中藥顆粒劑中不可接受微生物的溯源分析和風險評估

沈振，徐曉潔，任麗宏，馮丹陽，孟曉麗，丁勃,2

(1.山東省食品藥品檢驗研究院，山東省食品藥品安全檢測工程技術研究中心，山東 濟南 250101；2.山東大學藥學院，山東 濟南 250012)

中藥顆粒劑屬于非無菌藥品，根據《中國藥典》2020年版(四部)通則“1107非無菌藥品微生物限度標準”(通則1107)[1]，產品中微生物負載需控制在標準限值內，并不得檢出大腸埃希菌。中藥顆粒劑因其種類繁多的原輔料，獨特的生產工藝，易受到來自土壤和水環境的微生物污染，因此，現行標準收載的控制菌種類，對于控制產品質量并不全面，應結合產品微生物負載量、污染微生物特性、藥品特性、給藥途徑、用藥人群等方面進行風險評估，將具有潛在危害性的微生物訂入產品的微生物限度內控標準或放行標準。

具有潛在危害的微生物即多種國外藥典已收載并定義為“不可接受微生物”，通常是指那些已知有明顯致病性的，存在足夠的數量，通過產品的給藥途徑可能導致患者不可接受風險的微生物[2]。常見的不可接受微生物包括：腸桿菌科的細菌，如陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、粘質沙雷菌、變形桿菌；非發酵革蘭陰性菌，如伯克霍爾德菌、嗜麥芽窄食單胞菌、假單胞菌、不動桿菌、鞘氨醇單胞菌等；芽孢桿菌屬的細菌，如枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌等[2]。對于非無菌產品，這些不可接受微生物在美國食品藥品監督管理局(FDA)發布的藥品和醫療產品召回案例中，所占的比例高達70%，其中最常見是伯克霍爾德菌屬、假單胞菌屬和腸桿菌科細菌[3]。非無菌藥品生產企業應對分離到的微生物進行風險評估，確定其是否不可接受，建立微生物測試方法，并制定不低于藥典標準的微生物限度放行標準。

本研究源于中藥顆粒劑微生物限度檢查過程中需氧菌總數偏離正常檢驗水平的事件，進而分離、純化和鑒定，確定了主要污染菌。通過生產環節采樣，環境微生物的分離、鑒定和核糖體分型分析，溯源污染微生物，并根據污染菌特征，從方法、管理、設備和人員等方面作風險評估并提出應對措施，為生產企業污染微生物的溯源和控制提供依據和方法。

1 材料

1.1 培養基和試劑 胰酪大豆胨液體培養基(批號：20201212)、胰酪大豆胨瓊脂培養基(批號：20200507)購自青島海博生物技術有限公司；pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(1091711)、沙氏葡萄糖瓊脂培養基(批號：1090021)、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基(批號：1082281)、麥康凱液體培養基(批號：1087341)、麥康凱瓊脂培養基(批號：1081931)購自廣東環凱微生物科技有限公司；革蘭氏染色試劑(批號：6106099)購自北京陸橋技術股份有限公司；聚山梨酯80(批號：20210107)購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器 VITEK2 Compact型全自動微生物分析系統(法國生物梅里埃公司)；RiboPrinter 全自動微生物基因指紋鑒定系統(美國海凈納)；DM1000顯微鏡(德國萊卡公司)；GHP-9270隔水式恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)；IPP250低溫培養箱(德國美墨爾特公司)；ML4002T/02電子天平(梅特勒-托利多公司)。

1.3 樣品 該樣品為顆粒劑，13味中藥，經煎煮濃縮，浸膏噴霧干燥制粒，與輔料混合干法制粒而得，不含藥材原粉。本次檢查樣品為A、B、C共3個批次。

2 方法與結果

2.1 微生物限度檢查 本品為非無菌不含藥材原粉的中藥顆粒劑，照《中國藥典》2020年版(四部)通則1107(四部通則1107)非無菌藥品微生物限度標準，應檢查需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數、大腸埃希菌。

2.2 計數方法適用性試驗 稱取該樣品，以pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋液，制成1∶10和1∶100供試液，采用平皿法(傾注法)，照《中國藥典》2020年版(四部)通則1105“非無菌產品微生物限度檢查法：微生物計數法”(四部通則1105)進行方法適用性試驗，各試驗菌回收比值均在0.5～2.0，符合藥典要求(見表1)。本品采用計數方法適用性試驗確認的方法進行需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的檢查(見表2)。

表1 方法適用性試驗結果

表2 微生物限度檢查結果

2.3 控制菌檢查方法適用性試驗 取1∶10供試液10 mL，接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，照《中國藥典》2020年版(四部)通則1106“非無菌產品微生物限度檢查法：控制菌檢查法1106”(四部通則1106)，開展控制菌檢查方法適用性試驗，在規定的溫度和最短時間下培養，可檢出大腸埃希菌的反應特征，符合藥典要求。本品采用控制菌檢查方法適用性試驗確認的方法進行大腸埃希菌檢查(見表2)。

2.4 樣品中污染微生物的分離和鑒定

2.4.1 微生物分離 平皿法(傾注法)瓊脂平板上的菌落難以挑取，A批次中需氧菌負載大，取1∶10供試液檢查會使菌落計數受到背景雜質和顏色的影響。因此，照“2.2”項下方法制備供試液，取1∶100供試液，采用薄膜過濾法，以pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為沖洗液，沖洗3次，每次100 mL/膜，濾膜貼在胰酪大豆胨瓊脂平板上，33 ℃培養24 h。方法適用性試驗照《中國藥典》2020年版(四部)通則1105進行，各試驗菌回收比值均在0.5～2.0，符合藥典要求(見表1)。

2.4.2 菌株純化 貼有濾膜的胰酪大豆胨瓊脂平板上，共計數單菌落28 cfu，根據菌落特征差異，篩選出3個菌落，編號X1、X2和X3。其中，與X1相同菌落特征共26 cfu，X2和X3各1 cfu。用無菌接種環挑取以上3個菌落，劃線接種于胰酪大豆胨瓊脂培養基上，33 ℃培養18 h。因X1在樣品中的生物負載高，超過了需氧菌總數的限度要求，本文將其作為重點研究對象，開展溯源分析。

2.4.3 菌種鑒定 挑取以上3株菌純培養物，進行革蘭氏染色鏡檢，同時劃線接種于麥康凱瓊脂和紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基上，33 ℃培養48 h。X1、X2和X3均為革蘭陰性桿菌，無芽孢，可在麥康凱瓊脂平板和紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上生長(見表3)。

表3 樣品中污染微生物的形態觀察

采用VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統對3株菌進行生理生化鑒定。X1為陰溝腸桿菌復合菌(Enterobactercloacaecomplex)，X2為嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，X3為魯氏不動桿菌(Acinetbacterlwoffii)。

2.5 污染微生物調查和溯源

2.5.1 生產環節采樣 經生產現場勘查，發現總混間地面PVC地板有裂縫，且存有積水。根據污染微生物的生物學特性，在了解該品種的生產工藝流程的前提下，圍繞總混間，確定了7處采樣點：總混間純化水、總混間地面PVC地板裂縫、總混機內壁、總混間回風口、總混機附近地面、清洗間地面積水處、清洗工具。以含1%聚山梨酯80的胰酪大豆胨液體培養基作為增菌培養基，分別用無菌棉球，每個采樣點采樣2份，置33 ℃培養7 d，每天觀察。

2.5.2 生產環節污染微生物的分離、純化和鑒定 取生長渾濁的培養液，劃線接種在麥康凱瓊脂平板和紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上，33 ℃培養24～48 h，分離菌落特征存在差異的單菌落，編號Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6。分別挑取以上6個單菌落劃線在胰酪大豆胨瓊脂平板上，33 ℃培養18 h。采用VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統對分離得到的純培養物進行生化鑒定(見表4)。

表4 生產環節污染微生物鑒定

2.5.3 同源性分析 挑取VITEK 2 Compact結果一致的X1和Y3兩株菌，用RiboPrinter全自動微生物基因指紋鑒定系統進行核糖體分型分析(見圖1)。

圖1 RiboPrinter全自動微生物基因指紋鑒定結果

結果表明，X1和Y3兩株菌與RiboPrinter系統庫中DUP-14233親緣關系接近，鑒定為陰溝腸桿菌。而將X1的基因指紋圖譜定義為1，Y3的相似度達0.96，結合VITEK 2 Compact，可確認X1和Y3同源。由此說明A批次污染的陰溝腸桿菌主要來源于總混間總混機附近地面。

2.5.4 留樣的再檢驗 抽取與該批次樣品同一生產線，生產時間前后共6批次樣品，進行微生物限度檢查，結果均符合規定，且未檢出陰溝腸桿菌和其他生產環節分離的微生物。說明本次微生物污染的事件未覆蓋整條生產線，也未波及其他批次藥品。

2.5.5 污染微生物風險分析 陰溝腸桿菌分類學上歸腸桿菌目腸桿菌科腸桿菌屬，是腸道菌群中的一種細菌，同時廣泛存在于人和動物的糞便水、泥土、植物中。陰溝腸桿菌是條件致病菌，現已成為醫院感染越來越重要的病原菌，其引起的細菌感染性疾病，常累及多個器官，包括皮膚軟組織感染、泌尿道感染、呼吸道感染以及敗血癥等[4-5]。隨著臨床上青霉素類、頭孢菌素、碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，誘導陰溝腸桿菌能產生超廣譜β-內酰胺酶和Amp C酶，耐藥情況十分嚴重，特別對免疫力低下的人群有極大的危害，給臨床治療帶來了新的挑戰[6-8]，同時也給藥品生產企業的質量控制加大難度。

雖然調查結果顯示本次微生物污染事件未覆蓋整條生產線，也未波及其他批次藥品，但是，根據產品特點、生產工藝判斷，本品容易受到腸桿菌屬污染，總混間回風口檢出的傷口埃希菌，表明該菌屬甚至可以在潔凈廠房空氣中長期存活，進一步印證了控制陰溝腸桿菌的必要性。因此，建議企業將陰溝腸桿菌作為本品的不可接受微生物進行控制，訂入產品的內控標準或放行標準。

3 討論

3.1 產品中分離出的其他污染菌分析 除陰溝腸桿菌外，本次實驗從樣品中分離到的其他2株菌，嗜麥芽窄食單胞菌和魯氏不動桿菌都是醫院感染微生物的重要致病菌來源[9-11]。它們主要分布于土壤和水環境中，易在潮濕環境中生存，均屬于條件致病菌，當機體抵抗力降低時引發感染。因嗜麥芽窄食單胞菌和魯氏不動桿菌，在產品中的負載量低，且未能在生產環節分離到，故暫未將其列為不可接受微生物進行控制。但企業應持續關注，積累檢測數據，做好趨勢分析，一旦發現檢出頻次或數量的異常波動，應立刻啟動風險分析機制，重新評估控制該兩種微生物的必要性。

3.2 生產企業的環境控制 藥品生產企業應嚴格按照《藥品生產管理規范》2010年版[12]的相關要求進行環境監控，開展浮游菌、沉降菌和塵埃粒子的監測，關注生產環境的異常變化，如地面的腐蝕和損毀、高效過濾器的完整性、車間的溫濕度、潔凈區的氣流變化等。生產環節分離到的微生物從分類學上屬于腸桿菌科，說明現有生產環境已被腸桿菌科細菌污染，且適宜于腸桿菌科細菌的生長和繁殖。造成這一微生物污染風險點的可能原因包括：①人員、原料、設備進場未能嚴格執行相關SOP，造成腸桿菌科細菌由非潔凈區向潔凈區的轉移；②生產后清場不徹底，存在積水，為腸桿菌科細菌的生長和繁殖提供適宜條件；③清場時使用的消毒劑不能徹底地消殺腸桿菌科細菌，甚至引起了該類細菌的抗性。由此，應加強對生產人員和現場QA的培訓，包括生物安全、微生物基礎理論、生產工藝、設備操作、進出消毒等內容；縮短環境監控周期，增加對高風險區域表面微生物的采集頻次；更換或添加不同類型的消毒劑用于人員進出消毒、設備清場清潔和環境的消殺。

3.3 不可接受微生物的風險管理 《美國藥典》(USP42)<1115>指出，針對每一種產品都列出不可接受微生物的清單是不現實的。哪些微生物是“不可接受的”取決于藥品屬性、給藥途徑、用藥人群等。生產企業有責任判斷藥品中的微生物是否為不可接受。根據ICH Q9[13]和PDA TR67[2]的風險管理流程，不可接受微生物的風險評估包括風險識別和風險分析與評價兩個環節。風險識別，即微生物的鑒定和溯源。風險分析與評價，即從給藥途徑與使用方法、用藥人群和藥品特性三個方面探討污染微生物的風險，同時確定產生危害的原因是污染微生物的致病性，還是生物負載量[14]。本次分離到的陰溝腸桿菌，為條件致病菌，生物負載量較高，且藥物的使用人群包括老人、兒童和免疫力較低者，屬于中等風險水平，故將其列為為本品中等風險的不可接受微生物。而嗜麥芽窄食單胞菌和魯氏不動桿菌雖是條件致病菌，但生物負載量低，環境中也未檢出，可評估為低風險不可接受微生物，暫不進行控制。通過風險評估，生產企業建立不可接受微生物的風險控制方法，設定內控標準，當日常檢驗結果異常時，應立即啟動OOS調查，快速溯源并消除污染源。

3.4 總結 微生物污染風險控制是藥品生產企業質量評估的關鍵環節，也是飛行檢查的重要關注點。根據2014～2018年原國家食品藥品監督管理總局發布的藥品飛行檢查數據，在所有缺陷項中，微生物相關缺陷的占比高達36%，且多為高風險缺陷，而涉及中藥生產企業的微生物缺陷占到63%[15]。微生物缺陷分布主要集中在方法、管理、設備、原輔料和人員等方面，這些高風險行為則是引發上市產品微生物污染的主要原因。因此，藥品微生物污染風險評價與控制應該得到企業的足夠重視，特別是對于標準要求之外的潛在污染微生物，要進行充分的研判，必要時增加控制項目，收緊限度要求，盡可能消除其對產品質量的影響。微生物的控制不能僅僅依賴于終產品檢驗，必須從生產過程控制著手[16-17]，持續的微生物質量控制應該貫穿于產品的整個生命周期。企業應培養具有較高微生物鑒定和溯源能力的專業技術人員隊伍，建立多元化的微生物鑒定溯源平臺，構建環境和產品污染菌庫[18],提升微生物污染控制的綜合能力。