基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃芪治療慢性腎臟病的分子機制*

張寶霞，陳小飛，陳文佳，丁海波，饒克瑯，章小穩(wěn)

1.新余市中醫(yī)院，江西 新余 338000； 2.深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 518133

隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展，人們的生活水平日益提高，居民日常作息也發(fā)生改變，主要疾病由營養(yǎng)不良轉(zhuǎn)變?yōu)楦黝惵约膊。页誓贻p化趨勢[1]。既往研究顯示，我國成年人慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)的發(fā)病率已超過10%，由此可推算，我國CKD患者已超1億[2]。CKD的臨床表現(xiàn)隱匿，許多患者沒有癥狀(無癥狀性血尿和/或蛋白尿)或僅有非特異性癥狀(腰部酸脹感)，導(dǎo)致其診斷較為困難。晚期CKD除了發(fā)展為終末期腎功能衰竭需長期透析治療外，還影響多個系統(tǒng)、器官的功能，包括但不限于眼底病變，凝血功能異常，代謝異常，消化、神經(jīng)及血液等系統(tǒng)并發(fā)癥，水、電解質(zhì)代謝紊亂及酸堿平衡失調(diào)[3]。CKD發(fā)展至終末期腎臟病后，其治療費成倍增加且無完全治愈方法，是世界各國共有的公共衛(wèi)生問題[4]。

黃芪為豆科植物膜莢黃芪或蒙古黃芪的根，被列為本草上品，有“補藥之長”之稱，甘溫，入脾、肺經(jīng)，具有“逐五臟間惡血”“通調(diào)血脈、流行經(jīng)絡(luò)”等功效[5]。現(xiàn)代藥理研究也證明，黃芪具有改善心血管、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老等藥理作用[6]。劉新祥教授、遠方教授、呂冬梅教授等都認為，黃芪在腎臟病的治療中起著至關(guān)重要的作用，且遣方用藥中多以黃芪為主[7-9]。然而，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對黃芪治療慢性腎臟病仍然存在理解不清和認識模糊的現(xiàn)象，為了有效地將“黃芪”和“慢性腎臟病”融合起來，本文基于系統(tǒng)藥理學(xué)研究，整合黃芪活性成分、潛在靶標、相關(guān)疾病以及藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)，構(gòu)建系統(tǒng)水平上的藥物-成分-疾病靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)，從整體水平闡明中藥靶標及其作用機理。

1 資料與方法

1.1 黃芪活性成分及其對應(yīng)靶點的篩選在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)[10]中檢索黃芪中的化合物，并按照藥代動力學(xué)參數(shù)中的2個屬性值——口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%及類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18進行活性成分初步篩選，獲得有效活性成分化合物及其相關(guān)作用靶點。將獲得的蛋白質(zhì)靶點導(dǎo)入UniProt數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)對其名稱進行校正；若UniProt中未檢索到相關(guān)名稱，則在DrugBank Online數(shù)據(jù)庫(https：//go.drugbank.com/)中檢索其別稱，再利用UniProt數(shù)據(jù)庫對其別稱進行校正。校正結(jié)束后舍去重復(fù)靶點及無對應(yīng)靶點的蛋白質(zhì)。

1.2 CKD靶點預(yù)測及黃芪治療CKD的潛在靶點搜集在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)檢索疾病關(guān)鍵詞“chronic kidney disease”，獲得CKD相關(guān)疾病靶點，并在DrugBank Online數(shù)據(jù)庫補充治療慢性腎臟病的西藥作用靶點。將黃芪活性成分相關(guān)靶點與CKD相關(guān)靶點導(dǎo)入Venny 2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，取交集靶點，即為黃芪治療CKD的潛在靶點，并繪制韋恩圖。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將黃芪治療CKD的潛在靶點導(dǎo)入String(https：//cn.string-db.org/)在線數(shù)據(jù)庫繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，選擇“Multiple proteins”并設(shè)定最小互相作用閾值>0.9，其余設(shè)置均為默認設(shè)置，隱藏游離節(jié)點，運行得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果以TSV格式文件導(dǎo)出。將結(jié)果導(dǎo)入CytoScape 3.9.1軟件進行拓撲分析，計算度(degree)值，并以其中位數(shù)為界限篩選出黃芪治療CKD的核心靶點。

1.4 核心靶點的基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析利用Metascape數(shù)據(jù)庫(https：//metascape.org/gp/index.html)[11]對黃芪治療CKD的核心靶點進行GO功能富集分析和京都基因與基因組百科全書信號通路富集分析，GO功能富集分析涉及生物過程(biological process，BP)、細胞組分(cellular component，CC)及分子功能(molecular function，MF)。

1.5 “黃芪-活性成分-潛在靶點-信號通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖利用Excel構(gòu)建“黃芪-活性成分”“活性成分-潛在靶點”“疾病-潛在靶點”“潛在靶點-通路”文件，并將文件導(dǎo)入CytoScape 3.9.1軟件，構(gòu)建“黃芪-活性成分-潛在靶點-信號通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 黃芪活性成分及其相關(guān)靶點基于TCMSP共搜集到黃芪有效成分20個及相關(guān)靶點204個，對應(yīng)靶點數(shù)目排名前10位的有效成分為槲皮素(quercetin，148個靶點)、山柰酚(kaempferol，62個靶點)、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇(7-O-methylisomucronulatol，45個靶點)、刺芒柄花素(formononetin，39個靶點)、異鼠李素(isorhamnetin，37個靶點)、華良姜素(jaranol，24個靶點)、3，9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚(3，9-di-O-methylnissolin，23個靶點)、毛蕊異黃酮(calycosin，23個靶點)、白樺脂酸(mairin，13個靶點)、(6aR，11aR)-9，10-dimethoxy-6a，11a-dihydro-6H-benzofurano[3，2-c]chromen-3-ol(23個靶點)等，以上所有成分均經(jīng)化源網(wǎng)(https：//www.chemsrc.com/)檢索出中文名稱。利用UniProt數(shù)據(jù)庫檢索出204個靶標對應(yīng)的200個官方基因名(其中3個蛋白質(zhì)在人類物種中缺乏，另一個蛋白在UniProt中未檢索出官方名，故舍去4個靶標)。見表1。

表1 黃芪有效成分相關(guān)信息表

2.2 CKD靶點及黃芪治療CKD的潛在靶點檢索數(shù)據(jù)庫得出CKD對應(yīng)靶點13 955個，設(shè)定score值>20%，則篩選出對應(yīng)靶點1 266個，將黃芪活性成分相關(guān)靶點與CKD對應(yīng)靶點導(dǎo)入Venny2.1.0，得到黃芪治療CKD的潛在靶點104個，涉及基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metallopeptidase 2，MMP2)、凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-X(BCL2-like 1，BCL2L1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(caspase 8，CASP8)、CASP9、組織蛋白酶D(cathepsin D，CTSD)、小窩蛋白1(caveolin 1，CAV1)、CD40 配體(CD40 ligand，CD40LG)、腫瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)、Ⅲ型膠原蛋白α1(collagen type Ⅲ alpha 1，COL3A1)、C 反應(yīng)性蛋白(C-reactive protein，CRP)等。見圖1。

圖1 黃芪活性成分相關(guān)靶點與CKD相關(guān)靶點韋恩圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)將104個黃芪治療CKD的潛在靶點導(dǎo)入String在線數(shù)據(jù)庫，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并利用CytoScape3.9.1軟件進行分析。該PPI 網(wǎng)絡(luò)圖共有103個節(jié)點及2 067條邊，degree平均值為40.14，以degree值中位數(shù)為界限篩選出53個核心作用靶點，其中degree值排名前10位的靶點分別為白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6，degree值88)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF，degree值87)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase 1，AKT1，degree值84)、IL-1β(degree值83)、TP53(degree值79)、MMP9(degree值77)、CASP3(degree值76)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase，PTGS2，degree值73)、JUN(degree值73)、IL-8(又稱CXCL8，degree值72)，提示這些靶點可能是黃芪治療慢性腎臟病的核心靶點。見圖2。

圖2 黃芪治療CKD潛在靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析KEGG信號通路富集分析獲得32條信號通路，主要涉及癌癥通路(pathways in cancer)、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化(lipids and atherosclerosis)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、前列腺癌(prostate cancer)、化學(xué)致癌-活性氧途徑(chemical carcinogenesis-reactive oxygen species)、化學(xué)致癌-受體激活途徑(chemical carcinogenesis-receptor activation)、瘧疾(malaria)、小細胞肺癌(small cell lung cancer)、低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)信號通路(HIF-1 signaling pathway)、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)(transcriptional misregulation in cancer)等。根據(jù)校正后P值進行排序，選擇前20條通路繪制柱狀圖。見圖3。GO功能富集分析得到104個生物過程(biological process，BP)，104個細胞組分(cellular component，CC)及104個分子功能(molecular function，MF)，其中BP主要涉及對無機物的反應(yīng)(response to inorganic substance)、對脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、細胞遷移的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of cell migration)、細胞死亡的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of cell death)、腺體發(fā)育(gland development)、細胞黏附的調(diào)節(jié)(regulation of cell adhesion)等；CC主要涉及膜筏(membrane raft)、細胞外基質(zhì)(extracellular matrix)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物(transcription regulator complex)、囊泡腔(vesicle lumen)、絲氨酸型肽酶復(fù)合物(serine-type peptidase complex)、質(zhì)膜外側(cè)(external side of plasma membrane)、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物(plasma membrane protein complex)等；MF主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(DNA-binding transcription factor binding)、細胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、激酶結(jié)合(kinase binding)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合(protein domain specific binding)、蛋白酶結(jié)合(protease binding)、蛋白質(zhì)同二聚化活性(protein homodimerization activity)、磷酸酶結(jié)合(phosphatase binding)、絲氨酸水解酶活性(serine hydrolase activity)、轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)子結(jié)合(transcriptional coregulator binding)等。將結(jié)果分別按照P值排序，選擇前20條結(jié)果繪制柱狀圖。見圖4、圖5、圖6。

圖3 KEGG富集分析結(jié)果

圖4 GO富集分析結(jié)果(生物過程)

圖5 GO富集分析結(jié)果(細胞組分)

2.5 “黃芪-活性成分-潛在靶點-信號通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖將黃芪、黃芪活性成分、疾病、潛在靶點、信號通路導(dǎo)入CytoScape3.9.1軟件，構(gòu)建“黃芪-活性成分-潛在靶點-信號通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。圖中黃色圓形代表黃芪，綠色三角代表黃芪活性成分，藍色四邊形代表潛在靶點，紅色V型代表信號通路，紫色六邊形代表疾病。見圖7。

圖6 GO富集分析結(jié)果(分子功能)

圖7 “黃芪-活性成分-潛在靶點-信號通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

既往文獻總結(jié)黃芪的化學(xué)成分包括多糖類、皂苷類、黃酮類及氨基酸、微量元素、甾醇類等物質(zhì)，其中黃酮類主要有效活性成分多達30余種，主要有槲皮素、異鼠李素、毛蕊異黃酮等，具有發(fā)揮清除自由基、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抑制血管內(nèi)皮單層通透性增加等作用[12]。張薔等認為黃芪通過黃酮類成分發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗損傷、抗突變、抗腫瘤、抑制動脈粥樣硬化等活性[13]。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測到黃芪有效成分中對應(yīng)靶標數(shù)目前10位的化合物分別為槲皮素(黃酮類)、山柰酚(黃酮醇類)、刺芒柄花素(異黃酮類)、異鼠李素(黃酮類)、華良姜素(黃酮醇類)、毛蕊異黃酮(黃酮類)、白樺脂酸(三萜類)等。綜上可知，黃芪治療慢性腎臟病的主要有效活性成分可能為黃酮類。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，IL-6、TNF、AKT1、IL-1β、TP53、MMP9、CASP3、PTGS2、JUN、CXCL8可能是黃芪治療慢性腎臟病的核心靶點。IL-6是在免疫、組織再生和新陳代謝中具有多種生物學(xué)功能的細胞因子，與IL-6受體結(jié)合后，進一步與信號亞基IL-6信號傳導(dǎo)因子/糖蛋白130(IL-6 signal transducer/glycoprotein 130，IL-6ST/gp130)結(jié)合以觸發(fā)細胞內(nèi)IL-6信號通路。與膜結(jié)合的重組人IL-6受體(recombinant human IL-6 receptor，IL-6R)和 IL-6ST的相互作用刺激“經(jīng)典信號”，通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothlial growth factor，VEGF)直接或間接導(dǎo)致血管生成活性增加；另外，IL-6可充當(dāng)肌因子，在組織損傷期間起保護作用，是維持組織再生所必需的；也可通過激活I(lǐng)L-6ST-YAP-NOTCH通路誘導(dǎo)上皮細胞再生[14]。TNF主要由巨噬細胞分泌，可誘導(dǎo)某些腫瘤細胞系細胞死亡，還是通過直接作用或刺激IL-1分泌而引起發(fā)熱的強熱原，并與惡病質(zhì)的誘導(dǎo)有關(guān)，在某些條件下可刺激細胞增殖并誘導(dǎo)細胞分化[15]。AKT1是胞內(nèi)磷脂酰肌醇3激酶(phosphoInositide-3 kinase，PI3K)下游的直接靶蛋白，可參與調(diào)節(jié)細胞增殖和代謝，促進纖維化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成[16]。此外AKT1激活可促進核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)激活，啟動下游炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生TNF-α、IL-6等炎性因子，加重細胞的纖維化[17]。進一步的研究表明，AKT是轉(zhuǎn)化生長因子e-1(transforming growth factor e-1，TGFe-1)介導(dǎo)的生物過程的重要調(diào)節(jié)因子，可刺激Smad、mTOR等腎臟細胞調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)足細胞、系膜細胞、腎小管上皮細胞等多種細胞功能[18]。關(guān)鍵靶基因中IL-6、IL-1β均是經(jīng)典的炎癥因子，PTGS2調(diào)控炎癥應(yīng)答，是炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)，通過引導(dǎo)中性粒細胞到達感染部位起到趨化因子的作用，兩者在炎癥反應(yīng)中具有特殊作用[19]。CXCL8與CXC趨化因子受體結(jié)合可以促進中性粒細胞浸潤并誘發(fā)組織炎癥[20]，研究證實，阻斷CXC趨化因子受體傳導(dǎo)可以減輕小鼠的腎臟炎癥和腎纖維化[21]。TNF、TP53與腫瘤密切相關(guān)，MMP9、CASP3參與細胞凋亡。而慢性腎臟病的發(fā)病及進展均與腎臟纖維化有關(guān)[22]，近年來，圍繞腎纖維化發(fā)生的機制研究發(fā)現(xiàn)其與炎癥、巨噬細胞轉(zhuǎn)分化和促纖維化通路等的異常活化有關(guān)[23]，且慢性腎臟病終末期死亡原因中惡性腫瘤的死亡原因超過10%，排所有死亡原因的第3位[24]，與本次研究所涉及的靶點不謀而合。有研究同樣也發(fā)現(xiàn)，黃芪可以從多個層面調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，直接影響腫瘤細胞的增殖和凋亡，調(diào)節(jié)腫瘤細胞周期生長，也可以通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)間接改變腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤細胞的生長和遷移[25]。

GO生物過程分析可得，黃芪有效成分可通過作用于細胞的膜筏、細胞外基質(zhì)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、囊泡腔、質(zhì)膜外側(cè)、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、細胞質(zhì)核周區(qū)、髓鞘、軸突等部位，參與DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合、激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、磷酸酶結(jié)合等分子功能的調(diào)節(jié)，調(diào)控癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、無機物及脂多糖的反應(yīng)、凋亡信號通路、細胞遷徙及死亡的正向調(diào)節(jié)、上皮細胞及平滑肌細胞增殖、炎癥反應(yīng)等治療慢性腎臟病。

本文預(yù)測了黃芪治療慢性腎臟病的主要靶點，并對主要靶點進行KEGG及GO分析，結(jié)果表明，黃芪可能通過抗感染、抑制纖維化、調(diào)控細胞凋亡等信號通路治療慢性腎臟病。