活而導致結核病發生惡化進展，將是未來研究的重點內容。

總結和展望

PD-1/PD-L1、PD-L2通路在調控結核病的發生發展和轉歸中起著重要作用。阻斷PD-1/PD-L1、PD-L2通路可能會增強病變部位保護性T細胞作用(包括多功能T細胞)，或可修復結核病患者的宿主免疫反應。過度使用PD-1抑制劑可能會破壞PD-1/PD-L1、PD-L2通路對免疫細胞的調控作用引起免疫病理損傷。未來，隨著對PD-1/PD-L1、PD-L2通路免疫調控作用機制的深入探索，PD-1、PD-L1、PD-L2有可能作為生物標志物來監測結核病患者的宿主免疫力和疫苗保護力，同時監測PD-1及配體的動態變化，可用于評估結核病的治療指標。因此，PD-1/PD-L1、PD-L2通路作為免疫檢測點在結核病中的免疫調控機制以及在結核病免疫治療中的潛在應用價值還值得更深入研究，以期能為開辟結核病診斷和治療新方法提供新思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻劉琪：文獻檢索和文章撰寫；梁建琴：文章指導和審校