貴州喀斯特地區紅茶中茶黃素含量的測定

吳華秀，吳新文，毛敏霞，黃永橋

（貴州省檢測技術研究應用中心，貴州貴陽 550014）

茶黃素具有抗氧化、抑菌、抗炎、防癌、抗腫瘤以及防治心血管疾病等功能[1]。其是由多酚類及其衍生物氧化縮合而成，是一類具有苯駢卓酚酮結構的化合物的總稱，現已發現的茶黃素有12種，其中茶黃素TF、茶黃素單沒食子酸酯TF-3-G、茶黃素單沒食子酸酯TF-3’-G和茶黃素雙沒食子酸酯TFDG是4種最主要的茶黃素[2]。茶黃素是紅茶中的主要成分，對紅茶的色香味及品質起著決定性的作用。紅茶中茶黃素含量的高低與用于制作紅茶的茶樹品種所生長的環境有很大的關系，以碳酸巖為主的地質環境更有利于紅茶的生產[3-5]。

目前有關茶黃素的測定一般有分光光度法[6]、毛細管電泳法[7]、液相色譜-串聯質譜法[8-10]、高效液相色譜法[11-17]等。在國標和各類文獻[6-17]中對紅茶樣品中茶黃素的提取和測定方法條件參數都各不相同，有利有弊。本文采用高效液相色譜法測定紅茶中的茶黃素含量，通過對提取溶劑、提取時間、提取溫度等條件進行試驗，優化并規范了測定紅茶中茶黃素的前處理方法，再對流動相進行對比分析，找到最優的色譜條件，避免了實際樣品帶來的雜質干擾問題，滿足測定紅茶中茶黃素的定性和定量要求，保證了茶黃素含量分析的準確性。采用該方法對全國10種紅茶及貴州喀斯特山區12個茶樹品種紅茶中的茶黃素含量進行測定，為分析貴州喀斯特山區紅茶品質提供數據依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設備

貴州生產加工的12個茶樹品種紅茶；其他地區品種紅茶（正山小種紅茶、祁門工夫、滇紅工夫、川紅工夫、寧紅工夫、閩紅工夫、湖紅工夫、宜紅工夫、越紅工夫以及九曲紅梅）均購于貴陽市各大型超市。

乙腈（色譜純），德國Merck公司；甲醇（分析純）、乙酸乙酯（分析純），天津市科密歐化學試劑有限公司；冰乙酸（色譜純）、茶黃素（TF）、茶黃素單沒食子酸酯（TF-3’-G）、茶黃素單沒食子酸酯（TF-3’-G）、茶黃素雙沒食子酸酯（TFDG）（純度均大于98%）以及0.22 μm PTFE針式濾膜，上海安譜實驗科技股份有限公司。

Agilent 1290高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器），美國Agilent公司；數顯恒溫水浴鍋，江蘇省常州市金壇區水北科普實驗儀器廠；LT2002電子天平，常熟市天量儀器有限公司；離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；Milli-Q超純水機，美國Millipore公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

分別稱取4種茶黃素化合物標準品10 mg（精確至0.000 1 g）于10 mL容量瓶中，甲醇溶液溶解并定容至刻度，配制成濃度均為1.00 mg·mL-1的標準儲備液，-18 ℃保存。分別取4種茶黃素化合物標準儲備液各2.00 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成200.00 μg·mL-1的混合標準溶液，備用。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：2%乙酸水溶液；流動相B：乙腈+乙酸乙酯（42+3）；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；DAD檢測器波長：280 nm；梯度洗脫：0～16 min，15% B；16～25 min，20% B；25～35 min，20%→24% B；35～37 min，24%→15% B；37～40 min，15% B。

1.2.3 樣品前處理

稱0.5 g（精確至0.001 g）樣品，加入10 mL 70%甲醇水溶液，在80 ℃水浴中提取10 min，取出冷卻至室溫，離心，取上清液，于25 mL容量瓶中，重復提取1次，合并上清液于容量瓶中，加70%甲醇溶液定容至刻度，混勻，過膜，上機測定。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取溶劑濃度對茶黃素提取率的影響

試驗發現使用一定濃度的甲醇溶液為提取溶劑時，在一定溫度的水浴中直接提取的前處理方法的提取效率更高。本文選擇50%、60%、70%、80%、90%以及100%的甲醇溶液，在相同溫度水浴中提取10 min，提取2次，結果如圖1所示。由圖1可知，不同濃度的甲醇對茶黃素的提取率影響較大，甲醇濃度太低時，茶黃素在溶劑中的溶解度較低，提取速率變慢，造成茶黃素的提取率偏低；隨著甲醇濃度的提高，茶黃素的提取率不斷提高。甲醇濃度在60%～80%時，茶黃素的含量基本保持不變，當甲醇濃度達到90%后，由于水分含量太低，不利于樣品快速軟化溶解，導致茶黃素提取困難，提取率開始降低，同時隨著甲醇濃度的提高，樣品雜質干擾也越來越嚴重。因此，甲醇濃度為70%時，既能保證較高的提取率，樣品雜質干擾也較少。

圖1 提取溶劑濃度的選擇

2.1.2 提取溫度對茶黃素提取率的影響

提取溫度的高低會直接影響茶黃素的提取效率，試驗選擇70%的甲醇為提取溶劑，分別在60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃以及85 ℃水浴中提取10 min，提取2次，結果如圖2所示。由圖2可知，當提取溫度達到80 ℃時，繼續提高提取溫度，茶黃素提取率無明顯增加，這是由于提取溫度過高，提取溶劑會沸騰，不利于試驗的進行。另外，溫度過高會加速茶黃素的氧化分解，不利于試驗的控制。綜合考慮，提取溫度選擇80 ℃時為最佳。

圖2 提取溫度的選擇

2.1.3 提取時間對茶黃素提取率的影響

提取時間的長短直接影響茶黃素的提取效果，試驗選擇70%的甲醇為提取溶劑，在80 ℃的水浴中分別提取5 min、10 min、15 min、20 min、25 min以及30 min，提取2次，結果如圖3所示。由圖3可知，提取時間低于10 min時，茶黃素提取不充分，茶黃素提取率低；提取時間達到10～15 min時，茶黃素含量增長緩慢，隨著提取時間的繼續延長，提取效率逐漸降低。因此，提取時間選擇15 min為最佳。

圖3 提取時間的選擇

2.2 樣品前處理正交設計

根據單因素試驗結果，選擇對試驗有影響的提取溶劑濃度（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）這3個因子進行L9(33)正交試驗，以茶黃素總含量為考察指標，正交試驗因素水平表見表1，正交試驗結果見表2。由表2可知，經極差分析（R）分析可知，影響紅茶中姜黃素總含量的因素大小為A＞C＞B，即提取溶劑濃度和提取時間是影響紅茶中茶黃素提取率的關鍵性因子，而提取溫度對其的影響最小。從表2可以看出，茶黃素總含量最高的組合為A3B3C2，結果為0.849%；由K值分析得到的最佳組合為A3B2C3，即用70%的甲醇為提取溶劑，在75 ℃的水浴中提取15 min，提取2次，得到最佳條件下，茶黃素總含量為0.853%，高于組合A3B3C2。因此，試驗得到的最佳組合為A3B2C3。

表1 正交試驗因素水平表

表2 L9(34)正交試驗設計及結果

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 流動相的選擇與優化

文獻表明[12]，在流動相中加入乙酸乙酯對目標物的分離度有較大影響。通過改變乙酸乙酯的濃度可以調節4種茶黃素的分離度、峰形及保留時間，通過優化最后選擇A：2%乙酸水溶液、B：乙腈+乙酸乙酯（42+3）作為流動相時，目標物分離度、峰形等均為最佳。標準溶液及實際樣品圖譜如圖4所示，分析時間為40 min，縮短了分析時間，實際樣品測定中雜質干擾小、出峰順序及保留時間與標準溶液出峰順序及保留時間保持一致。

圖4 標準溶液（A）及實際樣品（B）圖譜

2.3.2 色譜柱的選擇

流動相的pH值在2左右，ZORBAX SB-C18能耐受的pH值范圍為1～8，在保證具有良好的分離度和峰型的同時，該色譜柱能耐受較低pH值的流動相，在分析樣品時可以保證色譜柱不被損壞，保證色譜柱的正常使用壽命，所以最后選擇該色譜柱。

2.3.3 檢測波長的選擇

用DAD檢測器對4種茶黃素進行光譜掃描，4種茶黃素均在波長為280 nm左右處有最大吸收值，4種茶黃素的響應值最佳，干擾較小。因此，選擇280 nm作為4種茶黃素的檢測波長。

2.4 標準曲線與最低檢出限

配制質量濃度為2.00～200.00 μg·mL-1系列標準溶液，以標準溶液的峰面積和濃度計算回歸方程，結果見表3，在相應的濃度范圍內線性關系良好，相關系數R2＞0.999；通過S/N=3計算得出茶黃素（TF）、茶黃素單沒食子酸酯（TF-3-G）、茶黃素單沒食子酸酯（TF-3’-G）以及茶黃素雙沒食子酸酯（TFDG）的檢出限結果。

表3 檢出限和線性范圍

2.5 精密度及加標回收試驗

選擇3個添加水平進行加標回收試驗，每個水平做6次加標回收試驗，結果見表4，平均回收率均在95.9%～98.2%，精密度在1.5%～4.7%，說明該方法具有較好的重復性與準確性。

表4 回收率和精密度（n=6）

2.6 紅茶樣品的測定

2.6.1 貴州茶樹品種紅茶中茶黃素的含量

采用建立的分析方法對貴州12種茶樹品種的27批次紅茶進行茶黃素含量的測定，結果見表5。不同品種紅茶中4種茶黃素及茶黃素總量的含量存在一定差異。其中，TF含量為0.01%～0.17%，TF-3-G含 量 為0.10%～0.26%，TF-3’-G含 量 為0.04%～0.14%，TFDG含 量 為0.16%～0.64%。TFDG含量高于其他3種茶黃素，金牡丹二葉中4種茶黃素及茶黃素總量均為最高，分別為0.17%、0.26%、0.14%、0.43%及1.00%；丹桂-2和古樹-1的茶黃素總量含量最低，均為0.46%。

表5 貴州12個茶樹品種紅茶中茶黃素的含量

2.6.2 其他地區10種紅茶中茶黃素的含量

采用建立的分析方法對其他10種紅茶中茶黃素的含量進行測定，結果見表6。湖紅工夫中茶黃素總量高于其他幾種紅茶，為0.73%；九曲紅梅中茶黃素總量最低，為0.38%；寧紅工夫和湖紅工夫中TFDG的含量為10種紅茶中最高，為0.37%。

表6 其他10種紅茶中茶黃素的含量

綜上，不同品種紅茶中4種茶黃素及茶黃素總量的含量存在一定差異，貴州茶樹品種紅茶中茶黃素總量在0.46%～1.00%，其他地區紅茶品種茶黃素總量在0.38%～0.73%，且貴州茶樹品種紅茶中平均茶黃素總量高于其他地區紅茶品種；TFDG含量高于其他3種茶黃素，TF含量均為最低，金牡丹二葉中茶黃素總量含量最高，九曲紅梅中茶黃素總量含量最低，419-3茶中TFDG含量為所測紅茶中最高，為0.64%。

3 結論

通過對前處理方法和儀器條件進行優化，建立了高效液相色譜測定紅茶中茶黃素的分析方法，方法線性和精密度良好，可用于實際樣品檢測。采用該方法對貴州茶樹品種紅茶中和其他地區紅茶品種中茶黃素的含量進行測定，通過分析發現全國10種紅茶中4中茶黃素的含量在0.38%～0.73%，平均含量為0.57%；貴州喀斯特山區12個茶樹品種紅茶中，4種茶黃素的含量在0.46%～1.00%，平均含量為0.67%。結果表明，不同品種紅茶中4種茶黃素及茶黃素總量的含量存在一定差異，貴州喀斯特山區中的茶樹生產出來的紅茶比其他地區10種紅茶中茶黃素總量的平均含量要高出0.10%，這可能與貴州喀斯特山區以碳酸巖為主的地質背景有關。