青錢柳種質資源評價及其優(yōu)良家系和單株篩選

藍麗霞，徐展宏，孫操穩(wěn),2，方升佐,2*

(1. 南京林業(yè)大學林學院，江蘇 南京 210037；2. 南京林業(yè)大學南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

青錢柳（Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja）因其獨特的甜味而被稱為“甜茶樹”，主要分布在我國的亞熱帶地區(qū)[1-2]。在我國，青錢柳葉主要用作中藥配方以及保健食品原料[3]。藥理研究表明，青錢柳葉提取物具有降“三高”、抗氧化、抗菌等功效[4]，主要歸因于其數(shù)量眾多的生物活性物質如黃酮類、三萜類、多酚類等化合物的協(xié)同作用[5-7]。但青錢柳天然林資源稀少，多零星分布在深山老林和自然保護區(qū)中，加之環(huán)境的破壞以及人為過度采伐利用，嚴重影響了青錢柳種質資源的發(fā)掘與利用。

植物在進化過程中，由于基因突變、自然選擇以及生態(tài)隔離等原因，分化產生了種內有差別的地理生態(tài)種源和家系，導致生長和次生代謝物質的合成存在較大差異[8]。如不同厚樸（MagnoliaofficinalisRehd. et Wilson）種源間厚樸酚類物質總量及其單體均存在顯著差異[9]。鞠建明等[10]指出，銀杏（Ginkgo bilobaL.）半同胞家系種質資源的總黃酮醇苷含量、總內酯含量、總銀杏酸含量均具遺傳差異。目前，對青錢柳的研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳黃酮類化合物、三萜類化合物以及多酚類化合物含量在不同種源和家系間差異顯著[11-13]。此外，青錢柳不同單株間的次生代謝物質含量也存在較大差異[14]。青錢柳種質資源豐富的遺傳變異，是其良種選育、資源開發(fā)利用的基礎；但目前青錢柳良種選育的研究大多集中在種源和家系水平，且涉及的種源和家系較少[15]，關于家系-單株配合選擇的研究鮮有報道。

因此，本研究以前期收集的青錢柳種質資源為材料，通過分析研究青錢柳生長性狀和次生代謝物質含量在參試家系間的差異，初選出適合江蘇南京及周邊環(huán)境相似地區(qū)的優(yōu)良家系和單株，為青錢柳良種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試青錢柳種源及家系的種子均于2014年10月從天然林種群中的優(yōu)勢木和亞優(yōu)勢木上采集。對采集的種子進行層積催芽處理后，于2016年春季將發(fā)芽后的芽苗移植于8 cm × 11 cm的無紡布容器中育苗。經(jīng)苗期初步篩選后，于2017年4月移栽至江蘇省青錢柳種質資源庫中定植，每個家系的定植株數(shù)為5～30株，種植株行距為2 m × 3 m。由于資源庫的立地條件相對較為一致，種植時按家系進行配置。根據(jù)前期田間調查，本研究共選取青錢柳資源庫中31個家系（目前保存株數(shù)>5株）作為研究材料，在2020年10—11月對31個家系的所有單株進行相關生長指標的測定，并對每個家系內樹高和地徑均高于31個家系平均值的單株葉片進行次生代謝物含量的測定（共176株），具體家系原產地信息見表1。

表1 供試青錢柳種源和家系地理位置信息Table 1 Geographic location information for tested Cyclocarya paliurus provenances and families

江蘇省青錢柳種質資源庫位于江蘇省南京市溧水區(qū)南京林業(yè)大學白馬教學科研基地（31°35′ N，119°09′ E），屬亞熱帶季風區(qū)，四季分明，光照充足，年均氣溫15.4 ℃，年降水量1087.4 mm，且主要集中在5—8月。土壤為黃棕壤，0～40 cm土壤的密度為1.30 g·cm-3左右，pH值5.6左右，土壤肥力較低。

1.2 調查研究方法

1.2.1 樹高和地徑測定 分別用測高桿和胸徑尺測定31個家系所有單株的樹高和地徑，樹高精確到0.01 m、地徑精確到0.01 cm。以單株的樹高和地徑為基礎，計算同一家系的平均值和標準偏差。

1.2.2 葉次生代謝物含量測定 對每個取樣單株從樹冠中部的東南西北4個方向隨機采10片健康功能葉，共采集3份用于次生代謝物含量測定。各家系的次生代謝物含量也是以單株含量為基礎，計算其平均值和標準偏差。青錢柳次生代謝物的提取參照林源等[16]的方法。總黃酮含量的測定參照Zhou等[4]的方法，以蘆丁標準品為對照品繪制標準曲線。總三萜含量的測定參照Fan等[17]的方法，以齊墩果酸標準品為對照品繪制標準曲線。總多酚含量的測定參照Xie等[18]的方法，以沒食子酸標準品為對照品繪制標準曲線。

1.2.3 優(yōu)良家系與單株的篩選評價 使用熵權法[19]篩選優(yōu)良家系和單株，將家系/單株的指標值進行標準化，利用指標權重計算各家系/單株綜合得分值，公式如下：

式（1）～（2）中：Wj為指標權重值，m為指標數(shù)，Dj為指標差異系數(shù)；D為 綜合得分，n為樣本數(shù)，Hij為 第j指 標第i樣本標準化后的值。

優(yōu)良家系以綜合得分值位于前20%為選擇標準；優(yōu)良單株以綜合得分值位于前30%為選擇標準。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010和SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。方差分析模型為：

式中：yij為第i家系的第j個單株的觀測值，μ為總體均值，F(xiàn)j為家系效應，Sk為單株效應，eij為隨機誤差。

用Duncan’s多重比較分析家系之間的差異；采用變異系數(shù)（CV=（標準偏差/ 平均值） ×100% ）表示各性狀在家系間的離散程度，反映生長和主要次生代謝產物的變異情況[20]；在對各指標數(shù)據(jù)進行無量綱化處理基礎上，采用歐氏距離ward法進行系統(tǒng)聚類分析[21]。

2 結果與分析

2.1 青錢柳家系生長和葉主要次生代謝物質含量的差異

青錢柳31個參試家系的生長狀況和葉主要次生代謝物質含量見表2。3.5年生時，樹高和地徑的變化范圍分別為2.12～4.25 m和4.41～8.72 cm，平均值分別為3.15 m和6.34 cm，其中，GZSQ12#家系的樹高和地徑均顯著高于HBHF1#、ZJFYS4#和ZJMWL4#家系（p<0.05）。

表2 定植3.5年時青錢柳家系生長和葉主要次生代謝物含量的差異Table 2 Variation in growth and leaf secondary metabolite content among Cyclocarya paliurus families at 3.5 years of planting

參試家系間的總黃酮、總三萜和總多酚含量的變異范圍分別為20.62～47.35、34.51～67.51、6.62～28.25 mg·g-1，總三萜在青錢柳葉主要次生代謝物質中含量相對較高。與31個家系的平均值相比，SCMC31#、GXJZS7#、HBWF1#、GXJZS1#、AHQLF4#、ZJTT2#、ZJFYS1#、GXLS26#和AHQLF13#的總黃酮含量分別比平均值（30.92 mg·g-1）高53.14%、52.33%、34.12%、33.89%、32.73%、31.24%、14.84%、14.62%和9.99%， GZSQ12#、HNYS2#、HNYS3#、GXJZS7#、GXJZS1# AHQLF13#和GZYJ7#的總三萜含量分別比平均值（47.87 mg·g-1）高41.03%、40.07%、39.69%、 26.20%、18.47%、12.87%和12.43%。總多酚含量最高的家系為ZJMWL4#，其含量為28.25 mg·g-1。

定植3.5年時，31個參試青錢柳家系2個生長性狀和葉3個次生代謝物質含量的表型變異系數(shù)的變化范圍為16.91%～27.18%，為青錢柳優(yōu)良家系的篩選提供了極大的空間，其中，葉總多酚（27.18%）、總黃酮（24.12%）的含量變異較大，在參試家系間存在廣泛變異，而葉總三萜含量（18.92%）、樹高（16.91%）、地徑（17.85%）變異系數(shù)相對較低，表明其在參試家系間性狀較為穩(wěn)定。

2.2 青錢柳家系的聚類分析

根據(jù)生長和主要次生代謝物含量對31個參試家系進行聚類分析，在歐氏距離為7時，將31個青錢柳家系聚為4類（圖1），其中，第1 類（包含8個家系）為葉片總三萜含量較高家系，總三萜含量均值為57.89 mg·g-1。第2類（包含7個家系）為葉片總多酚含量較高家系，其含量均值為19.15 mg·g-1。第3類（包含6個家系）為葉片總黃酮含量較高家系，總黃酮含量變化范圍為38.60～47.35 mg·g-1。第4類（包含10個家系）為葉次生代謝物綜合含量和生長均較差家系，該類群葉次生代謝含量和生長均值低于參試家系平均值。

2.3 青錢柳優(yōu)良家系評價與篩選

采用多指標選擇法進行優(yōu)良家系篩選，以定植后3.5年生的樹高、地徑及葉主要次生代謝物質含量為指標，采用熵權法計算青錢柳家系各指標權重（表3）。根據(jù)綜合得分值對青錢柳31個家系進行排序（表4），按照20%的入選率[22]，篩選出GXJZS7#、GZSQ12#、GXLS26#、HNYS2#、AHQLF13#、SCMC31#和GXJZS1#共 7個家系作為南京及周邊環(huán)境相似地區(qū)的優(yōu)良家系。結合圖1發(fā)現(xiàn)，GZSQ12#、HNYS2#和AHQLF13#屬于類群1，生長和葉總三萜含量較高，GXLS26#屬于類群2，具有較高的總多酚含量，GXJZS7#、SCMC31#和GXJZS1#屬于類群3，其葉總黃酮含量較高。

表3 定植3.5年時青錢柳綜合評價的多指標熵權Table 3 Multi-trait entropy weights of comprehensive evaluation for Cyclocaryapaliurus at 3.5 years of planting

表4 定植3.5年時參試青錢柳家系的綜合得分及排序Table 4 Comprehensive scores and ranking of the Cyclocarya paliurus families at 3.5 years of planting

圖1 基于生長和葉次生代謝物質含量的青錢柳31個家系的聚類分析Fig. 1 Cluster analysis dendrogram of the 31 C.paliurus families at 3.5 years of planting based on tree growth and leaf secondary metabolite content at 6 in the Euclidean distance

青錢柳優(yōu)良家系的性狀表現(xiàn)見表5。入選的7個優(yōu)良家系的樹高和地徑平均值分別為3.46 m和6.86 cm，分別高于參試家系總體均值的9.84%和8.20%；優(yōu)良家系葉總黃酮、總三萜和總多酚含量均值分別為35.69、56.57、22.37 mg·g-1，較參試家系總體均值的分別提高了15.43%、18.17%和10.85%。

表5 定植3.5年時優(yōu)良家系性狀表現(xiàn)Table 5 Characters performance for the excellent Cyclocarya paliurus families at 3.5 years of planting

2.4 基于優(yōu)良家系的優(yōu)良單株選擇

在優(yōu)良家系選擇的基礎上進一步開展優(yōu)良單株選擇，篩選出的7個優(yōu)良家系（GXJZS7#、GZSQ12#、GXLS26#、HNYS2#、AHQLF13#、SCMC31#和GXJZS1#）中共包含37個單株，計算各單株的綜合得分值并排序，結果（表6）表明：GZSQ12#-4單株綜合得分最高，SCMC31#-3單株次之。以綜合得分值位于前30%為入選標準，共篩選出11個優(yōu)良單株（GZSQ12#-4、SCMC31#-3、HNYS2#-3、 GZSQ12#-1、 GZSQ12#-5、GZSQ12#-8、 GXJZS7#-2、 HNYS2#-4、GXJZS1#-2、GXJZS7#-4和GZSQ12#-9），占176株總參試單株的6.25%，其中，GZSQ12#家系內的單株生長和葉次生代謝物含量總體表現(xiàn)較好，而HNYS2#和SCMC31#家系單株表現(xiàn)相對較差。

表6 定植3.5年時優(yōu)良家系內青錢柳單株的綜合得分及排序Table 6 Comprehensive scores and ranking of the Cyclocarya paliurus individuals within superior families after 3.5 years of planting

由表7可知：篩選出的優(yōu)良單株平均樹高、地徑、葉總黃酮、總三萜和總多酚含量分別為4.06 m、7.95 cm、35.85 mg·g-1、69.42 mg·g-1和23.00 mg·g-1，分別比參試家系總體均值高28.89%、25.39%、15.94%、45.02%和13.97%，提高了選擇效果，篩選出的優(yōu)良單株可用于青錢柳優(yōu)良無性系的繁殖利用。

表7 定植3.5年時優(yōu)良單株性狀表現(xiàn)Table 7 Characters performance for the excellent Cyclocarya paliurus individuals at 3.5 years of planting

3 討論

表型性狀是植物對外界環(huán)境條件的長期適應后形成穩(wěn)定可遺傳的性狀，表型性狀的變異是遺傳變異的外在表現(xiàn)。青錢柳分布區(qū)廣泛，北至河南南召，南至廣西百色，導致了青錢柳種內存在較大表型變異。以往的研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳不同種源間生長性狀差異顯著，并且黃酮類化合物的含量呈現(xiàn)經(jīng)緯度雙向變異[23-24]。Sun等[25]認為，青錢柳黃酮和三萜類化合物在家系水平存在豐富變異，這與本研究結果一致。一般情況下，變異系數(shù)大于10%，則認為種質間存在較大差異[26-27]，而本研究通過對青錢柳生長和主要次生代謝物質的性狀變異分析發(fā)現(xiàn)，青錢柳的生長性狀和次生代謝物含量存在顯著變異，這與銀杏[28]、文冠果 （Xanthoceras sorbifoliumBunge）[29]等藥用樹種的研究結果一致。

多指標選擇是利用多個指標進行綜合評價分析，并篩選得到優(yōu)良種質[30]，如王治會等[31]利用總兒茶素、總游離氨基酸、咖啡堿等8項指標，篩選出5份功能成分含量高的茶樹（Camellia sinensis(L.) O. Ktze.）種質資源；吳可心等[32]通過杜仲綠原酸、桃葉珊瑚苷、總黃酮、茶多酚等活性成分指標進行藥用優(yōu)良杜仲（Eucommia ulmoidesOliver）的篩選。此外，為獲得最大藥用保健價值和經(jīng)濟價值，需結合其單株產量進行綜合考量。于國棟等[33]將生長指標和藥用成分含量相結合，對優(yōu)良葉用銀杏家系進行了綜合評價。然而，在青錢柳優(yōu)樹篩選的工作中，往往只考慮了葉內單一的藥用成分含量，鮮有將生長性狀納入評價體系[24,34-35]。因此，本研究以樹高、地徑2個生長性狀以及總黃酮、總三萜和總多酚3個藥用品質性狀作為評價指標，綜合考慮生長和目標次生代謝物質含量，采用熵權法綜合評價和篩選青錢柳優(yōu)良家系和單株。

在良種選育工作中，優(yōu)良家系-單株的配合選擇與遺傳改良能夠充分利用各層次的遺傳變異，獲得理想遺傳增益和豐富育種材料，是獲得最大遺傳增益的有效途徑[36]。如Que等[37]通過對黃梁木（Neolamarckia cadamba(Roxb.) Bosser）不同選擇水平所獲得的遺傳增益進行比較，認為優(yōu)良家系-單株的選育策略可以獲得較大的遺傳增益。本研究初步篩選出的7個優(yōu)良家系（GXJZS7#、GZSQ12#、GXLS26#、HNYS2#、AHQLF13#、SCMC31#和GXJZS1#）多來自中西部地區(qū)種源，這說明相較于其他地區(qū)種源，來自這些地區(qū)種源的青錢柳家系較適合在南京地區(qū)推廣種植。同時，本研究在優(yōu)良家系篩選的基礎上，還進行優(yōu)良家系內優(yōu)良單株的評價，共篩選出11個優(yōu)良單株，占總參試單株（176株）的6.25%，且這11個單株各指標的增幅在13.97%～45.02%。目前，青錢柳嫁接技術和嫩枝扦插技術已有突破并趨于成熟，這為優(yōu)良單株的無性系化利用以及區(qū)域化推廣提供了技術保障。

為了進一步比較優(yōu)良家系-單株配合選擇與從單株直接篩選優(yōu)良單株2種方法的差異，本研究還采用熵權法直接對176株參試單株進行了綜合評價（表8），所篩選出的11個單株（按6.25%入選率）中有8個單株與優(yōu)良家系-單株配合選擇結果一致，其余3個優(yōu)良單株與優(yōu)良家系-單株配合選擇結果不一致，說明優(yōu)良家系-單株配合選擇方法可能存在遺漏優(yōu)良單株的情況，在將來的選育工作中建議可直接從單株水平進行優(yōu)良單株的篩選評價。

表8 定植3.5年時青錢柳總參試單株的綜合得分及排序Table 8 Comprehensive scores and ranking of the Cyclocarya paliurus individuals after 3.5 years of planting

基于家系、單株等不同“基因型”劃分依據(jù)所進行的種質資源選擇，為青錢柳選育工作奠定了基礎。然而，植物的生長和次生代謝物含量除了受基因型的控制外，還受到環(huán)境因素的影響[38]，二者的交互作用使得表型性狀的選擇更加復雜。本研究僅在單一試驗點進行1 a的觀測，并未對青錢柳生長和主要次生代謝物質在不同環(huán)境條件下的適應性和穩(wěn)定性以及年度間穩(wěn)定性進行評價。因此，為達到更好的選擇效果，應進一步開展初選家系和單株的多點種源試驗并進行長期觀測研究。

4 結論

青錢柳的生長性狀和葉主要次生代謝物含量在31個參試家系之間存在顯著差異，為青錢柳良種選育提供了豐富的資源。通過優(yōu)良家系-單株配合選擇，共篩選出7個優(yōu)良家系（GXJZS7#、GZSQ12#、GXLS26#、HNYS2#、AHQLF13#、SCMC31#和GXJZS1#）和11個優(yōu)良單株（ GZSQ12#-4、 SCMC31#-3、 HNYS2#-3、GZSQ12#-1、 GZSQ12#-5、 GZSQ12#-8、GXJZS7#-2、 HNYS2#-4、 GXJZS1#-2、GXJZS7#-4和GZSQ12#-9），優(yōu)良家系和優(yōu)良單株的生長性狀和主要次生代謝物含量較參試家系總體均值的增幅分別為8.20%～18.17%和13.97%～45.02%。基于優(yōu)良家系-單株配合選擇篩選出的7個優(yōu)良家系和11株優(yōu)良單株可用于青錢柳進一步定向選育研究和應用。