施用生物刺激劑對空心菜種植增效減排效應研究

許紀元，郝雅瓊，孫海軍，董剛強，閔炬*，施衛明

（1.中國科學院南京土壤研究所，土壤與農業可持續發展國家重點實驗室，南京 210008；2.南京林業大學林學院，南京 210037；3.安利（中國）植物研發中心，江蘇 無錫 214115）

我國蔬菜產量占世界蔬菜總產量的50%，已成為世界上最大的蔬菜生產國。蔬菜高產離不開肥料（特別是化肥）的投入。集約化蔬菜種植體系為追求高產，常投入大量氮肥，但氮肥利用率僅為18%左右。未被作物吸收利用的氮素可通過NH揮發損失，或在氮轉化的硝化-反硝化過程中產生NO氣體等，從而造成一系列環境問題。因此，亟需發展蔬菜種植體系增效減排的高效施肥技術。

生物刺激劑是指促進植物生長、提升作物品質、提高植物抗逆性的一大類非養分物質。已報道的生物刺激劑包括黃腐酸類物質、海藻提取物、殼聚糖類物質、蛋白質水解物與多肽類物質、微生物菌劑等多種類型。生物刺激劑對植物產生的生長促進作用主要通過對根系生長的促進效果、對養分吸收的維持和促進效果、對土壤微生物群落的改良作用等途徑來實現。生物刺激劑的促生作用并非依靠自身的養分作用，而是通過其關鍵成分決定，且生物刺激劑主要成分與其種類顯著相關。葉面噴施某種蛋白質水解物可使菜豆增產25%，同時提高菜豆32%的豆莢種子數量和38%的平均株高；黃腐酸類物質的使用可提高菠菜的養分吸收效率和菠菜體內養分運輸速率；殼聚糖可提高長豆角豆莢可溶性蛋白含量、可溶性糖含量和維生素C含量，并增加了單果質量、單株結莢數和單位面積產量；微生物菌劑施用可使番茄總產量和前期產量分別提高34.4%和42.4%。目前生物刺激劑的應用研究多集中于其對作物產量的影響，而對蔬菜種植的增效減排效應的評價尚缺乏。為此，本研究通過兩季（2018年和2019年）的空心菜土柱試驗，選取有代表性的6種生物刺激劑（黃腐酸類物質、海藻提取物、殼聚糖、魚蛋白、大豆蛋白水解物、微生物菌劑）與氮肥配施，觀測不同生物刺激劑對空心菜產量、氮肥利用率、NH揮發和NO排放的影響，為提高菜地氮素利用率、減少氮環境排放提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗地概況

供試空心菜（Forsk）品種為港種大白骨通心菜310特選種，由深圳市范記種子有限公司提供。生物刺激劑包括黃腐酸（HA，山東興禾生物科技股份有限公司）、海藻提取物（AE，深圳神寶農業科技有限公司，純度為50%）、殼聚糖（9012-76-4）（CT，國藥集團化學試劑有限公司）、魚蛋白（FPH，山東省田旺生物有限公司）、大豆蛋白水解物（PPH，江蘇長晶生物工程有限公司）、微生物菌劑（FC，山東綠隴生物科技有限公司）。

供試土壤取自江蘇省宜興市周鐵蔬菜種植基地（31°16'N，119°54'E）的設施菜地，根據《中國土壤系統分類檢索》，供試土壤類型為普通肥熟旱耕人為土。土壤基礎理化性質如表1所示，其中土壤pH測定時的土水比為1∶2.5（∶），土壤電導率測定采用風干土，土水比為1∶5（∶）。

表1 供試菜地土壤基礎理化性質Table 1 Soil type and major characteristics（0～20 cm）of the field site

江蘇省宜興市年平均降雨量1 177 mm，年平均氣溫15.7℃，氣候為亞熱帶季風氣候，試驗期間當地的降雨和氣溫變化如圖1所示。

圖1 兩季試驗期（2018年和2019年）試驗點的日均溫和降雨量Figure 1 Average daily temperature and rainfall at the experimental site during the experiment periods（2018 and 2019）

1.2 試驗設計

試驗于2018年6—7月（第一季）和2019年8—9月（第二季）在光照通風正常的空地上開展。采用土柱模擬試驗，土柱直徑為35 cm，高度為60 cm，底部放入20 cm深珍珠巖，后填入50 kg過2 mm篩的風干設施菜地土壤，壓實、灌水，調節土柱內土壤水分含量至當地菜地田間持水量水平，土壤容重1.16 g·cm。于土柱內均勻移栽6棵2片真葉時期的空心菜，生長35 d后采獲。

試驗設置8個處理：不施氮對照處理（CK）、常規施氮處理（N），以及常規施氮分別配施6種生物刺激劑處理（N+HA、N+AE、N+CT、N+FPH、N+PPH、N+FC），每個處理3次重復。除CK處理不施氮肥外，其余所有處理的氮、磷、鉀肥投入均保持一致。其中氮肥采用尿素，氮肥（N）用量為1.15 g·盆，相當于120 kg·hm，分兩次施用，基肥、追肥分配比為1∶1。磷肥（PO）和鉀肥（KO）用量為0.38 g·盆和0.77 g·盆，相當于40 kg·hm和80 kg·hm，磷肥采用磷酸二氫鉀，鉀肥采用過硫酸鉀和磷酸二氫鉀，均一次性基施。6種生物刺激劑分別與氮肥同時添加，將肥料與生物刺激劑溶于水中，根部澆灌，2個肥期用量分配比為1∶1。生物刺激劑的總用量如表2所示，均換算自推薦用量。兩季基肥分別于2018年6月25日和2019年8月20日施入，追肥分別于2018年7月10日和2019年9月6日施入。定期澆水使土壤始終保持濕潤狀態。

表2 生物刺激劑的單季總用量（mg·盆-1）Table 2 Total amount of biostimulants to per vegetable season（mg·pot-1）

1.3 樣品的采集與測定

1.3.1 產量與氮肥表觀利用率

試驗結束后，收獲空心菜，稱取地上部生物量計算產量，然后在105℃下殺青30 min，繼續在75℃下烘干72 h至恒質量。隨后用植物粉碎機將樣品粉碎，通過濃HSO-HO消煮并采用凱氏定氮法測定植株樣品氮含量并計算吸氮量。

利用氮肥的表觀利用率（）來比較不同生物刺激劑處理的氮利用效率，計算公式如下：

1.3.2 NH揮發

采用海綿吸收法收集裝置內的NH揮發通量，采樣裝置為聚氯乙烯硬質塑料管，內徑15 cm，高20 cm。采樣時分別將兩塊厚度為2 cm、直徑為16 cm的海綿均勻浸以15 mL磷酸甘油溶液，下層海綿（樣品）置于塑料管中部，上層海綿（隔離空氣中的NH）與塑料管頂部齊平。各處理施基肥后分別于2018年6月25、27、29日和2019年8月20、22、24、26日更換下層海綿；追肥后分別于2018年7月10、12、14、16日和2019年9月6、8、10、12日更換下層海綿；基肥期采樣結束后至追肥開始之前的時間段內（2018年6月29日—7月10日和2019年8月26日—9月4日），放置海綿吸收土壤揮發的NH，直至追肥前更換下層海綿。海綿樣品中的NH采用1 mol·LKCl溶液浸提，靛酚藍比色法測定。用以下公式計算NH揮發通量，NH揮發累積排放量為NH揮發通量之和：

式中：為NH揮發通量，kg·hm·d；為單個裝置采集到的NH-N的量，mg；為采樣裝置覆蓋土壤的面積，m；為該樣品連續捕獲的時間，d。

1.3.3 NO排放

采用靜態箱-氣相色譜法測定NO排放通量，取樣時將方蓋PVC靜態箱（40 cm×40 cm×60 cm）置于水槽底座中形成一密閉空間，然后在密閉15、30 min和45 min時采集箱內氣體樣品，每次施肥后0、2、4 d和6 d采集樣品，用氣相色譜儀（HP7820A，Agilent Technologies，CA，USA）分析其NO濃度。通過以下公式計算NO排放通量，采用累積加和法計算空心菜季的NO累積排放量：

式中：為NO排放通量，μg·m·h；為標準大氣壓下NO氣體的密度，1.25 kg·m；為靜態箱高度，cm；Δ/Δ為靜態箱單位時間內的氣體濃度變化量，μg·L·h；為采樣時的絕對溫度，K。

1.4 數據分析

采用Excel 2016對數據進行基礎統計分析，采用SPSS 20.0對不同處理地上部氮吸收、產量、NH揮發和NO排放進行單因素方差分析（One-way ANOVA）及Duncan多重比較（＜0.05）。圖形采用Origin 16.0繪制，圖中所有數據均為每個處理3次重復的平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 不同生物刺激劑處理對地上部氮吸收的影響

由圖2可以看出，添加生物刺激劑可提高空心菜地上部氮吸收量，兩季試驗地上部氮吸收量從高到低均依次為N+HA、N+AE、N+CT、N+FPH、N+FC、N+PPH，與N處理相比，N+HA和N+AE處理顯著提高了空心菜地上部20.4%～63.2%和21.4%～54.6%的氮吸收。N+CT處理顯著促進了第一季空心菜地上部氮吸收（37.0%），第二季也表現為促進作用，但差異不顯著。其余生物刺激劑處理不同程度地促進了空心菜的地上部氮吸收，但與N處理相比無顯著的統計學差異。

圖2 不同生物刺激劑處理對兩茬空心菜地上部氮吸收的影響Figure 2 Response of N uptake of water spinach to different biostimulant treatments

2.2 不同生物刺激劑處理對產量的影響

不同生物刺激劑處理下的空心菜產量如圖3所示，兩季試驗中生物刺激劑處理均可以增加空心菜產量，2018年增產效果從高到低依次為N+HA、N+AE、N+CT、N+FC、N+FPH、N+PPH，2019年依次為N+AE、N+HA、N+CT、N+FC、N+FPH、N+PPH。其中，與N處理相比，N+HA和N+AE處理顯著增加了兩季試驗中空心菜的產量，分別增長26.8%～32.9%和24.1%～28.0%，N+CT處理與N處理相比增產效果不顯著，但兩季的產量均值增長幅度仍達到11.7%～17.1%。N+FPH、N+PPH和N+FC處理對空心菜產量沒有顯著影響。結果表明，兩季試驗中的N+HA、N+AE和N+CT處理相較于其他生物刺激劑處理更能促進空心菜產量增加，增產幅度達到11.7%～32.9%，這與其對地上部氮吸收的促進效果相一致（圖2）。

圖3 不同生物刺激劑處理對兩茬空心菜產量的影響Figure 3 Impacts of biostimulant amendments on water spinach yields during two seasons

2.3 不同生物刺激劑處理對氮肥表觀利用率的影響

圖4表明，生物刺激劑可提高空心菜氮肥的表觀利用率。兩季試驗的從高到低均依次為N+HA、N+AE、N+CT、N+FPH、N+FC、N+PPH。與N處理相比，N+HA和N+AE處理顯著提高了空心菜的，增幅為34.7%～108.9%和30.9%～94.0%。N+CT處理顯著促進了第一季的，增幅為63.6%，第二季增幅為26.7%，但與N處理相比差異不顯著。N+FPH和N+FC處理促進了空心菜，但與N處理相比無顯著差異。N+PPH處理提高了第一季空心菜，增幅為7.3%，但降低了第二季的，降幅為15.1%

圖4 不同生物刺激劑處理對空心菜氮素表觀利用率的影響Figure 4 Impacts of biostimulant amendments on the RENof water spinach

2.4 不同生物刺激劑處理對土壤NH3揮發的影響

如圖5所示，不同處理NH揮發通量變化趨勢基本一致，添加氮肥明顯增加了肥期的NH揮發通量。施肥后的2～4 d內土壤NH揮發通量達到峰值，之后逐漸下降，基肥期的NH揮發通量峰值高于追肥期。不同生物刺激劑對土壤NH揮發通量的影響有差異，與N處理相比，除了N+FC處理之外，其余處理在每次施肥后都減小了NH揮發通量，其中，N+HA和N+AE處理NH揮發通量減小最為明顯。

圖5 不同生物刺激劑處理下的NH3揮發通量Figure 5 NH3 volatilization fluxes under different biostimulants treatments

本研究中，兩季施氮處理NH揮發累積排放量分別為2.32～3.70 kg·hm（以N計，下同）和2.76～4.62 kg·hm，占氮素投入量的1.9%～3.1%和2.3%～3.8%，且不同生物刺激劑處理對空心菜季設施土壤NH揮發累積排放量有不同影響（圖6）。其中，與N處理相比，N+HA和N+AE處理分別顯著降低NH揮發損失的15.0%～17.2%和21.3%～27.4%；N+CT處理可顯著降低第二季NH揮發損失（19.8%），而對第一季NH揮發損失影響不顯著；N+FPH處理顯著降低第一季NH揮發損失（12.6%），而對第二季NH揮發損失影響不顯著；N+PPH處理與N處理相比無顯著差異，即對土柱NH揮發損失無顯著影響。綜合兩季空心菜種植期NH揮發監測結果可知，與N處理相比，N+AE和N+HA處理的NH揮發減排效果最好，N+CT和N+FPH處理具有NH揮發減排的潛力，N+FC處理可能會導致NH揮發增加。可見，生物刺激劑會顯著影響設施蔬菜土壤NH揮發，其影響效果與生物刺激劑類型有關。

圖6 不同生物刺激劑處理對空心菜種植設施菜地土壤NH3揮發的影響Figure 6 Impacts of biostimulant amendments on NH3 volatilization from intensive vegetable soil planted with water spinach

2.5 不同生物刺激劑處理對土壤N2O排放的影響

如圖7所示，不同處理NO排放速率變化趨勢基本一致，添加氮肥處理明顯增加了NO排放速率。施肥后的2～3 d，土壤NO排放速率達到峰值，不同生物刺激劑對土壤NO排放速率的影響有所差異。與N處理相比，生物刺激劑處理總體上不同程度地提高了土壤NO排放速率，尤其是提高了第一次施肥期的NO排放速率，第一季和第二季第一次施肥后的NO排放速率峰值分別增加了274.6～576.9μg·m·h（以N計，下同）和42.6～455.4 μg·m·h，這可能是生物刺激劑影響下土壤NO排放總量增高的原因之一。

圖7 不同生物刺激劑處理下的N2O排放速率Figure 7 N2O emission rates under different biostimulants treatments

本研究中，兩季施氮處理NO累積排放量分別為1.36～1.90 kg·hm（以N計，下同）和2.43～3.01 kg·hm，占 氮 素 投 入 量 的1.12%～1.58%和2.02%～2.51%，如圖8所示，不同生物刺激劑處理均促進了土壤NO累積排放量。其中N+HA、N+AE、N+PPH和N+FC處理均顯著提高了兩季空心菜試驗期間的NO排放，與N處理相比，分別增加了0.36～0.52、0.37～0.49、0.39～0.45、0.54～0.58 kg·hm。N+CT處理顯著促進了第二季空心菜種植土壤NO的排放（0.36 kg·hm），但對第一季NO的排放無顯著影響。N+FPH處理對兩季空心菜的NO排放均無顯著影響。綜上所述，生物刺激劑添加會影響設施菜地土壤NO排放，具體影響效果與生物刺激劑種類有關。

圖8 不同生物刺激劑處理對空心菜種植設施菜地土壤N2O排放的影響Figure 8 N2O emissions from intensive vegetable soil planted with water spinach following biostimulant amendments

3 討論

3.1 不同生物刺激劑處理增產增效效果

本研究中，施用黃腐酸、海藻提取物和殼聚糖類生物刺激劑對空心菜有顯著的增產效果。與常規施氮相比，添加黃腐酸類物質（N+HA）、海藻提取物（N+AE）、殼聚糖（N+CT）處理顯著提高了空心菜產量（15.0%～29.2%），同時提高了地上部氮吸收（26.2%～40.3%）及氮表觀利用率（40.5%～62.4%）。因此，施用生物刺激劑促進空心菜產量提升的主要原因之一是其增加了空心菜對氮的吸收，提高了氮利用率。SMOLE?等發現黃腐酸類物質能夠顯著提高水培條件下菠菜（L.）葉和根的生物量，KOCIRA等發現噴施海藻提取物可以顯著提高大豆產量（9.2%），以上均與本研究結果一致。此外，不同生物刺激劑還存在其他促生機制。黃腐酸類物質可以通過調控根區細胞質膜H離子泵活性促進根區細胞內蛋白質合成及細胞自身分生和生長，從而顯著促進玉米苗期根系生長；海藻提取物類物質含有的大量海藻酸、海藻多糖及多種植物促生物質（如抗氧化劑、藻類蛋白、藻類萜和植物生長激素等）可顯著提高生菜早期的總根長（40%～83%）；殼聚糖類物質可定向改變番茄苗根際微生物群落豐富度和多樣性，提高毛單胞菌科屬、假單胞菌科纖維弧菌屬、根瘤菌科根瘤菌屬和亞硝化單胞菌科亞硝化螺菌屬等促進植物生長的根際微生物活性。因此，生物刺激劑添加后作物產量的增加可能是多種因素共同作用的結果。

與常規施氮相比，添加魚蛋白（N+FPH）、大豆蛋白水解物（N+PPH）、微生物菌劑（N+FC）處理下空心菜產量和氮表觀利用率均沒有顯著提高。這與COLLA等和NGUYEN等的研究結果不一致，前者發現蛋白質水解物類物質可以通過促進植物根系硝化還原酶和谷氨酰胺合成酶的活性及不定根的生長來提高植物的養分吸收，進而提高作物產量，后者研究發現、和3種微生物菌劑可在各個階段促進大麥生長，提高其產量。生物刺激劑的促產機理較為復雜，易受多種因素的影響。有研究發現，微生物菌劑能夠顯著提高低氮投入條件下生菜作物地上部氮的吸收，而在高氮投入條件下對氮吸收的影響不顯著，土壤氮水平的差異可能導致生物刺激劑促生效果的差異。有研究證明生物刺激劑施用方式不同（葉施或根施）對金魚草生長的影響存在差異，不同于前人研究中的葉面噴施方式，本試驗采用的根部施肥方式更易受到植物生長所處根系環境的影響，從而可能改變生物刺激劑的作用效果，導致促生效果存在差異。

3.2 不同生物刺激劑處理的環境減排效果

生物刺激劑對設施菜地土壤NH揮發的影響與刺激劑類型有關。與常規施氮相比，添加黃腐酸類物質（N+HA）、海藻提取物（N+AE）、殼聚糖（N+CT）處理降低了9.6%～24.2%的NH揮發量。上述3種生物刺激劑的添加，提高了空心菜地上部氮吸收和氮表觀利用率，減少了氮損失，這可能是NH揮發降低的原因。而添加微生物菌劑（N+FC）處理顯著提高空心菜季土壤NH揮發。微生物菌劑類物質可能是通過提升土壤中的NH-N含量進而導致空心菜季菜地土壤NH揮發增加。此外，微生物菌劑類物質可能通過直接影響土壤微生物群落組成及其豐度，或間接影響植物根系次生分泌物的組成以改變根際氮轉化微生物群落，導致本研究中微生物菌劑類物質與其他生物刺激劑對土壤氮轉化過程的影響不同。

與常規施氮處理相比，6種生物刺激劑處理均增加了土壤NO排放，增幅為8.4%～29.8%。生物刺激劑可以直接調控土壤氮轉化微生物的活性，或通過調節土壤pH、提供有機碳源、刺激根系分泌物等調節根際微生物，從而控制土壤硝化反硝化過程，促進NO排放。本研究結果與SOUZA等的研究結果一致，其研究發現某種含氮轉化微生物的生物刺激劑添加導致土壤NO排放顯著增加32%。此外，黃腐酸類物質可以通過耦合土壤中鐵、錳等活性金屬介導土壤氮的轉化，促進土壤NO的形成及排放，還可以通過介導土壤NO的氧化還原轉化影響土壤中氮的去向。本研究中，生物刺激劑添加導致的NO排放損失量為0.16～0.56 kg·hm，僅占氮肥投入量的0.1%～0.5%，處于較低水平。在應用生物刺激劑時，聯合其他NO減排措施（如添加硝化抑制劑、生物質炭）、有機肥代替化肥等，可以有效控制NO排放。

4 結論

（1）兩季種植結果表明，與常規施氮相比，氮肥配施黃腐酸類物質、海藻提取物和殼聚糖處理增產增效最為顯著，增產幅度為15.0%～29.2%，氮表觀利用率提高40.5%～62.4%。

（2）與常規施氮相比，氮肥配施黃腐酸類物質、海藻提取物和殼聚糖可降低土壤NH揮發損失9.6%～24.2%。此外，生物刺激劑施用存在NO排放增加的風險，建議在配施生物刺激劑的同時實施NO減排措施，以便降低溫室氣體排放。

（3）綜合考慮6種生物刺激劑在產量、氮肥表觀利用率和NH、NO排放上的效果，發現在空心菜等葉菜上應用黃腐酸類、海藻提取物、殼聚糖類生物刺激劑與氮肥配施，可促進產量、提高氮肥利用率并減少NH揮發。