胚胎停育肝郁證患者血管生成因子表達特征研究*

黃琰鈺，林雪娟，陳杭，蘭萌，吳冬梅，劉文杰，劉艷紅

1.福建中醫藥大學，福建 福州 350122； 2.福建省中醫健康狀態辨識重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建省2011中醫健康管理協同創新中心，福建 福州 350122； 4.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建 福州 350122； 5.福建中醫藥大學附屬晉江中醫院，福建 晉江 362200

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年7月至2020年12月就診于福建中醫藥大學附屬晉江中醫院門診及住院的胚胎停育患者45例，年齡(30.82±5.05)歲。另選擇同期自愿要求終止妊娠的正常早孕女性15例為對照組，年齡(27.86±4.21)歲。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫診斷標準參考《婦產科學》[4]胚胎停育的診斷標準及《早期妊娠稽留流產專家共識》[5]的診斷標準。

1.2.2 中醫證素診斷標準依據《證素辨證學》[6]，根據采集的四診信息在診斷中的權重，以加權閾值法確定證素。將各項四診信息對某證素的貢獻度進行累積相加，所得的貢獻度之和，作為該證素的積分。積分<70分為0級，說明基本無病理變化；積分 70～100分為1級，說明存在輕度病理變化；積分101～150分為2級，說明存在中度病理變化；積分≥150分為3級，說明存在嚴重病理變化。

1.3 病例納入標準

1.3.1 胚胎停育組納入標準妊娠7～12周內并符合胚胎停育西醫診斷標準；自愿加入并簽署知情同意書后可配合完成四診問卷者。

1.2.1 細胞培養 NCI-N87細胞株常規在含10%胎牛血清的0.1%DMSO培養基，于37℃、5%CO2的孵箱中培養，用0.25%胰蛋白酶消化，在顯微鏡下觀察細胞形態，待細胞長滿至80%融合度時，以1：3比例進行傳代。使活細胞數＞95%，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.3.2 對照組納入標準妊娠7～12周內早期妊娠超聲診斷有胎心者；自愿加入并簽署知情同意書，可配合完成調查問卷者。

1.4 病例排除標準①因跌撲損傷、染色體異常致胚胎停育者；②生化妊娠、試管嬰兒失敗后流產患者；③患有陰道炎、生殖道感染者；④合并高血壓、免疫系統疾病、心腦血管病、糖尿病、血液系統疾病、腫瘤等重大器質性疾病或嚴重精神疾病者。

1.5 四診信息采集及證素提取

1.5.1 四診信息由2名經過專業培訓且考核合格的中醫科研人員按照標準，規范地采集研究對象的四診信息。

1.5.2 證素數據提取使用“中醫健康狀態辨識系統”[7]將采集到的四診信息錄入系統，后臺對四診信息進行處理并輸出相關證素及其積分。

1.6 試驗方法

1.6.1 辨證分型將證素、氣滯積分≥100分的組納入肝郁證，證素、氣滯積分<100分納入非肝郁證。

1.6.2 組織取材所有研究對象行清宮術后，立即在無菌狀態下取子宮蛻膜組織，用無菌生理鹽水清洗，直到組織表面無明顯血跡，用無菌剪刀將子宮蛻膜組織分別剪成兩部分，迅速放入無RNA酶的EP管中，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存。

1.6.3 儀器和設備電子天平(上海梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；微型漩渦混合儀XW-80A(上海滬西分析儀器廠有限公司)；迷你離心機LX-200(海門其林貝爾儀器制造有限公司)；微型冷凍離心機5424R(德國Eppendorf公司)；超低溫冰箱(美國Thermo Scinetific公司)；移液器(德國EPPENDORF)；高通量自動研磨儀Tissuelyser II(德國Qiagen公司)；超微量紫外分光光度計Nandrop2000(美國Thermo Scientific公司)；基因擴增儀Veriti、熒光定量PCR儀 Quant Studio6 Flex(美國Applied Biosystems 公司)；化學發光凝膠成像儀 ChemiDox TM XRS+(美國Bio-Rad公司)。

1.6.4 試劑及耗材體積分數95%乙醇、無水乙醇(西隴化工股份有限公司)；氯化鈉(上海滬試實驗室器材股份有限公司)；Gapdh一抗、兔抗、Anti-pan-VEGF 一抗(北京Proteintech公司)；超敏ECL化學發光試劑盒(萬類生物科技)；半干轉膜液、濕轉轉膜液、電泳液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；RNA提取試劑、SYBR Green RT-PCR 試劑盒、逆轉錄試劑盒(日本TAKARA公司)。

1.6.5 實時熒光定量PCR檢測mRNA表達

1.6.5.1 RNA逆轉錄使用超微量紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度，并根據RNA的濃度計算逆轉錄時所需的RNA量。在1.0 %非變性瓊脂糖凝膠電泳上分析RNA完整性，其純度完整性達到要求后，進行RNA逆轉錄。在冰上配制RT反應液分別裝于反應管中，再加入滅菌蒸餾水，使得總體積為18 μL，42 ℃，2 min后放置冰上。反應管中直接添加入5×qRT SuperMixⅡ 6 μL，50 ℃，15 min；85 ℃，5 s，得到的cDNA放置-20 ℃冰箱中備用。

1.6.5.2 引物設計選用人的GAPDH為內參基因，采用Primer Premier 5.0設計目標基因和內參基因的特異性引物，用Oligo 6.0檢驗其特異性。引物由上海博尚生物工程技術有限公司合成。見表1。

表1 引物序列

1.6.5.3 qPCR反應在冰上配制反應液，2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，加滅菌蒸餾水至20 μL。吸取11 μL到每個反應管中，再添加cDNA溶液1 μL。每個反應重復3次，設計實驗組和陰性對照，配制反應液時先配制總的反應液，再各個分裝。反應步驟為95 ℃×30 s；循環反應：95 ℃×5 s，60 ℃×30 s，40個循環；Melt Curve：95 ℃×15 s，60 ℃×60 s。最后得到樣本擴增曲線、溶解曲線和ct值，計算基因表達。

1.6.6 蛋白表達量檢測

1.6.6.1 BCA法檢測蛋白濃度按照BCA試劑盒說明書的操作步驟檢測蛋白濃度，可以得到標準曲線算出線性關系，再根據已知的樣本體積算出樣品的蛋白濃度。用含有PMSF的RIPA稀釋樣品，使各樣本濃度一致為5 g·L-1。

1.6.6.2 Western Blot法進行SDS-PAGE凝膠配制后，將蛋白樣品和上樣緩沖液混勻，100 ℃或沸水加熱5 min，以充分變性蛋白，后裝入電泳槽內，濕法轉印蛋白至PVDF膜上，濕轉轉膜條件：恒流 400 mA，電壓75 V，轉膜時間2 h。分別加入VEGF、C型凝集素家族14A(C-type lectin clomain containing 14A，CLEC14A)、CD81、GAPDH一抗(濃度比分別為11 000、11 000、12 000、15 000)。用TBST稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗(濃度14 000)37 ℃在搖床上緩慢搖動孵育1 h。化學發光凝膠成像儀掃描結果后進行灰度分析，應用Image lab軟件分析此條帶的灰度值，并將其與之相對應的內參條帶進行比較。

2 結果

2.1 兩組患者子宮蛻膜組織中CLEC14A、CD81、HIF-1α及VEGF mRNA表達水平比較兩組患者子宮蛻膜組織中均有VEGF、CLEC14A、CD81、HIF-1α mRNA的表達。與對照組比較，胚胎停育組子宮蛻膜組織中VEGF mRNA表達下降，差異具有統計學意義(P<0.05)，CLEC14A、CD81、HIF-1α mRNA表達水平有改善，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組患者子宮蛻膜組織中CLEC14A、CD81、VEGF、HIF-1α mRNA表達水平比較

2.2 各證型子宮蛻膜組織中 CLEC14A、CD81、VEGF、HIF-1α mRNA表達水平比較與肝郁證比較，非肝郁證子宮蛻膜組織中VEGF mRNA表達升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，CD81、CLEC14A、HIF-1α mRNA表達水平降低，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各證型子宮蛻膜組織中CLEC14A、CD81、VEGF、HIF-1α mRNA表達水平比較

2.3 兩組患者子宮蛻膜組織中HIF-1α、CD81、CLEC14A和VEGF蛋白表達水平比較與對照組比較，胚胎停育組子宮蛻膜組織中CLEC14A、VEGF蛋白表達水平下降，差異具有統計學意義(P<0.05)，CD81、HIF-1α蛋白表達水平無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 兩組患者子宮蛻膜組織中HIF-1α、CD81、CLEC14A和VEGF蛋白表達水平比較

2.4 各證型子宮蛻膜組織中HIF-1α、CD81、CLEC14A和VEGF蛋白表達水平比較與肝郁證比較，非肝郁證子宮蛻膜組織中CD81蛋白表達水平升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，VEGF、CLEC14A、HIF-1α蛋白表達水平變化不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)，見表5。

表5 各證型子宮蛻膜組織中HIF-1α、CD81、CLEC14A和VEGF蛋白表達水平比較

3 討論

胚胎停育患者子宮蛻膜組織中VEGF mRNA和蛋白表達水平均低于對照組，說明妊娠過程中胚胎的血管生成異常可能是胚胎停育的重要發病機制，與國內外研究基本一致。良好的胎盤血管發育是胎盤與母體物質交換功能的基礎，只有胎盤生成強大的血管網才能確保胚胎的營養、血液、氧氣供給[8]。付昱等[9]研究發現，胚胎停育與妊娠早期的胎盤血管結構異常、血管生成數量不足等密切相關。胚胎血管內皮細胞的遷移、侵襲、增殖功能受到VEGF表達水平的調控，血管生成的相關活性因子表達降低，絨毛的滋養細胞淺植入，導致胚胎蛻膜及絨毛的血管生成減少，胎盤血管網絡構建不完善，直接影響母胎間物質交換及血液、氧氣供應，最終導致胚胎停育[10]。國外學者[11]對母體螺旋動脈重塑及滋養細胞侵入的過程進行研究，發現HIF-1α、VEGF在調節胚胎血管生成中發揮重要作用。黃凌佳等[12]研究發現，胚胎中HIF-1α/VEGF信號通路的異常表達與不良妊娠有關，胎盤血管的發育可能是通過激活HIF-1α信號通路及其靶基因VEGF來實現。值得注意的是，VEGF與早期妊娠的維系和胚胎血管的生成密切相關，在內膜基質的細胞產生蛻膜化中有重要意義[13]。Santi等[14]通過實驗研究發現，VEGF及其特異性受體在胚胎著床點附近的基質細胞中呈高表達狀態。此外，在早期妊娠婦女的子宮蛻膜組織中同樣被檢測到VEGF及相關受體的高表達。Rabbani等[15]使用原位雜交技術檢測VEGF mRNA表達，發現其主要高表達位于胚胎著床位點附近的動脈壁、母胎界面及細胞滋養層等腺上皮中，并在早期、中期、晚期妊娠中均能找到[16]，說明VEGF在早期妊娠過程中參與了重要角色[17]。早期妊娠失敗與VEGF低表達密切相關，其低表達可能是引起胚胎停育的主要因素[18]。

本研究結果顯示，各組均存在HIF-1α mRNA及蛋白表達，但是對照組較胚胎停育組明顯降低，雖然差異無統計學意義，但蛋白條帶及表達量趨勢一致。HIF-1α信號通路是特異性的低氧反應通路，根據機體氧含量來調節蛋白活性。HIF-1α在人體正常有氧條件下容易降解，其表達量相對穩定，但在低氧環境下降解快速減少，可迅速累積、聚合，使活性增強，并啟動下游靶基因轉錄[19]。研究表明[20]，HIF-1α可以通過誘導血管生成而發揮作用。正常妊娠也存在低氧狀態，低氧啟動HIF-1α，上調VEGF表達，胚胎血管網絡逐漸形成減輕胚胎缺氧狀態，維系正常妊娠[21]。本研究結果提示，胚胎停育患者子宮蛻膜組織中HIF-1α表達較對照組更高，但VEGF表達卻下降，HIF-1α與VEGF呈負相關性，說明胚胎停育組患者VEGF的低表達可引起胚胎停育，是研究VEGF與胚胎停育關系的重要依據。由此可以預測，胚胎停育患者中存在更嚴重的低氧狀態，血管生成的動態平衡被打破，HIF-1α表達異常升高，負反饋抑制了VEGF等血管生成因子的表達，促進血管生成的因子減少，抑制血管生成的因子增加，導致血管生成大量減少，胚胎缺乏足夠的氧氣和營養物質供養，最終發生胚胎停育。楊躍濤[22]認為，氣郁證患者靜脈血氧含量降低，二氧化碳含量升高，使機體處于二氧化碳潴留及缺氧狀態，體內氧代謝狀況差，這與本研究肝郁證引起低氧啟動HIF-1α/VEGF信號通路表達導致胚胎缺血缺氧的理論存在相似性。

本研究中，胚胎停育組子宮蛻膜組織中CLEC14A蛋白及mRNA表達水平低于對照組，但mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)，可見高表達的CLEC14A可以促進血管的生成，與VEGF的作用可能相似，可將其均歸為促進血管生成的因子。CLEC14A和VEGF都表達于子宮蛻膜組織中，兩者都參與妊娠早期的血管新生，間接通過調控VEGF信號通路來實現血管的生成。

本研究結果顯示，僅有肝郁證子宮蛻膜組織中CD81蛋白表達均低于非肝郁證，差異具有統計學意義(P<0.05)，其他組之間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，提示CD81可能與VEGF的表達存在負性相關，而胚胎停育組與對照組子宮脫膜組織中CD81 mRNA和蛋白表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，但其負相關的趨勢與國內外學者的研究基本一致。CD81的高表達表現為抑制血管新生或增加無效血管的生成，使滋養細胞的侵襲能力在一定程度上降低，引起新生血管腔直徑變小，血液供應減少，從而發展為胚胎停育。因此，CD81也可作為評估胚胎停育發生的指標。研究表明[23]，CD81表達升高，會抑制滋養細胞的侵襲能力來影響子宮螺旋動脈重塑，使胎盤著床位置較淺。Shen等[24]研究發現，CD81在妊娠最早期開始出現，隨妊娠時間增長，表達量遞減，而使同時期不良妊娠患者血液中仍有高表達量的CD81。CD81作為四次跨膜蛋白，表達有一定的不穩定性，其磷酸化過程或半衰期不同時間段檢測會存在一定的差異。因此，對CD81的分組檢測存在一定的難度和不穩定性。

本研究中，肝郁證胚胎停育的子宮蛻膜組織中VEGF mRNA的表達水平低于非肝郁證，說明肝郁在血管生成中扮演著重要角色。有學者[25]研究抑郁組和正常對照組的VEGF、HIF-1α表達，發現抑郁組及正常對照組存在差異，抑郁組患者血清中HIF-1α表達顯著增加。HIF-1α的增加正是由于機體缺氧所誘導，說明抑郁障礙患者血液中氧含量低于正常人[26]，存在不良情緒的患者可能長期處于低氧狀態。目前，HIF-1α與肝郁證的研究尚處于初期階段，蔣莉婭等[27]采用清胰醒腦顆粒治療肝郁氣滯證小鼠，檢測模型組與肝郁證小鼠腦部組織HIF-1α mRNA，結果顯示，治療組HIF-1α mRNA表達較低。有學者[28]發現，抑郁狀態下的大鼠腦、心肌組織中HIF-1α蛋白顯著増高，抑郁狀態下的大鼠重要器官處于相對缺氧狀態，會誘導HIF-1α蛋白活化、上調，從而引發其他臟器組織的損傷。HIF-1α是維持機體內氧穩定的一個主要調節因素[29]，被認為是機體在缺氧時編碼應答基因的重要轉錄因子，可促使VEGF基因表達的啟動、激活[30]，并通過相關靶基因調節細胞的增殖、能量的代謝、血管的生成、細胞的凋亡等，確保機體適應或改變缺氧狀態[31]。

綜上所述，正常的生理功能都離不開氣血陰陽的調和暢達，血管生成也離不開氣血陰陽的調和。若婦女備孕時情志不暢或所求不遂日久，會出現不同程度的肝郁氣滯現象，情緒異常會導致機體處于缺氧狀態，會誘導HIF-1α、VEGF表達下調，影響血管生成，使胚胎處于缺血、缺氧中，最終導致胚胎停育。低分子肝素或阿司匹林可用來治療胚胎停育，并非為了抗凝血，其目的是改善胚胎及子宮的血液供應，促進胚胎發育，與血管生成理論有許多共通之處，但是肝郁證導致的缺氧狀態應該是胚胎停育更上游的因素。在今后研究中，可對HIF-1α、VEGF信號通路其他指標進行檢測，以期對胚胎停育、肝郁證、HIF-1α、VEGF之間的關系進行深入研究。