Captiva EMR-Lipid技術(shù)結(jié)合UPLC-MS/MS快速篩查與確證魚肉中多種農(nóng)藥殘留

梁美艷，鐘水橋

（梧州市食品藥品檢驗所，廣西梧州 543000）

農(nóng)藥殘留分析是對復(fù)雜混合物中痕量組分進(jìn)行分析的技術(shù)，具有微量操作精細(xì)、靈敏度高以及特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。目前能快速篩查與確證農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有氣質(zhì)聯(lián)用色譜法[1]、液質(zhì)聯(lián)用色譜法[2-3]和高分辨質(zhì)譜法[4-5]。這3種檢測方法抗干擾能力強(qiáng)，靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度都較高。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于蔬菜、水果、茶葉、肉類和中藥材等產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留檢測中，被檢測的農(nóng)藥種類也越來越多[6-8]。近年來，新發(fā)展起來的Captiva EMR-Lipid固相萃取柱，通過空間位阻和親水性的協(xié)同作用，對于C5及以上碳鏈化合物具有極強(qiáng)的選擇性吸附，可以在去除干擾脂質(zhì)的同時不吸附目標(biāo)物，因而具有良好的凈化效果。該凈化技術(shù)主要用于獸藥殘留檢測，應(yīng)用于肉類中農(nóng)藥殘留檢測研究較少[9-12]。本研究以Captiva EMR-Lipid為凈化手段，并用液相質(zhì)譜聯(lián)用儀對魚肉中20種農(nóng)藥殘留進(jìn)行了快速篩查和定量分析。該方法的凈化效果好、靈敏度高，能夠滿足魚肉中多種農(nóng)藥篩查確證工作的需要。

1 材料與方法

1.1 材料

魚肉，采購于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 試劑

乙腈（HPLC級），德國Merck公司；無水乙酸鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；EMR-Lipid（3 mL/300 mg），安捷倫科技有限公司；氧化樂果、涕滅威亞砜、多菌靈、久效磷、涕滅威砜、滅多威、噻蟲嗪、殺蟲脒、敵百蟲、3-羥基克百威、噻蟲胺、吡蟲啉、樂果、氯噻啉、啶蟲脒、硫環(huán)磷、涕滅威、磷胺、苯線磷亞砜和西瑪津（純度＞95.0%），德國Dr．Ehrenstorfer公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

LC-1290/QQQ-6490液相質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent technology；XA205DU電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BSA3202S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；T18 digital均質(zhì)器，德國IKA；AllegraX-15R高性能通用臺式離心機(jī)，美國貝克曼公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

①標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制。分別精密稱取20種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品適量，加入少量丙酮振蕩溶解后，用乙腈定容，配制成約1.0 mg·mL-1的20種農(nóng)藥單標(biāo)儲備液。②混合工作液的配制。準(zhǔn)確量取上述儲備液適量，乙腈逐級稀釋，制備成濃度為37～2 032 ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃保存。

1.4.2 樣品前處理

稱取5 g試樣，精確至0.01 g，于50 mL離心管中，加入10 mL 0.2%甲酸乙腈，均質(zhì)5 min，加入2 g無水乙酸鈉、4 g無水硫酸鎂，振蕩2 min，8 000 r·min-1離心5 min，取上清液2 mL過EMR-Lipid凈化柱，收集洗脫液，再用2 mL乙腈淋洗，收集洗脫液，合并洗脫液，40 ℃氮吹至近干，用20%乙腈定容至2 mL，0.22 μm濾膜過濾，供LC-MS/MS測定。

1.4.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Agilent SB-C18（2.1×100 mm，1.8 μm）；進(jìn)樣量：1 μL；柱溫：35 ℃；流動相：0.2%甲酸水（含5 mmol甲酸銨）（A相）和乙腈（B相）；梯度洗脫程序：0～1.50 min，20% B；1.50～8.00 min，20%→90% B；8.00～10.00 min，90% B；后運(yùn)行時間：3 min；流速：0.30 mL·min-1。

（2）質(zhì)譜參數(shù)。電噴霧離子源（ESI）；動態(tài)多反應(yīng)檢測DMRM模式；碎裂電壓380 V。離子對參數(shù)見表1。

表1 測定20種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)條件

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍及定量限、檢出限

試驗選取陰性魚肉作為空白基質(zhì)，分別稱取7份（每份5 g），按照樣品前處理方法進(jìn)行操作，氮吹近干后分別加入混合工作液10 μL、20 μL、40 μL、80 μL、160 μL、200 μL和400 μL，20%乙腈定容至2 mL后進(jìn)行分析。結(jié)果表明，20種農(nóng)藥在各自范圍內(nèi)都具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均大于0.995。記錄各待測組分色譜峰面積，以各組分的進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)（X），以各組分的峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸分析，以10倍信噪比對應(yīng)的濃度作為方法定量限（S/N=10），以3倍信噪比對應(yīng)的濃度作為方法檢出限（S/N=3），各農(nóng)藥的LOD及LOQ結(jié)果見表2。

2.2 回收率及精密度

在魚肉空白樣品中添加約1倍、2倍、5倍LOQ的20種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.4.2”方法進(jìn)行前處理，每個濃度做3個平行樣，得到方法平均回收率及精密度結(jié)果見表2。20種農(nóng)藥殘留的平均回收率為84.0%～116.4%，RSD為0.2%～5.8%。

表2 20種農(nóng)藥線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、回收率及精密度（n=3）

2.3 討論

2.3.1 色譜條件的優(yōu)化

試驗對常用流動相甲醇-水、甲醇-0.2%甲酸水、甲醇-0.2%甲酸水（含5 mmol·L-1甲酸銨）、乙腈-水、乙腈-0.2%甲酸水和乙腈-0.2%甲酸水（含5 mmol·L-1甲酸銨）等進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)使用乙腈-0.2%甲酸水（含5 mmol·L-1甲酸銨）溶液體系時，各成分洗脫效果好、峰形對稱以及靈敏度明顯提高，故選擇乙腈-0.2%甲酸水（含5 mmol·L-1甲酸銨）溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫。

2.3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于DMRM模式可以智能化地分配離子掃描時間，并且能夠同時兼顧靈敏度與數(shù)據(jù)采集質(zhì)量，適用于高通量、多組分化合物的分析，本試驗采用動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式（DMRM）進(jìn)行檢測。

2.3.3 樣品提取方法優(yōu)化

樣品提取液用0.2%甲酸乙腈進(jìn)行均質(zhì)提取，因在酸性提取環(huán)境中有利于各農(nóng)藥成分的穩(wěn)定。試驗分別考察了不同量上清液過EMR-Lipid凈化柱對結(jié)果的影響。稱取5 g試樣，精確至0.01 g，于50 mL離心管中，加入10 mL 0.2%甲酸乙腈，均質(zhì)5 min，加入2 g無水乙酸鈉、4 g無水硫酸鎂，振蕩2 min，8 000 r·min-1離心5 min，分別取上清液2 mL、5 mL過EMR-Lipid凈化柱，收集洗脫液，再用2 mL乙腈淋洗，收集洗脫液，合并洗脫液，40 ℃氮吹至近干，用20%乙腈分別定容至2 mL、5 mL。結(jié)果表明，2 mL提取液過柱后采用動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測（DMRM）進(jìn)行檢測，各成分回收率穩(wěn)定且在允許范圍內(nèi)，而5 mL提取液過柱后部分成分的回收率達(dá)到150%以上，故選2 mL上清液過柱。

3 結(jié)論

本文采用Captiva EMR-Lipid為凈化手段，結(jié)合液相質(zhì)譜聯(lián)用儀對魚肉中20種農(nóng)藥殘留進(jìn)行了快速篩查和定量分析。結(jié)果表明，該方法不僅具有前處理簡單、操作方便和凈化除脂效果好等優(yōu)點(diǎn)，還具有分離效果好、分析快速、檢出限低、靈敏度和精密度高等特點(diǎn)，適用于對魚肉中20種農(nóng)藥殘留的檢測。