杜仲種質資源葉片表型性狀多樣性分析

孟益德，杜紅巖，王 璐，呂庚鑫，慶 軍，何 鳳，黃海燕，杜慶鑫*

(1. 中國林業科學研究院經濟林研究所，河南 鄭州 450003；2. 國家林業和草原局杜仲工程技術研究中心，河南 鄭州 450003；3. 河南潤友林業技術服務有限公司，河南 鄭州 450003)

杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.） 為杜仲科杜仲屬落葉喬木，栽培與利用的歷史長達兩千多年，是第四紀冰川侵襲后僅留存在我國的單屬種孑遺樹種，也是目前我國重要的經濟林和工業原料林樹種，屬國家二級保護野生植物，在國內29個省（區、市）均有種植[1]。杜仲葉富含多種化學成分，包括黃酮類、環烯醚萜類、苯丙素類、木脂素類等，具有很高的藥用價值[2]。此外，杜仲葉在功能食品、保健品及功能飼料等領域也有廣闊的應用[3]。2018年，杜仲葉擬被國家衛健委會列為藥食同源目錄[4]。

植物葉片表型特征與植物生理生化及繁殖特征具有密切的相關關系，直接影響植物的基本行為與功能[5-6]。因此，葉片表型性狀多樣性是遺傳多樣性的具體表現，研究葉片表型遺傳多樣性有助于了解物種遺傳規律和變異程度，尤其是對種質資源收集、保存、評價與利用等具有重要意義[7-9]。研究表明，在器官形態上不同種質杜仲表現出明顯的變異，根據葉色和葉形發現有紫紅葉、小葉、大葉及長葉柄等變異類型，根據枝條形態發現有短枝、龍拐杜仲等變異類型，杜仲葉片主要活性物質含量及橡膠含量也發現有顯著的差異[10-12]。

近年有關杜仲種質資源遺傳多樣性研究已有報道，主要集中在雄花和果實形態性狀多樣性[13-14]，雄花和葉片活性成分多樣性[15-16]及采用分子標記技術對杜仲種質資源遺傳多樣性和群體遺傳結構進行研究[17]；但關于杜仲種質資源葉片表型性狀遺傳多樣性尚未開展系統研究，在表型特征中，葉片變異是遺傳變異的重要體現[18]。本文以701份杜仲種質資源葉片為研究對象，對 14個表型性狀進行測定，通過多樣性分析、相關性分析、聚類分析、隨機森林類群分類預測等方法，旨在系統全面揭示杜仲種質資源葉片表型性狀遺傳變異規律，以期為杜仲優良資源選育和優異性狀的挖掘提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

701份供試材料來自中國林業科學研究院經濟林研究所杜仲種質資源庫（113°36′ E，34°55′N），種質資源庫采用6株小區，定植株行距 3 m ×3 m，其栽培立地條件及管理方式均一致。于2019年7月初對資源庫8年生杜仲成熟葉片進行采集，每份種質選擇長勢一致、無病蟲害的4～6株，每株均從東南西北4個方向選取中部枝條，采取各枝條中部新鮮成熟葉片30片，低溫冷藏帶回實驗室進行表型性狀測定與分析。種質來源與數量見表1。

表1 種質來源與數量Table 1 Number and origin of germplasm resources

1.2 測定方法

鮮比葉質量：用直徑1 cm的打孔器在10個葉片上打取50個圓片，電子天平稱量；干比葉質量：50個鮮圓片烘干后的質量；葉片含水量：50個鮮圓片質量與相應50個干圓片質量之差；節間距：量取枝條的長度和葉痕總數，枝條長度與相應葉痕總數的比值，量取5根枝條取平均值；葉柄長：用游標卡尺測量10個葉片取平均值；用萬深LA-S植物葉片圖像分析儀（杭州萬深檢測科技有限公司）測量葉片長、葉片寬、長寬比、葉面積、葉片紅色成分、葉片藍色成分、葉片綠色成分、葉綠素參考值、葉周長，測量10個葉片取平均值。RGB顏色模型是一種顏色標準，本文通過采用RGB系統模型中的紅色成分、藍色成分、綠色成分描述葉片顏色特征[19]。

1.3 數據統計與分析

葉片14個表型性狀的最小值、最大值、平均值、標準差、變異系數和遺傳多樣性指數用 Excel軟件進行處理和計算。遺傳多樣性指數用Shannonwiener指數（H'）表示，，其中，Pi為某一性狀第i級別試驗材料份數占總份數的百分比。根據平均值（μ）和標準差（σ）將各性狀劃分為10級，從第1級（Xi<μ- 2σ）到第10級（Xi≥μ+2σ），每0.5σ為1級，統計各級的分布頻率[20]。基于杜仲14個表型性狀，利用R統計軟件進行相關性分析和主成分分析[21]，采用ward.D2系統聚類對杜仲種質資源進行聚類，聚類方法采用平方歐氏距離，通過R擴展軟件包randomForest來實現表型性狀數據隨機森林建模[22]。

2 結果與分析

2.1 杜仲種質葉片表型性狀多樣性分析

在701份供試的杜仲資源中，各表型性狀最小值、最大值、平均值、標準差、變異系數、多樣性指數存在不同程度的差異（表2）。 14個表型性狀的遺傳多樣性指數分布在1.90～2.09之間，平均多樣性指數為2.04，其中，葉片長和葉柄長的遺傳多樣性指數最高（2.09），其次是葉片寬、葉周長、長寬比，含水量的遺傳多樣性指數最低（1.90）。

表2 杜仲種質資源葉片表型性狀統計分析Table 2 Statistical analysis of leaf phenotypic traits of Eucommia ulmoides germplasm resources

14個表型性狀存在不同程度的變異，變異系數為4.57%～20.68%，平均值為11.41%，其中，葉面積、葉柄長和節間距具有較大的離散程度，葉面積的變異系數最大（20.68%），是葉片表型性狀變異程度最大的性狀，最大值為最小值的3.9倍，葉綠素參考值變異系數最小，為4.57%。

2.2 不同來源杜仲種質葉片性狀分析

不同來源杜仲葉片14個性狀平均值、標準差和多重比較（樣本數大于10）結果（表3）表明：14個表型性狀在不同來源間均有顯著差異存在。山西杜仲資源葉片的葉綠素參考值、鮮比葉質量和干比葉質量最大、含水量最高，葉片藍色成分最小；湖北杜仲資源的長寬比最大；四川杜仲資源的節間距、葉片長、葉片寬、葉面積和葉周長最大，鮮比葉質量最小，含水量最低；江蘇杜仲資源的葉片綠色成分、紅色成分最大，但其干比葉質量、葉片長、長寬比、葉面積、葉綠素參考值和葉周長均最小；河南種質資源的葉柄最長，湖北種質的葉柄最短。

表3 不同來源地杜仲葉片性狀比較（均值±標準差）Table 3 Comparison of leaf traits from different origin among Eucommia ulmoides germplasm (Mean±SD)

2.3 杜仲種質葉片表型性狀相關性分析

葉片14個性狀的相關性分析結果（表4）表明：84對性狀組合中有45對組合的相關性達極顯著水平（P＜0.01），其中，呈極顯著正相關的有26對，呈極顯著負相關的有19對；鮮比葉質量和含水量間的正相關系數最大（0.928），葉片綠色成分和葉綠素參考值間的負相關系數最大（-0.637），其中，鮮比葉質量與干比葉質量、含水量，葉面積與葉片長、葉片寬，葉周長與葉面積、葉片長、葉片寬，葉片紅色成分與葉片綠色成分這8組性狀的正相關性極高，相關系數均在0.80以上。葉面積與節間距、葉片長、葉片寬、葉綠素參考值、葉周長、葉柄長6個性狀呈極顯著正相關，與長寬比、葉片紅色成分、葉片綠色成分3個性狀呈極顯著負相關。葉綠素參考值與干比葉質量、葉片長、葉片寬、葉面積、葉周長、葉柄長6個性狀呈極顯著正相關，與葉片紅色成分、綠色成分、藍色成分3個性狀呈極顯著負相關。葉柄長除與含水量、長寬比、葉片藍色成分相關性不顯著外，與鮮比葉質量、干比葉質量、含水量等10個性狀呈顯著相關（P<0.05）。

表4 杜仲種質資源葉片14個表型性狀相關性分析Table 4 Correlation analysis of 14 phenotypic traits in leaves of Eucommia ulmoides germplasm resources

2.4 杜仲種質葉片表型性狀主成分分析

對14個表型性狀主成分分析（表5）發現：前6個主成分特征值均大于1，且累積貢獻率達到89.211%，說明前6個主成分能解釋絕大部分杜仲葉片性狀變異。第1主成分中，葉面積的正向特征向量最大，為0.951，其次為葉周長、葉片長、葉片寬，分別為0.933、0.900、0.899，這些性狀主要與葉片大小有關。第2主成分中，鮮比葉質量正向特征向量最大，為0.998，其次是含水量、干比葉質量，分別為0.912、0.857，這些性狀主要與葉片水分含量和質量有關。第3主成分中，葉片綠色成分正向特征向量最大，為0.948，其次是葉片紅色成分，為0.938，主要與葉片顏色有關。第4主成分中，葉綠素參考值正向特征向量最大，為0.603，代表了葉片的光合作用，葉片藍色成分負向特征向量最大，為-0.972。第5主成分中，長寬比正向特征向量最大，為0.994，主要反映葉片的形狀。第6主成分中，節間距正向特征向量最大，為0.831。從14個性狀中提取出葉面積、鮮比葉質量、葉片綠色成分、葉綠素參考值、長寬比、節間距6個葉片表型性狀，這些性狀是導致杜仲種質葉片表型性狀差異的主要因素，可作為杜仲種質資源的評價指標。

表5 701份杜仲種質資源表型性狀主成分分析Table 5 Principal component analysis of phenotypic traits of 701 Eucommia ulmoides germplasm resources

2.5 杜仲種質葉片表型性狀聚類分析

根據14個表型性狀，將701份杜仲種質劃分為4個類群（圖1），其中，第I類群包含的種質最多，有209份種質，其次是第Ⅳ類群有203份種質，第Ⅱ類群有178份種質，第Ⅲ類群有111份種質。分析4個類群杜仲種質資源的14個葉片表型性狀（表6）發現：每個類群之間杜仲種質資源葉片的表型性狀存在較大差異。第Ⅰ類群節間距、葉片長、葉片寬、葉面積、葉周長等形狀均顯著高于其他類群種質，第Ⅱ類群鮮比葉質量、干比葉質量、含水量均顯著高于其他類群種質，第Ⅲ類群葉片長、葉片寬、長寬比、葉面積、葉周長和葉柄長均顯著低于其他類群種質，第Ⅳ類群中葉片紅色成分、綠色成分顯著高于其他類群種質。

表6 杜仲種質資源各類群表型性狀比較Table 6 Comparison of phenotypic traits of various groups of Eucommia ulmoides germplasm resources

圖1 701份杜仲種質資源聚類Fig. 1 Clustering of 701 Eucommia ulmoides germplasm resources

2.6 杜仲種質不同類群分辨

利用鮮比葉質量、葉片綠色成分、葉面積、葉綠素參考值、節間距、長寬比6個葉片表型性狀建立隨機森林判別模型，對4個類群進行分類預測，從701份杜仲種質中選出75%的樣本作為訓練集，25%的樣品作為獨立測試集。利用隨機森林算法對訓練集進行訓練構建預測模型, 模型節點變量數為4，隨機森林中的數目為500，其交互驗證的預測準確率為80.11%，初建的隨機森林模型有待進一步優化。通過調整模型節點變量數優化隨機森林模型，根據模型誤判率均值確定模型節點變量數，當節點變量數為1時，模型誤判率均值為17.61%最低，預測準確率均值為82.39%（表7），因此，模型節點變量數選取為1。基于隨機森林分類輸出的杜仲葉片表型性狀重要程度見表8，平均降低精度重要性依次為：鮮比葉質量>葉片綠色成分>葉面積>葉綠素參考值>節間距>長寬比。建立的隨機森林判別模型能夠有效區分各類群種質，并驗證了這6個葉片表型可作為杜仲種質資源的評價指標。

表7 不同類群的杜仲種質分類預測結果Table 7 Prediction results of germplasm classification of Eucommia ulmoides of various groups

表8 葉片6個表型性狀對各類群分類預測的重要性Table 8 Importance of the six phenotypic traits in leaves for classification of various groups

3 討論

種質資源是育種的物質基礎，研究葉片表型性狀可以從整體水平了解研究對象的變異和多樣性，推動種質資源創新[23-24]。本研究通過對701份杜仲種質資源14個葉片表型性狀進行分析，發現不同種質杜仲葉片表型性狀間存在較大遺傳變異。表型變異系數越大，離散程度越高，14個性狀變異系數為4.57%～20. 68%，其中，葉面積的變異系數最大，為20. 68%。多樣性指數分布在1.90～2.09之間，葉柄長和葉片長的多樣性指數最高（2.09）。多樣性指數越高表明表型性狀多樣性越豐富，杜仲葉片表型性狀的Shannon-Wiener指數（H'）均值為2.04，與格木（Erythrophleum fordiiOliv.）[25]表型多樣性指數（2.03）和滇楸（Catalpa fargesiiBur. f.duclouxii（Dode） Gilmour）[26]表型多樣性指數（1.92）接近。綜合表型性狀的變異系數、多樣性指數，葉柄長和葉面積呈現出明顯的遺傳差異，這與衛尊征[27]等對小葉楊（Populus simoniiCarr.）葉片性狀研究中葉柄長變異系數最大，葉面積次之結果相似。

杜仲14個葉片表型性狀之間存在著不同程度的相關關系，其中，葉片長、葉片寬、葉面積、葉周長、葉柄長5個性狀間均呈極顯著正相關，葉柄長除與長寬比、葉片藍色成分相關性不顯著外，與鮮比葉質量、干比葉質量、含水率、節間距等11個性狀呈顯著相關。葉片性狀間復雜的相關性可能是因為數量性狀受多基因控制所致[28]。主成分分析將杜仲種質葉片的14個表型性狀轉化為6個主成分，這6個主成分提供了原性狀89.211%的信息。張康健等[29]發現，葉形和葉面積可作為篩選高含膠杜仲無性系的重要選擇指標。本研究中葉面積、鮮比葉質量、葉片綠色成分、葉綠素參考值、長寬比、節間距是6個主成分的主導因子，對葉片表型性狀多樣性起主要作用，可作為杜仲種質資源評價的主要表型指標。

對杜仲種質資源葉片14個表型性狀進行聚類分析，701份材料聚類為4類，4個類群杜仲種質葉片14個表型性狀均存在較大差異。杜仲在我國有長期的引種栽培歷史，不同杜仲群體間基因交流程度較高，而遺傳分化水平則較低[14]。聚類結果顯示，同一地區的杜仲種質并沒有完全聚在一起，說明杜仲種質之間的遺傳差異性與種質來源沒有相關性，因此，推測杜仲種質資源葉片表型的遺傳變異與種源地的關系不顯著，葉片發生的變異可能是源于杜仲群體內的遺傳多樣性。隨機森林算法可以找到數據中重要的特征，同時利用這些重要特征構建模型用于分類預測或者回歸預測[30]。Yuan等[31]采用隨機森林建立的模型對枯萎病發病和健康土壤的微生物群落特征進行了良好的區分。利用葉面積、鮮比葉質量、葉片綠色成分、葉綠素參考值、長寬比、節間距6個性狀建立隨機森林判別模型，對不同類群的杜仲種質進行分類判別，能夠有效區分各類群的種質，說明這6個葉片表型是造成杜仲種質資源葉片表型差異的主要因素，檢驗了這些性狀可作為杜仲種質資源評價的主要表型指標，為葉用杜仲良種選育及綜合利用提供了優異的種質基礎。

4 結論

本研究選取的701份杜仲種質涵蓋了國內絕大多數分布區，最大程度包含了杜仲葉片的遺傳多樣性類型。通過對杜仲種質資源葉片14個表型性狀進行分析，發現杜仲種質資源葉片表型性狀存在較大變異和豐富的遺傳多樣性，14個表型性狀之間存在著不同程度的相關關系。聚類分析將杜仲種質劃分為4大類群，各類群葉片表型性狀存在較大差異。主成分分析篩選出葉面積、鮮比葉質量、綠色成分、葉片葉綠素參考值、長寬比、節間距6個葉片表型性狀可作為評定杜仲資源的主要指標，為葉用杜仲良種選育及綜合利用提供了優異的種質基礎。