基于生物信息學和分子對接技術研究當歸六黃湯治療潰瘍性結腸炎潛在活性成分及分子機制

李靜榮，梁冰宜，彭維，高永堅，林碧珊，曾杉，湯春花，陳錦霞，蘇薇薇

(1.中山大學生命科學學院，廣東省中藥上市后質量與藥效再評價工程技術研究中心，廣東 廣州 510275；2.國藥集團廣東環球制藥有限公司，廣東 佛山 528000)

潰瘍性結腸炎(UC)是一種慢性、復發性結腸炎癥性疾病，其特征是反復發作的腹痛、腹瀉、血便、結腸運動功能障礙和永久性纖維化以及全身癥狀乃至癌變[2]。UC發病率在世界范圍內呈上升趨勢，預計到2025年，全球患病將高達3 000萬人以上。UC發病機制尚不清楚，可能與遺傳因素、超負荷的炎癥、免疫和微生物環境暴露有關。

目前，有關UC的治療主要有抗炎藥物(如氨基水楊酸和糖皮質激素)、鈣調神經磷酸酶抑制劑和生物藥物(TNF-α抗體和α4β7整合素拮抗劑vedolizumab)等。但現有藥物的有效性和安全性仍達不到要求，且生物制品多為靜脈或皮下給藥，無法維持治療的持久性。因此，亟須進一步探討UC的發病機制，為UC的治療提供新的安全、有效、耐受的治療藥物。

當歸六黃湯(DGLHD)源于金代名醫李杲的《蘭室秘藏》，由當歸、地黃、熟地黃、黃芩、黃柏、黃連，黃芪等七味草藥組成，功能主治“滋陰瀉火，固表止汗”。現代藥理表明DGLHD復方[7]或方中單味中藥及其活性成分臨床已經廣泛用于治療與炎癥相關的疾病。例如，黃芩湯已經被廣泛用于潰瘍性結腸炎的治療[8]。干地黃和熟地黃水煎液和提取物均可明顯減少大鼠胃潰瘍的發生率[9]。黃柏中的黃柏堿、巴馬汀、小檗堿均呈現出很好的抗炎作用[10]。

雖然DGLHD復方或者其方中單味藥材治療UC已有較為豐富的臨床經驗，但其治療UC的 “多成分”和“多靶點”的作用模式，尚未完全闡明。本研究采用網絡藥理學方法，通過高通量篩選、網絡可視化和拓撲學分析，闡明藥物、靶點和疾病之間復雜的網絡關系，預測和分析中藥化合物的多靶點作用機制，為DGLHD治療UC提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 當歸六黃湯(DGLHD)活性成分篩選 將“當歸”“地黃”“黃芩”“黃芪”“黃柏”“黃連”輸入中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP，https：//tcmspw.com)，檢索當歸六黃湯主要組成藥材的全部化學成分。同時，采用口服生物利用度(OB)、Caco-2 細胞滲透率和類藥性(DL)三項指標來評價所有成分的成藥性。確定OB≥30%，類藥性DL≥0.1，Caco-2 細胞滲透率≥0.4的預設標準，以篩選DGLHD中可能的生物活性成分進行后續的分析和研究。

1.2 藥物-活性成分-靶點網絡構建 通過TCMSP數據庫尋找當歸大黃湯的藥物活性成分的相應蛋白靶點，并將靶點數據輸入UniProt 數據庫(https：//www.uniprot.org/)，選擇物種為人，進行歸一化和標準化命名，刪除沒有相應基因名稱的目標蛋白。將獲得的藥物活性成分和對應靶點，通過Cytoscape 3.7.2 軟件建立藥物-活性成分-靶標關系圖，并采用軟件中的“Networkanalyze”功能進行網絡拓撲分析，篩選出核心活性成分。

1.3 蛋白質相互作用(PPI)網絡構建及拓撲分析 從DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org/)、Genecards數據庫(https://www.genecards.org/)和DrugBank數據庫(https://www.drugbank.ca/)中檢索與UC相關的基因。將獲得的UC靶基因和當歸大黃湯的活性成分的靶基因通過http://www.bioinformatics.com.cn(生物在線工具)進行Venn圖映射交集處理，得到活性成分靶點-潰瘍性結腸炎的交集靶基因。

通過在線String數據庫，選擇“Multiple proteins”選項，種屬設置為“Homo sapiens”，置信度設為“0.9”，并選擇隱藏散在的節點，獲取交集靶基因的蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡數據。將結果導入Cytoscape軟件中進行可視化分析，通過 “cytohubba”插件，篩選Hub基因。用 “CytoNCA”插件進行拓撲學分析，分別以介數中心性(BC)、接近中心性(CC)、度中心性(degree)、特征向量中心性(EC)、局部平均連通度(LAC)、網絡中心性(NC)等參數的中位值為篩選條件，確定核心靶點。

1.4 交集靶基因的GO功能注釋和KEGG通路富集 通過Metascape在線數據庫(https://metascape.org/)對交集靶點進行基因本體(GO)功能注釋和KEGG通路富集分析。其中，GO富集分析用于通過三維維度來解釋和注釋基因，包括細胞成分(CC)、分子功能(MF)和生物過程(BP)分析；而KEGG通路富集主要進行路徑分析。分析物種為“Human(智人)”，至少包含3個基因，P值小于0.05以下具有統計學顯著意義。結果保留q值(即校正后的P值)小于0.05的富集條目，并按照q值大小進行排序，輸出柱狀圖。

1.5 “藥物成分-核心靶點”分子對接驗證 利用Discovery Studio 2016軟件(中山大學藥學院所購)對DGLHD關鍵活性成分與核心靶點的結合能力進行對接預測。DGLHD關鍵活性成分的Mol2格式文件和蛋白質的“PDB”格式分別從TCMSP平臺和PDB 數據庫(https：//www.rcsb.org/)下載。目標蛋白導入后，將目標蛋白的所有晶體水分子清除，采用軟件中的“prepare protein”模塊對蛋白受體進行去除原配體、水分子及添加氫原子等預處理并尋找活性口袋。對小分子配體進行能量最小化處理，并將小分子配體的所有柔性鍵設置為可旋轉；應用軟件中的CDOCKER功能對核心靶點蛋白受體和活性成分小分子配體進行分子對接，CDOCKER是基于格點和CHARMm力場的分子對接方法。以目標蛋白與配體之間的氫鍵、靜電相互作用、π-π鍵或范德華力等各種鍵能來計算兩者的結合能。結合能表示為負數(-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY)，數值越高表示結合能力越強，結合越穩定。受體蛋白和小分子之間相互作用以2D結構表示。

2 結果

2.1 當歸六黃湯(DGLHD)活性成分的篩選和靶點識別結果 通過 TCMSP數據庫共檢索到395個化學成分，其中當歸125個，熟地黃 76個，黃芩143個，黃芪87個，黃柏140個、黃連48個成分，未檢索到生地黃的化學成分，但通過文獻檢索以及對當歸六黃湯水煎液的高分辨質譜結果分析，獲得7種生地黃化學成分。

根據預設標準進一步從中篩選得到82個潛在有效活性成分，其中當歸4個，黃柏25個，黃連9個，黃芪15個(黃芪多糖和黃芪皂苷來源于文獻報道黃芪的活性成分)，黃芩36個，熟地黃4個(見表1)，其中生地黃6個活性成分來自文獻報道，并未按照預設標準進行篩選。

表1 當歸六黃湯活性成分信息

2.2 當歸六黃湯-活性成分-靶標網絡的構建和分析 82個活性化合物最終輸出407個對應的標準基因名，將結果導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建當歸六黃湯-活性成分-靶基因網絡。該網絡有494個節點，包括7個藥物節點，80個活性成分節點，407個靶基因節點，共1 870條邊(見圖1)。通過分析網絡中活性成分節點和目標基因節點的度值和BC值，獲得前10位活性成分，分別為β-谷甾醇、豆甾醇、油酸、小檗堿、巴馬汀、腺苷、黃芩素、芒柄花黃素、7-O-methylisomucronulatol、地黃素A。

圖1 “DGLHD-活性成分-靶基因”網絡：網絡中的方塊代表DGLHD中的藥物，多邊形代表活性成分，菱形代表靶基因

2.3 PPI網絡構建及核心靶點基因篩選結果 共篩選出UC疾病相關靶基因1 203個(至少存在于兩個數據庫中)，活性成分-潰瘍性結腸炎的交集靶基因132個，這些基因被認為是當歸六黃湯治療UC的潛在作用靶點。

通過在線String網站構建蛋白-蛋白相互作用(PPI)，如圖2所示PPI 網絡中共包含節點112個、522條邊。利用 “cytoHubba”篩選出前6位的核心靶基因，分別為：STAT3、TP53、AKT1、MAPK1、JUN、VEGFA。利用“CytoNCA”對PPI網絡進行拓撲學分析和計算，得到BC、CC、degree、EC、LAC、NC等參數，第一輪篩選degree值>11(兩次中位值)的基因，得到含有40個節點，254條邊的網絡圖，第二輪篩選degree>21，BC>136，CC>0.415，EC>0.098，LAC>5.067，NC>6.33的基因，得到含有12個節點，45條邊的網絡，兩次篩選后最終得到 12個核心靶點基因，同cytoHubba結果一致，同樣包含STAT3、TP53、AKT1、MAPK1、JUN、VEGFA等基因。

圖2 交集靶基因PPI網絡

2.4 GO功能注釋和KEGG 通路富集分析的結果 對132個交集靶點的GO功能注釋分析共得到2 484個條目(q值< 0.05)，包括生物過程2 209個、細胞組成100個、分子功能175個。其中生物過程主要涉及對炎癥的反應、凋亡信號反應、細胞對化學應激、氧化應激的反應等；細胞組成涉及膜筏、細胞外基質、細胞質核周區等；分子功能主要集中于轉錄因子結合、血紅素結合、蛋白激酶結合、受體調節活性等(見圖3A)。

KEGG富集分析主要集中在“腫瘤通路”“糖尿病并發癥中晚期糖基化終產物及其受體(AGE-RAGE)信號通路”“內分泌抵抗”“NF-κB信號通路”“Th17細胞分化”等。KEGG信號通路氣泡圖如圖3B所示。這些發現表明，炎癥和免疫力的調節可能是DGLHD治療UC的主要機制。

A.GO功能分析TOP10，BP-生物過程，CC-細胞組成，MF-分子功能；B.KEGG富集通路氣泡圖

2.5 當歸六黃湯主要活性成分與核心靶點蛋白的分子對接結果 選擇“2.2”項下結果中前10個活性分子(β-谷甾醇MOL000358、豆甾醇MOL000449、小檗堿MOL001454、油酸MOL000675、腺苷MOL001630、漢黃芩素MOL000173、芒柄花黃素MOL000392、7-O-methylisomucronulatol MOL000378、地黃素A MOL003731和黃芩素MOL002714)和“2.3”項下結果中前6個潛在核心靶基因(STAT3、TP53、AKT1、MAPK1、JUN、VEGFA)進行分子對接驗證，并通過Discovery Studio計算配體與受體的結合能。結果顯示當歸六黃湯活性成分與不同核心靶基因活性口袋中一個或多個氨基酸殘基結合，形成氫鍵、π-π鍵或范德華力等，從而形成穩定的對接模式，各化合物與核心靶基因結合能見表2。我們選擇結合能最低的構象(-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY得分最好)對接結果進行2D可視化展示(見圖4)。

A.腺苷和AKT-1(4GV1)；B.腺苷和TP53(6VIP)；C.油酸和JUN(2G01)；D.腺苷和STAT3(1BG1)；E.腺苷和VEGFA(4ZFF)；F.腺苷和MAPK1(6G54)；氫鍵；鹽橋；碳氫鍵；疏水鍵

表2 DGLHD活性化合物與核心靶基因結合能

3 討論

本研究采用網絡藥理學和生物信息學結合方法，構建了DGLHD多成分-多靶點相互作用的可視化網絡，分析DGLHD治療UC的潛在有效活性成分、分子靶點和作用途徑。通過對當歸、地黃、熟地黃、黃芪、黃芩、黃連、黃柏化學成分的分析，確定了當歸六黃湯中主要活性成分：β-谷甾醇、豆甾醇、油酸、小檗堿、巴馬汀、腺苷、黃芩素、芒柄花黃素、7-O-methylisomucronulatol、地黃素A。分子對接結果也證明，他們與大多數核心靶基因可以形成很好的對接模式。

β-谷甾醇和豆甾醇是常見的植物甾醇，它們可以模擬哺乳動物體內的類固醇激素和植物生長激素，在UC治療中的抗炎優勢已被各種體內外實驗證實。油酸(18∶1 n-9)，因為其抗癌、抗氧化等療效被報道用于多種免疫及炎癥疾病的治療。臨床試驗結果表明，小檗堿(900 mg·d-1，連續3個月)顯著降低了結腸組織中的Geboes分級。和mesalamine聯合使用在中國人的潰瘍性結腸炎中耐受性良好，并增強mesalamine在結腸組織中的抗炎作用。巴馬汀，是當歸六黃湯中另一種重要的生物堿，可以通過抑制色氨酸代謝和調節腸道微生物群來改善小鼠結腸炎。

黃芩素是黃芩中含量最高的化合物，進入血液后迅速轉化為黃芩苷等代謝物，黃芩苷已被證實可顯著抑制TLR4誘導的NF-κBp65激活，從而顯著降低炎癥因子的產生，并調節Th17/Treg細胞的平衡。黃芩素作用效果較黃芩苷略弱，這可能是因為黃芩苷的吸收慢，在體內的保留時間更長有關。腺苷可以調節腸道免疫系統，促進乙酸誘導的潰瘍性結腸炎模型中結腸和直腸愈合。芒柄花黃素等系列異黃酮對PPARs表現出非常好的激活作用，而PPARG的激活可以抑制NF-κB通路的激活，從而在UC的治療過程中發揮重要作用。因此，DGLHD中有效活性成分可通過抑制NF-κB和MAPK等炎癥相關通路激活，進而抑制炎癥因子的產生，同時調節腸道菌群，改善腸道脂類代謝，減緩潰瘍性結腸炎的黏膜病變發揮協同作用。

對DGLHD和UC的 132個交集靶基因進行PPI分析，并確定了DGLHD治療UC的6個核心靶基因，即VEGFA、MAPK、STAT3、AKT1、JUN、TP53。

血管生成是UC發病機制的重要組成部分，由炎癥或者異常的免疫反應觸發，影響疾病的進展和嚴重程度[22]。研究表明，VEGFA在潰瘍性結腸炎患者的血清和組織中表達升高，介導炎癥細胞的募集，增強招募以及單核細胞共刺激分子的表達。因此，能夠靶向血管生成的分子有可能協同影響潰瘍性結腸炎的疾病進程[22]。

對UC樣本的微陣列數據集分析發現，MAPK可以作為UC診斷的生物標記物。大多數關于MAPKs對IBD的作用的研究進展主要集中在p38家族和JNK家族[25]。在UC腸道組織中，p38和JNK1/2的磷酸化水平顯著增加。P38抑制劑SB203580可以通過抑制p38MAPK通路的激活，緩解潰瘍性結腸炎的癥狀，并延緩病程進展。在DSS誘導的小鼠急性潰瘍性結腸炎模型，JNK抑制劑SP600125可以使TNF-α、IL-6表達下調，并降低DAI、HI評分。Tofacitinib，一種泛jak抑制劑，在UC的2項Ⅲ期隨機對照試驗中，與安慰劑相比，對UC患者的臨床、內鏡和生活質量結果是有效的[27]。P53在未確診癌癥的嚴重慢性UC患者中存在高頻突變，AKT1是PI3K-AKT信號通路的關鍵介質，參與促炎細胞因子的調控和釋放。因此，上述核心靶點在UC發生和病程的發展中起著非常重要的作用，是DGLHD治療UC的潛在靶點。

對靶基因GO/KEGG的富集分析表明，“腫瘤通路”、“糖尿病并發癥中晚期糖基化終產物及其受體(AGE-RAGE)信號通路”“肝炎B”“內分泌抵抗”“NF-κB信號通路”等可能是DGLHD治療UC的潛在途徑。以人群為基礎的最新證據表明，UC患者發生結腸直腸癌的風險明顯增加，在發病20年后約為7%[30]，在25年時的風險為7%～14%，在35年后高達30%。在IBD患者中發現了RAGE多態性和RAGE水平的升高，參與炎癥與NF-κB的激活及其對氧化應激的反應相關[32]。促炎細胞因子、腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-6與胰島素抵抗增加和糖耐量受損有關[33]。對980位IBD患者研究發現中國的IBD患者的HBV感染患病率高于歐洲、美國和中國的普通人群，特別是在年輕的克羅恩病患者中，應加強HBV疫苗接種和有針對性的覆蓋率。在UC患者腸道中，腸道免疫平衡嚴重受損，效應免疫細胞過度激活，產生高水平的促炎細胞因子，導致結腸組織損傷。核轉錄因子κB(NF-κB)被確定為這種免疫環境中的關鍵調控因子之一。目前多種免疫抑制藥物，如皮質激素和抗TNF-α抗體，均至少部分通過抑制NF-κB活性介導其抗炎作用。

分子對接結果顯示，DGLHD的主要活性成分β-谷甾醇、豆甾醇、油酸、小檗堿、巴馬汀、腺苷、黃芩素、芒柄花黃素、7-O-methylisomucronulatol、地黃素對核心靶基因VEGFA、MAPK、STAT3、AKT1、JUN、TP53具有良好的親和力。其中腺苷可與AKT-1、TP53、STAT3以及MAPK靶點的晶體蛋白通過氫鍵結合等分子作用力發生相互作用；而油酸、β-谷甾醇、豆甾醇以及芒柄花黃素等可以與JUN蛋白晶體和MAPK1蛋白晶體形成穩定的結合模式，提示DGLHD的關鍵活性成分主要通過干預炎癥反應、氧化應激等關鍵信號靶點，在UC中發揮治療作用。

綜上所述，當歸六黃湯在抗炎和免疫調節中發揮協同作用，通過“多成分、多靶點、多途徑”的特點達到治療潰瘍性結腸炎的目的。