銻對土壤中秀麗隱桿線蟲的毒性效應

宋子杰，黨秀麗，趙龍，侯紅，王鑫，呂海洋

（1.沈陽農業大學土地與環境學院，農業農村部東北耕地保育重點實驗室，土肥資源高效利用國家工程實驗室，沈陽 110866；2.中國環境科學研究院，環境基準與風險評估國家重點實驗室，北京 100012）

銻（Sb）是類金屬元素，沒有已知的生物學功能，對人體具有毒害甚至致癌作用，自1979年以來一直被美國環境保護局（EPA）和歐盟（EU）視為重點污染物。Sb在半導體、阻燃劑、硬化劑、電池生產等方面被廣泛使用，受近年來采礦冶煉作業、廢棄物焚化、煤炭燃燒、工業生產等人類活動的影響，環境中的Sb含量顯著增加。至2020年，中國Sb產量近8萬t，已成為全球最大的Sb產量國。廣西河池市的鉛銻礦冶煉廠區域土壤中Sb含量最高可達到3 690 mg·kg，湖南省錫礦山區域的土壤中平均Sb含量為3 061 mg·kg，最高可達到16 389 mg·kg，土壤Sb污染已成為不容忽視的環境問題。

生態安全土壤環境基準是土壤環境質量標準制定的基礎，該基準的推導需要陸生植物、微生物、土壤無脊椎動物等的毒性閾值作為支撐。近年來，國內外陸續開展了Sb對土壤環境中生態受體的毒性閾值研究。ZHONG等研究發現酸性土壤中Sb對赤子愛勝蚓（）的LC（半數致死濃度）為497 mg·kg；LIN等評價了老化7 d和60 d的土壤中外源Sb對白符跳（）的毒性，通過計算得出Sb對白符跳繁殖毒性的EC（半數效應濃度）分別達到307 mg·kg和1 419 mg·kg。但相關閾值研究依舊是基于有限的土壤環境生態受體。天然土壤的性質（土壤pH、陽離子交換量、有機質含量、金屬氧化物含量等）存在不同程度的差異，從而會影響土壤中重金屬的毒性。我國土壤環境基準研究起步較晚，基于不同類型土壤進行的毒性閾值研究較少，從而導致研究基礎數據較為匱乏。

目前Sb對土壤無脊椎動物毒性的閾值研究主要集中于跳蟲和蚯蚓，而對線蟲毒性的閾值研究較為不足。模式生物秀麗隱桿線蟲（）因具有生命周期短和易在實驗室條件下培養的特點而被廣泛應用于毒理學研究，基于國際標準ISO 10872指南的線蟲毒性試驗被認為是評價污染物毒性的有力工具。MOYSON等的研究結果表明，經過48 h的重金屬Zn、Cu、Cd溶液毒性暴露，3種重金屬對線蟲的LC分別為16.380、0.884、20.765 mg·kg；LU等將線蟲暴露于不同濃度的Mn、Pb、Cd溶液24 h，結果發現3種重金屬對線蟲的LC分別為41.4、0.26、4.8 mmol·L。但相關研究多基于水體介質中重金屬污染物對線蟲的毒性，而基于土壤介質中重金屬污染物的線蟲毒性試驗相對缺乏。因此，本研究以秀麗隱桿線蟲為受試生物，選用3種理化性質各異的土壤（西安壚土、鷹潭紅壤、江門紅壤），研究外源Sb對線蟲生長、生育、繁殖的毒性效應和閾值，并進一步探究影響Sb毒性的主要土壤理化性質，為基于土壤無脊椎動物的Sb毒性預測模型建立和土壤環境質量標準的修訂提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤分別采集于中國陜西省西安市（XA）、江西省鷹潭市（YT）、廣東省江門市（JM）的農田表層（0～20 cm）。土壤于自然條件下風干、剔除其中的石塊和動植物殘體后過2 mm篩網備用。土壤中黏粒占比通過激光粒度儀測定；田間持水量采用環刀法測定（NY/T 1121.22—2010）；土壤pH采用電極法測定（土水比為∶=1∶5，NY/T 1137—2007）；土壤陽離子交換量采用非緩沖硫脲銀法測定；土壤中有機質含量采用重鉻酸鉀氧化法測定；土壤中碳酸鈣含量采用中和滴定法測定；土壤經過草酸銨緩沖溶液[0.1 mol·LHCO和0.175 mol·L（NH）CO]提取處理后測定非晶質鐵氧化物、非晶質錳氧化物和非晶質鋁氧 化 物 的 含 量；2 g土 壤 經20 mL 0.3 mol·LCHNaO、2.5 mL 1 mol·LNaHCO和0.5 g NaSO提取處理后測定晶質鐵氧化物、晶質錳氧化物和晶質鋁氧化物的含量；土壤經過HF-HClO-HNO（∶∶=3∶1∶1）消解處理后測定土壤中Sb的背景含量。供試土壤理化性質如表1所示。

表1 供試土壤理化性質Table 1 Physicochemical properties of the tested soils

1.2 供試生物

野生型秀麗隱桿線蟲N2株和大腸桿菌（）OP50株均由福建上源生物科技有限公司提供。線蟲在恒溫培養箱中（20±1）℃條件下培養于線蟲生長培養基（Nematode growth-medium，NGM）瓊脂中。NGM瓊脂制備方法：17 g·L瓊脂粉、2.5 g·L酪蛋白胨和3 g·LNaCl于121℃條件下高壓滅菌后，加入無菌的1 mL 1 mol·LCaCl、1 mL 1 mol·LMgSO、25 mL 1 mol·LKHPO（用KOH調節pH為6.0±0.2）和1 mL 5 g·L膽固醇乙醇溶液，用無菌水定容至1 000 mL并充分混勻后，倒入培養皿冷卻備用。以大腸桿菌OP50株作為線蟲食物源，大腸桿菌菌液制備方法：從持續培養的LB（Luria-Bertani）固體培養基（17 g·L瓊脂粉、10 g·L酪蛋白胨、5 g·L酵母抽提物和10 g·LNaCl于121℃條件下高壓滅菌后，倒入培養皿冷卻制得）上挑取單克隆大腸桿菌菌落至LB液體培養基（10 g·L酪蛋白胨、5 g·L酵母抽提物和10 g·LNaCl于121℃條件下高壓滅菌，冷卻后制得），于恒溫搖床中37℃、150 r·min條件下培養14 h，用于線蟲的培養和毒性試驗。

為降低線蟲個體差異對試驗的影響，試驗前需要進行線蟲的同步化培養。待NGM瓊脂表面分布大量產卵的成蟲時，將線蟲以M9緩沖液（33.71 mmol·LNaHPO、22 mmol·LKHPO、85.56 mmol·LNaCl和1 mmol·LMgSO）沖洗至離心管，并洗去線蟲體表殘余的大腸桿菌，向離心管內加入裂解液（2.5 mol·LNaOH和質量分數為5%的NaClO）以裂解線蟲身體獲得蟲卵。用M9緩沖液洗去蟲卵表面多余的裂解液后，將蟲卵置于M9緩沖液中培養14 h即可獲得年齡同步的第一階段線蟲幼蟲。

1.3 土壤中Sb的添加和老化

試驗選用的三價銻鹽為酒石酸銻鉀，CHKOSb·3HO，分析純。土壤中Sb的添加以噴施酒石酸銻鉀水溶液的方式進行，每種土壤中的理論總Sb含量分別達到300、600、1 200、2 400、4 800 mg·kg，對照組僅添加去離子水。土壤充分攪拌均勻，調節土壤含水量至田間持水量的55%～60%后，裝入半封口的自封袋中老化備用，期間通過稱量的方法向自封袋中補充去離子水以保持土壤水分。經過7 d的老化后，取土壤樣品進行線蟲毒性試驗和總Sb、有效態Sb、不同價態Sb含量的測定。

1.4 土壤中線蟲毒性試驗

毒性試驗根據國際標準ISO 10872指南和SACCà等的方法進行。稱取0.5 g老化7 d的風干土壤至孔板中，加入0.1 mL重懸于M9緩沖液的大腸桿菌菌液（15 mg·mL）作為線蟲的食物源，向土壤中補充M9緩沖液使土壤含水量保持在田間持水量的80%，以保證試驗期間線蟲的水分需求。使用毛細管（直徑0.1 mm）向孔板內的土壤中添加10條線蟲后密封，置于恒溫培養箱中（20±1）℃黑暗條件下培養96 h。培養結束后，將孔板置于80℃恒溫干燥箱中加熱殺死線蟲以終止試驗，通過Ludox TM50離心懸浮法將孔板中的所有線蟲回收于培養皿中。每個試驗處理4次重復。

回收的線蟲置于100倍顯微鏡下測量線蟲的體長以計算線蟲的生長量，取30條第一階段線蟲幼蟲的平均體長作為線蟲的初始體長，為（276.2±8.5）μm。生長量的計算公式：

式中：為生長量，μm；為試驗結束時的線蟲體長，μm；為線蟲初始體長，μm。

于40倍顯微鏡下計數具有生育能力的線蟲個體數量（線蟲體內蟲卵個數≥1，則認為具有生育能力）以計算線蟲的生育率。生育率的計算公式：

式中：為生育率，%；為具有生育能力的線蟲個體數量，條；為引入試驗的線蟲個體數量，條。

于40倍顯微鏡下計數線蟲后代個體數量以計算線蟲的繁殖力。繁殖力的計算公式：

式中：為繁殖力；為線蟲后代個體數量，條；為引入試驗的線蟲個體數量，條。

1.5 土壤總Sb、有效態Sb和不同價態Sb含量的測定

經過7 d的老化后，取土壤樣品測定總Sb、有效態Sb和不同價態Sb的含量。土壤總Sb含量的測定參考YAN等的方法：稱取過0.075 mm尼龍篩網的風干土壤0.1 g，經過HF-HClO-HNO（∶∶=2∶1∶3）消解后通過0.5%的HNO稀釋并過濾，通過電感耦合等離子體發射光譜儀（ICP-OES）測定濾液中Sb的含量。土壤中有效態Sb含量的測定參考ETTLER等的方法：稱取2 g過2 mm尼龍篩網的風干土壤于離心管中，加入20 mL 0.1 mol·LNaHPO，于恒溫水浴振蕩器中25℃、200 r·min條件下振蕩2 h，再將離心管置于離心機中4 000 r·min條件下離心10 min后過0.45 μm濾膜，通過電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS）測定濾液中Sb的含量。土壤中不同價態Sb含量的測定參考LIN等的方法：稱取0.5 g過2 mm尼龍篩網的風干土壤于離心管中，加入5 mL 0.1 mol·LCHO，于恒溫水浴振蕩器中60℃、200 r·min條件下振蕩30 min后過0.45μm濾膜，通過氫化物發生-原子熒光光譜儀（HG-AFS）測定濾液中三價銻[Sb（Ⅲ）]和五價銻[Sb（Ⅴ）]的含量。測定過程使用國家一級標準物質（GBW-47410）作為質控。

1.6 數據處理與分析

通過Logisitic方程擬合實測總Sb含量和有效態Sb含量與線蟲各個毒性評價終點之間的劑量-效應關系并計算EC：

以計算Sb對線蟲生長毒性的EC為例，式中：為線蟲的生長量，μm；為實測總Sb含量或有效態Sb含量，mg·kg；為對照組中線蟲的生長量，μm；為EC值，mg·kg；b為方程擬合過程中所產生的斜率參數。Sb對線蟲生育或繁殖毒性的EC的計算方式同上，將替換為生育率或繁殖力，替換為對照組中線蟲的生育率或繁殖力。

Logisitic方程的擬合通過Sigmaplot 14.0軟件完成，相關性分析和單因素方差分析通過SPSS 25.0軟件完成，利用OriginPro 2018和Excel 2019軟件進行圖表的制作。

2 結果與分析

2.1 土壤中Sb（Ⅴ）占總Sb的比例

Sb（Ⅲ）在土壤中被吸附的同時還會被氧化為Sb（Ⅴ）。由圖1可知，理論總Sb含量為300 mg·kg時，西安壚土、鷹潭紅壤和江門紅壤中分別有42.4%、30.0%、68.0%的Sb（Ⅲ）被氧化為Sb（Ⅴ）。隨著理論總Sb含量的提高，3種土壤中Sb（Ⅲ）的氧化效率呈下降趨勢。整體而言，江門紅壤中Sb（Ⅲ）表現出最高的氧化效率，西安壚土次之，鷹潭紅壤最低。

圖1 土壤中Sb（Ⅴ）占總Sb的比例Figure 1 Proportion of Sb（Ⅴ）in total Sb in soils

2.2 土壤中有效態Sb含量

重金屬的有效態含量能夠反映土壤重金屬的潛在危害。總體而言，3種土壤中的有效態Sb含量均隨外源Sb含量的增加而增加，相同外源Sb含量下，3種土壤有效態Sb含量均存在顯著差異（圖2）。理論總Sb含量為4 800 mg·kg時，西安壚土、鷹潭紅壤和江門紅壤中最高有效態Sb含量分別達到448.1、258.6、95.3 mg·kg。有效態Sb的提取比例由高到低依次為西 安 壚 土10.9%（9.4%～13.7%）、鷹 潭 紅 壤6.2%（4.7%～9.1%）、江門紅壤2.6%（1.9%～3.2%）。

圖2 土壤中有效態Sb含量Figure 2 Concentration of Na2HPO4-extracted Sb in soils

2.3 Sb對線蟲毒性的效應及閾值

于線蟲毒性試驗結束后進行試驗的有效性檢驗：對照組的線蟲平均回收率在80%～100%范圍內；未發現雄性線蟲；線蟲生長量和生育率的變異系數均低于15%，線蟲繁殖力的變異系數低于30%；線蟲的平均生育率高于80%；線蟲的平均繁殖力高于50。因此，本試驗符合國際標準ISO 10872指南中關于試驗有效性的要求。

2.3.1 Sb對線蟲生長毒性的效應及閾值

利用Logistic方程擬合土壤中實測總Sb含量、有效態Sb含量與線蟲生長量間的劑量-效應關系，結果如圖3所示。3種土壤中線蟲的生長量均隨著理論總Sb含量的增加逐漸降低，但下降趨勢存在差異。西安壚土、鷹潭紅壤、江門紅壤中理論總Sb含量分別達到600、1 200、2 400 mg·kg時，線蟲的生長量相較于對照組開始出現顯著降低（＜0.05）；理論總Sb含量提高至4 800 mg·kg時，江門紅壤中線蟲的生長量仍達到416.4μm，而西安壚土和鷹潭紅壤中線蟲的生長量分別僅達到185.9、194.5 μm。基于實測總Sb含量計算得出，西安壚土、鷹潭紅壤、江門紅壤中Sb對線蟲生長毒性的EC分別為1 138、2 163、4 074 mg·kg，最大毒性是最小毒性的3.6倍；基于有效態Sb含量計算得出，西安壚土、鷹潭紅壤、江門紅壤中Sb對線蟲生長毒性的EC分別為116.5、107.0、81.8 mg·kg，最大毒性是最小毒性的1.4倍，差異有所降低（表2）。2.3.2 Sb對線蟲生育毒性的效應及閾值

圖3 線蟲生長量與實測總Sb和有效態Sb含量的劑量-效應關系Figure 3 Dose-response relationships of the growth of C.elegans with the measured concentrations of total Sb and Na2HPO4-extracted Sb

由圖4可知，理論總Sb含量在0～600 mg·kg的范圍內時，3種土壤中線蟲的生育率均未受到Sb毒性的影響（0.05）；理論總Sb含量達到1 200 mg·kg時，西安壚土和鷹潭紅壤中線蟲的生育率開始受到顯著抑制（＜0.05），而江門紅壤中線蟲的生育率未受到顯著的毒性影響（0.05）；理論總Sb含量進一步提高至2 400 mg·kg時，江門紅壤中線蟲的生育率出現顯著降低（＜0.05），但是仍有74%的線蟲具有生育能力，而西安壚土和鷹潭紅壤中線蟲的生育率不足10%。基于實測總Sb含量計算得出，西安壚土、鷹潭紅壤、江門紅壤中Sb對線蟲生育毒性的EC分別為849、1 472、3 244 mg·kg，最大毒性是最小毒性的3.8倍；基于有效態Sb含量計算得出，西安壚土、鷹潭紅壤、江門紅壤中Sb對線蟲生育毒性的EC分別為92.1、79.2、67.9 mg·kg，最大毒性是最小毒性的1.4倍，差異有所降低（表2）。

圖4 線蟲生育率與實測總Sb和有效態Sb含量的劑量-效應關系Figure 4 Dose-response relationships of the fertility of C.elegans with the measured concentrations of total Sb and Na2HPO4-extracted Sb

表2 基于實測總Sb和有效態Sb含量推導的Sb對線蟲毒性的EC50Table 2 The EC50 values of Sb for the toxicity of C.elegans based on the concentration of measured total Sb and Na2HPO4-extracted Sb

2.3.3 Sb對線蟲繁殖毒性的效應及閾值

通過對線蟲繁殖力的統計結果發現（圖5），西安壚土中理論總Sb含量達到600 mg·kg時線蟲的繁殖受到顯著的毒性抑制（＜0.05），而鷹潭紅壤和江門紅壤中理論總Sb含量達到1 200 mg·kg時線蟲的繁殖力開始出現顯著降低（＜0.05）；理論總Sb含量提高至2 400 mg·kg時，西安壚土和鷹潭紅壤中幾乎沒有新的線蟲后代個體產生，而江門紅壤中每條線蟲仍然能產生13.9個后代個體。基于實測總Sb含量計算得出，西安壚土、鷹潭紅壤、江門紅壤中Sb對線蟲繁殖毒性的EC分別為574、836、1 470 mg·kg，最大毒性是最小毒性的2.6倍；基于有效態Sb含量計算得出，西安壚土、鷹潭紅壤、江門紅壤中Sb對線蟲繁殖毒性的EC分別為69.1、48.6、34.7 mg·kg，最大毒性是最小毒性的2.0倍，差異所有降低（表2）。

圖5 線蟲繁殖力與實測總Sb和有效態Sb含量的劑量-效應關系Figure 5 Dose-response relationships of the reproduction of C.elegans with the measured concentrations of total Sb and Na2HPO4-extracted Sb

2.4 土壤理化性質與Sb毒性閾值間的相關性

通過Pearson相關性分析進一步探究影響Sb毒性的主要因素，根據分析結果可以發現（表3）：陽離子交換量與Sb對線蟲生育的EC呈顯著正相關（＜0.05）；有機質含量與Sb對線蟲生育和繁殖的EC呈顯著正相關（＜0.05）；非晶質鐵氧化物含量與Sb對線蟲生長的EC呈顯著正相關（＜0.05）。以上結果表明，土壤陽離子交換量、有機質含量和非晶質鐵氧化物含量是影響Sb毒性的重要因素，這是因為陽離子交換量較高的土壤具有更多的點位以吸附環境中的Sb，從而降低了Sb的生物有效性，有機質和非晶質鐵氧化物對土壤中Sb的吸附和對Sb（Ⅲ）的氧化作用能夠降低Sb的毒性。

表3 土壤理化性質與Sb毒性閾值間的相關性Table 3 Correlation between threshold of Sb toxicity to C.elegans and soil physicochemical properties

3 討論

基于國際標準ISO 10872指南的線蟲毒性試驗涵蓋了秀麗隱桿線蟲的整個生命周期，因此可以通過該試驗方法確定對線蟲個體水平（生長和生育）以及種群水平（繁殖）的影響。本研究結果表明，線蟲的毒性評價終點對Sb毒性的敏感性由高到低依次為繁殖力、生育率、生長量。BYERLY等研究發現，于20℃的培養條件下線蟲的生長過程經歷4次蛻皮且體長達到1 060 μm時，線蟲開始產卵。如果線蟲的生長受到Sb毒性的抑制而不能達到生育所需的生長階段，Sb對線蟲生育的抑制可能是線蟲生長受到抑制的附加效應。因此，線蟲的生育對Sb毒性表現出高于生長的敏感性，是Sb對線蟲生育的直接影響和對線蟲生長毒性的附加效應共同造成的。SCHERTZINGER等研究發現，線蟲的生育在沒有受到鈀（Pd）毒性完全抑制的情況下，繁殖受到完全的抑制，這可能是由Pd對線蟲蟲卵的損害以及生育毒性的附加效應共同造成的，從而導致線蟲的繁殖對污染物毒性的敏感性高于生育和生長。本研究結果還發現，理論總Sb含量達到4 800 mg·kg的鷹潭紅壤中沒有新的線蟲后代個體產生，但是線蟲的生育并沒有受到完全抑制。因此，線蟲的繁殖對Sb毒性表現出最高的敏感性，可能是由Sb對線蟲繁殖過程的直接影響和對線蟲生育毒性的間接影響所致。

理化性質各異的土壤中Sb的環境行為不同，從而導致了土壤中Sb毒性的差異。CAI等的研究指出，Sb在土壤中的反應過程大致可以分為：Sb（Ⅲ）遷移至土壤表面被吸附點位吸附，在土壤表面被氧化為Sb（Ⅴ）并被重新釋放入土壤溶液后，再次被土壤中的其他吸附點位吸附。本研究結果表明，陽離子交換量、有機質含量和非晶質鐵氧化物含量是影響Sb毒性的重要因素。相關研究表明，有機質和金屬氧化物能夠與Sb結合形成配合物并促進高毒性的Sb（Ⅲ）被氧化為毒性較低的Sb（Ⅴ）。本研究所選用的江門紅壤中有機質和非晶質鐵氧化物含量較高，為外源添加的Sb（Ⅲ）提供充足吸附點位的同時促進了高毒性的Sb（Ⅲ）向低毒性的Sb（Ⅴ）轉化并再次吸附，從而導致江門紅壤中Sb表現出對線蟲最低的毒性。研究發現，OH能夠提供電子并增強金屬的還原性，因此土壤中較高的pH能夠促進Sb（Ⅲ）被氧化為Sb（Ⅴ）。西安壚土中Sb（Ⅴ）占總Sb比例高于鷹潭紅壤，正是因為西安壚土具有較高的土壤pH。也有研究表明，OH與Sb競爭土壤中的吸附位點，因此具有較高pH的土壤不利于Sb的吸附，即生物有效含量較高，該結果同樣能夠解釋西安壚土具有最高的有效態Sb含量的原因。LIN等的研究同樣發現，不同土壤中Sb對線蟲繁殖毒性的EC與陽離子交換量呈顯著正相關，這是因為陽離子交換量是土壤中可用吸附點位數量的一種度量，是由土壤黏粒、pH、有機質、金屬氧化物等吸附相共同決定的。林祥龍等的研究表明，水提取態Sb同樣能夠較好地解釋不同土壤中Sb對白符跳繁殖毒性的顯著差異，其研究結果顯示基于土壤總Sb含量計算的Sb對白符跳繁殖毒性的EC差異高達5.9倍，而基于水提取態Sb含量計算的EC差異降低至3.2倍；何飛等研究發現基于有效態Sb含量計算的Sb對不同土壤中甘藍根伸長毒性的EC在8.28～24.05 mg·kg范圍內，EC間的差異相較基于總Sb含量計算的EC（100.55～656.65 mg·kg）縮小。

4 結論

（1）由西安壚土、鷹潭紅壤和江門紅壤中Sb對線蟲的毒性閾值差異可知，線蟲的3個毒性評價終點對Sb毒性的敏感性由高到低依次為繁殖力、生育率、生長量。

（2）陽離子交換量、有機質含量和非晶質鐵氧化物含量的增加降低了Sb對線蟲生長、生育、繁殖的毒性，是影響土壤中Sb毒性的主要因素。

（3）有效態Sb含量能夠更好地表達土壤中Sb的生物有效性，并解釋西安壚土、鷹潭紅壤和江門紅壤中Sb對線蟲毒性的差異。