淹水條件下添加油菜秸稈及菌劑對設施西瓜土壤及其微生物的影響

王慶峰，褚長彬，趙崢，楊乾罡，董月霞，周德平*，吳淑杭*

（1.上海市農業科學院生態環境保護研究所，上海 201403；2.杭州錦江集團有限公司，杭州 310005；3.上海市農業科技服務中心，上海 200335）

設施栽培具有復種指數高、施肥量大等特點。雖然通過設施化栽培可以獲得較高的果蔬產量和經濟效益，但設施環境相對封閉、農藝管理措施不當（過量投入化肥、農藥以及高復種指數等）導致的土壤酸化、鹽漬化、土壤板結、病害加重以及養分失衡等問題嚴重影響了土壤的健康，制約著農業設施化栽培的可持續發展。設施栽培西瓜以其上市早、效益高等優勢而深受農戶歡迎。據統計，我國西瓜的設施栽培面積達8.87×10hm，占西瓜總種植面積的71.18%。然而，西瓜生產中極易產生連作障礙，造成微生物群落失衡，蔓枯病、枯萎病和根結線蟲等病害加重。因此，通過利用合理的農藝措施以及添加合適的有機物料來改良設施栽培土壤是生產上亟待解決的關鍵問題。

土壤厭氧消毒是利用覆膜、淹水、添加有機物料等方式，快速修復因長期過度利用的設施化栽培造成的土壤酸化、鹽漬化等土壤退化問題的一種技術手段。ATSUKO等發現利用土壤厭氧消毒的方法可以產生抑制病原微生物的有毒物質，降低土壤病害的發生，并可以重塑改變的微生物群落結構。ZHOU等研究發現利用土壤厭氧消毒的方法能夠顯著改變土壤中噬纖維菌科（Cytophagaceae）、幾丁質菌科（Chitinophagaceae）、毛殼菌科（Chaetomiaceae）等的相對豐度。在長期連作的設施化栽培土壤中，采用土壤厭氧消毒的方法可以降低土壤鹽堿化、緩解土壤酸化以及降低土壤病原菌數量等。本課題組前期通過淹水處理長期設施化栽培的土壤發現，淹水處理后土壤pH升高，微生物群落結構發生顯著改變，因長期栽培造成的土壤鹽漬化問題得以緩解。目前，盡管淹水條件下添加常規有機物料（作物秸稈、甘蔗渣等）已有廣泛報道，但淹水條件下添加油菜秸稈還未見報道。

油菜秸稈中含有較高濃度的硫代葡萄糖苷，硫代葡萄糖苷在組織被破壞并摻入土壤后會被內源性硫代葡萄糖苷酶水解，從而釋放出天然揮發性熏蒸劑異硫氰酸鹽。異硫氰酸鹽具有安全、無污染等特點，被廣泛用作土壤生物消毒劑。REN等研究發現，利用從高硫苷植物中提取的異硫氰酸鹽能夠顯著降低番茄栽培土壤中細菌或真菌性病原菌的數量、殺滅土壤中的根結線蟲和雜草，同時可以提高番茄的產量和農民收入。在控制土壤病害方面，油菜秸稈能夠降低土壤中疫霉屬和大麗輪枝菌等病原菌的數量。另外，研究表明利用高硫苷植物殘體可以改善土壤結構，提高土壤中細菌數量，降低土壤真菌數量，使土壤從“真菌型”土壤轉變為“細菌型”土壤。然而，油菜秸稈施入土壤后如何影響土壤微生物群落結構以及功能有待于進一步研究。微生物菌劑具有多種功能，包括活化土壤養分、促進植物生長、抑制病原菌生長以及加速有機物料分解等。貝萊斯芽孢桿菌（）普遍存在于土壤、河水、植物組織中。研究發現貝萊斯芽孢桿菌可以對植物產生促生、固氮以及提高植物抗性等多種作用，是重要的植物抗病促生菌。曲霉是自然界中著名的高產纖維素酶的絲狀真菌，其在發酵過程中能夠產生纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶和木質素降解酶等多種酶，對植物秸稈類有機物質具有高效的降解作用，且安全、無毒素。然而，目前基于淹水條件下通過添加油菜秸稈以及微生物促生促腐菌劑等方法改良設施栽培土壤還未見報道，需要進一步研究。

近年來，隨著人們生活水平的提高，安全、有機、無污染的瓜果蔬菜受到大眾的青睞。因此，利用淹水條件創造厭氧環境促進油菜秸稈水解過程中生物殺菌劑（如異硫氰酸鹽）的釋放和其作用的發揮，并探索淹水條件下添加油菜秸稈和微生物菌劑對長期種植造成的設施化栽培土壤質量降低的改良效果，對促進設施栽培可持續生產具有重要意義。本研究通過在淹水條件下添加能夠產生殺菌物質的油菜秸稈以及功能微生物菌劑，研究其對土壤理化性質以及微生物群落結構和功能的影響，為后期利用油菜秸稈改良設施化栽培土壤提供參考，并為設施化栽培的可持續發展提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗土壤

試驗所用土壤采自設施連作西瓜地，該試驗地位于上海市農業科學院莊行綜合試驗站內（30°53'N，121°23'E），自2014年開始種植西瓜，每年于4月初種植，9月底收獲，西瓜品種為早春紅玉，每年一季，收獲后不再種植其他作物。與2014年相比，2015—2019年大棚內西瓜產量已經降低30%～50%。2019年西瓜收獲后采集土壤，取樣深度為0～20 cm。土壤的基本理化性狀為pH 5.95、電導率（EC）3.43 mS·cm、堿解氮含量95.67 mg·kg、有效磷含量70.82 mg·kg、速效鉀含量1 996.67 mg·kg、有機質含量26.6 g·kg。

1.2 試驗設計

為研究淹水條件下油菜秸稈及油菜秸稈中添加促腐促生菌劑對土壤理化性狀、微生物群落和功能的影響，試驗共設置3個處理：淹水處理（還原條件，CK）、添加油菜秸稈后淹水處理（GSL）、添加油菜秸稈和促腐促生菌劑后淹水處理（B_GSL）。每個處理3盆重復，盆的尺寸（長、寬、高）為49 cm×19 cm×14 cm，每盆裝土5 kg。

鑒于西瓜生長季節（每年4—9月）以及油菜的種植時間和收獲時間（每年10月到次年3月），為充分利用土地資源，驗證油菜秸稈就地還田的可能性，油菜21-y216（上海市農業科學院作物所提供，硫代葡萄糖苷含量為75.26μmol·g）在2019年10月24日種植于GSL和B_GSL處理的盆栽土壤中，2020年3月3日收獲后剪碎（1～2 cm），于新鮮狀態下（提高油菜秸稈分解過程中葡萄糖苷水解產生的異硫氰酸鹽作用的發揮）全量（約500 g）混勻于各自處理土壤中，并在B_GSL處理中添加菌劑。微生物菌劑為貝萊斯芽孢桿菌（）K3和曲霉菌株，貝萊斯芽孢桿菌和曲霉由本實驗室篩選并保存，具有顯著的促進有機質降解的功能。5 kg土壤中分別添加300 mL貝萊斯芽孢桿菌和曲霉的發酵液，其濃度分別為1×10CFU·mL和1×10CFU·mL。全部物料添加完成后開始淹水處理，淹水的操作步驟：利用蒸餾水將每個處理的土壤灌飽和，并高出土壤1～2 cm，試驗期間補充蒸餾水，一直到2020年3月30日結束。淹水結束后將水排出，土壤在盆中自然晾干。西瓜于2020年4月10日進行移栽種植。

1.3 樣品采集

西瓜種植后第50天采集土樣。每盆采集0～10 cm土壤，隨機采集3土鉆（直徑為3 cm）。土樣一部分在室溫條件下自然風干后，測定土壤理化性質，另一部分保存于-80℃，用于土壤微生物測定和分析。同時測定西瓜的生長指標（藤蔓長度）和成活率。

1.4 土壤理化性質測定

土壤pH采用土水比1∶2.5的比例測定；EC采用土水比1∶5進行測定；土壤有機質采用重鉻酸鉀容量法測定；土壤堿解氮利用堿解擴散法測定；土壤有效磷采用0.5 mol·LNaHCO浸提-鉬銻抗比色法測定；土壤速效鉀采用乙酸銨浸提-火焰光度法測定。

1.5 土壤總DNA提取與高通量測序

土壤總DNA提取采用Power Max Soil DNA Isolation Kit試劑盒，按照試劑盒說明步驟進行提取（MOBIO，美國）。提取的土壤總DNA分別經過1%瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop測定DNA完整性、純度和濃度。土壤細菌的擴增引物為338F（5'-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3'）/806R（5'-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3'）。擴增引物連接接頭A、B和樣品識別序列。擴增區域為V3～V4可變區域，擴增體系為5 μL 10×Pyrobest緩沖液，4 μL dNTPs（2.5 mmol·L），上下游引物各2μL（10μmol·L），0.75 U Pyrobest DNA聚合酶和30 ng模板DNA。使用ABI GeneAmp9700型PCR儀進行擴增，擴增程序為：95℃預變性5 min，27個循環包括95℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，最后72℃延伸10 min。全部PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產物。制備Amplicon文庫后，利用Illumina MiSeq PE250平臺進行測序。

1.6 生物信息分析

通過Illumnia Miseq平臺測序得到的下機數據經過QIIME（v1.8.0）軟件進行質量控制，具體過程為：（1）設置50 bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，則從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50 bp以下的序列，去除含N堿基的序列；（2）根據序列兩端的重合序列，拼成完整序列，允許最小重合序列長度為10 bp，最大錯配比率為0.2；（3）根據序列首尾兩端的barcode和引物區分樣品，并調整序列方向，barcode允許的錯配數為0，最大引物錯配數為2，將去除引物序列的測試數據比對到GenBank數據庫中，去除嵌合體，獲得高質量序列。利用CROP軟件將核苷酸相似度大于97%的序列作為一個分類操作單元（OTU），利用Gen-Bank數據庫對物種進行注釋，并去除所有處理中只有一條序列的OTU，將所有樣品序列進行抽平（Subsample）。利用Mothur軟件（V1.31.2）計算樣品多樣性。

1.7 數據分析

利用SPSS 24中的單因素方差分析（ANOVA，Tukey's test）分析不同處理對微生物多樣性、不同分類水平下細菌相對豐度以及功能變化的差異。基于weighted Fast UniFrac距離矩陣，利用R語言主坐標分析（Principal coordinates analysis，PCoA）對不同處理微生物多樣性進行分析。利用Functional Annotation of Prokaryotic Taxaanalysis（FAPROTAX）分析不同處理對微生物群落功能的影響，并利用平均數差異顯著性檢驗分析微生物功能變化差異。

2 結果與分析

2.1 油菜秸稈和菌劑的施用對土壤理化性質和西瓜生長指標的影響

淹水條件下添加油菜秸稈以及油菜秸稈和菌劑混合添加顯著改變了土壤理化性質（表1）。與CK處理相比，施用油菜秸稈處理（包括GSL和B_GSL處理）顯著提高了土壤pH（＜0.05），其中GSL處理提高了0.88個單位，B_GSL提高了0.64個單位。與CK處理相比，GSL和B_GSL處理對土壤堿解氮含量影響不顯著。GSL和B_GSL處理顯著降低了土壤速效鉀含量，而提高了土壤有機質含量。另外，GSL處理可顯著提高土壤速效磷含量，而B_GSL處理對土壤速效磷含量影響不顯著。淹水條件下添加油菜秸稈以及油菜秸稈和菌劑混合添加也顯著影響了西瓜的生長和成活率（表1）。添加油菜秸稈處理促進了西瓜的生長，其中B_GSL處理促進效果最明顯，藤蔓長度比CK處理長35.96%。GSL和B_GSL處理也顯著提高了西瓜的成活率，較CK處理分別提高了132%和100%。

表1 油菜秸稈和菌劑對土壤理化性質的影響Table 1 The effect of rape straw and microbial agents on soil properties

2.2 油菜秸稈和菌劑的施用對土壤微生物多樣性的影響

通過高通量測序共產生389 152條有效序列，平均每個樣品含有43 239條序列。所有樣品覆蓋度指數（Good's coverage value）在97%相似度下均大于99%，說明測序深度足以評價該土壤微生物多樣性。

與CK處理相比，GSL和B_GSL處理對Shannon多樣性指數和Shannoneven均勻度指數影響不顯著，而顯著提高了土壤微生物ACE和Chao1兩種豐富度指數（圖1）。與CK處理相比，GSL處理中ACE和Chao1指數分別提高了7.1%和8.7%，B_GSL處理分別提高了4.3%和5.7%。不同處理的細菌多樣性分析結果如圖2所示，其中第一排序軸代表細菌58.29%的群落組成變異，而第二排序軸代表細菌17.33%的群落組成變異。GSL處理和B_GSL處理細菌群落組成相似，但顯著區別于CK處理，說明添加油菜秸稈以及油菜秸稈和菌劑混施顯著改變了細菌群落組成。

圖1 油菜秸稈和菌劑對微生物α-多樣性指數的影響Figure 1 The effect of rape straw and microbial agents on microbial diversity

圖2 主坐標分析油菜秸稈和菌劑對微生物群落的影響Figure 2 Principal coordinates analysis（PCoA）of the effect of rape straw and microbial agents on soil microbial community composition

2.3 油菜秸稈和菌劑的施用對土壤微生物群落組成的影響

試驗土壤中的優勢菌門為變形菌門（Proteobacteria），占所有細菌的34.4%～36.9%，其次為綠彎菌門（Chloroflexi），占所有細菌的9.4%～11.9%，其他菌門中的放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）分別占所有細菌的8.0%～10.1%、6.8%～10.6%、8.0%～10.4%和6.8%～7.8%。

在綱水平上，GSL和B_GSL處理改變了微生物的相對豐度（圖3）。GSL和B_GSL處理顯著提高了Bacteroidia、Deinococci、Deltaproteobacteria、Anaerolineae、Sericytochromatia和Parcubacteria的相對豐度，而降低了Saccharimonadia、Rhodothermia的相對豐度。GSL和B_GSL處理中Bacteroidia菌綱的相對豐度比CK處理分別高77.0%和51.0%，而Saccharimonadia菌綱的相對豐度比CK處理低67.2%和68.2%。

圖3 油菜秸稈和菌劑添加對微生物相對豐度組成的影響（綱水平）Figure 3 The effect of rape straw and microbial agents on relative abundance of microbial taxa（at class level）

在屬水平上，分析了相對豐度前30的物種（圖4），發現GSL和B_GSL處理提高了、、、、、、和的相對豐度，而降低了、、、、、和的 相對豐度。

圖4 油菜秸稈和菌劑添加對微生物相對豐度組成的影響（屬水平）Figure 4 The effect of rape straw and microbial agents on relative abundance of microbial taxa（at genus level）

2.4 油菜秸稈和菌劑的施用對土壤功能的影響

FAPROTAX是基于比對微生物群落結構和功能的數據庫，能夠在不可觀測的情況下推測出生物群落的功能狀況。利用平均數差異顯著性檢驗兩兩比對各處理對土壤微生物群落功能的影響，結果發現（圖5），與CK處理相比，GSL處理顯著提高了硝酸鹽呼吸和氮呼吸的功能，而對其他功能影響不顯著；B_GSL處理除了顯著提高硝酸鹽呼吸和氮呼吸的功能外，還顯著提高了甲醇氧化、反硝化作用等功能，顯著降低了好氧氨氧化、硝化作用的功能。以上研究結果表明，添加菌劑提高了油菜秸稈在土壤中功能的發揮。

圖5 平均數差異顯著性T檢驗檢驗不同處理間土壤功能變化Figure 5 Student's T test the functional difference between treatments

3 討論

3.1 淹水條件下添加油菜秸稈和菌劑改變了土壤理化性質

淹水條件下添加油菜秸稈和菌劑提高了土壤pH，尤其是單獨添加油菜秸稈使土壤pH提高了0.88個單位。該研究結果與CHEN等利用單獨淹水以及淹水條件下添加有機物的研究結果一致，說明淹水條件下添加有機物（如油菜秸稈等）能夠緩解因長期耕作引起的土壤酸化問題。另外，油菜秸稈添加（GSL和B_GSL處理）提高了土壤有機質含量，該研究結果與胡宏祥等的研究結果一致，說明淹水條件下添加有機物料和菌劑有利于土壤有機質的快速增加。但本試驗結果表明油菜秸稈以及菌劑對土壤中有效態養分元素含量的影響較小（堿解氮和速效鉀），甚至有降低的趨勢。該研究結果與LU等在水稻田中種植油菜綠肥的研究結果一致，可能是因為淹水處理使土壤中的有效態養分溶解，并在后期隨水排出。該研究結果可能還與油菜組織被破壞后釋放的異硫氰酸鹽改變了土壤中與氮循環相關的微生物群落結構有關。

3.2 淹水條件下添加油菜秸稈和菌劑提高了土壤微生物豐富度

淹水條件下添加油菜秸稈以及油菜秸稈和菌劑混合施用對多樣性指數（Shannon）和均勻度指數（Shannoneven）影響不顯著（＞0.05），但顯著提高了微生物的豐富度指數（Chao1和ACE指數），該結果與長期油菜秸稈還田的水稻土壤的研究結果一致，說明油菜秸稈作為一種功能型修復材料能夠提高土壤微生物豐富度，并對土壤健康以及土壤的抑病性具有重要作用。其原因可能是GSL以及B_GSL處理通過改變土壤的理化性狀以及生境提高了豐度較低微生物的豐度，使其能夠被現代分子生物學技術檢測到。另外，B_GSL處理比GSL處理的豐度低，該研究結果與WANG等的研究結果一致，可能是因為促腐促生菌劑的添加降低了土壤的pH（表1），而土壤pH與微生物的豐富度成反比關系。

3.3 淹水條件下添加油菜秸稈和菌劑改變了土壤微生物群落結構

本研究結果表明施用油菜秸稈以及油菜秸稈和菌劑混施處理中土壤微生物群落結構存在較大差異。在綱水平上，添加油菜秸稈以及油菜秸稈和菌劑混合施用顯著提高了Deltaproteobacteria（δ-變形菌綱）的相對豐度，GSL處理比CK處理提高121%，而B-GSL處理提高了168%。δ-變形菌綱是典型的r-策略微生物，具有快速生長和快速降解土壤中有機物質等特性，對土壤物質流動和能量循環具有重要作用。另外，添加油菜秸稈還提高了Bacteroidia（擬桿菌綱）和Deinococci（異常球菌綱）的豐度，該研究結果與WANG等施用生物消毒劑提高了擬桿菌門等的結果一致。

在屬水平上，施用油菜秸稈以及油菜秸稈和菌劑混施提高了（特呂伯菌屬）和Xanthomonadaceae（黃單胞菌科）中的多數菌屬，如（溶桿菌屬）、（熱單胞菌屬）、（沙單胞菌屬）等。特呂伯菌屬在能夠抑制西紅柿枯萎病的土壤中廣泛存在，說明特呂伯菌屬可能對抑制土傳病害病原菌——尖孢鐮刀菌具有很好的作用。黃單胞菌屬中的很多種類能夠產生揮發性有機物，這些物質能夠抑制土壤病原菌的生長。另外，研究表明在健康土壤（抑病型土壤）中黃單胞菌屬的豐度較高。本研究結果表明施用油菜秸稈處理（GSL和B_GSL處理）提高了土壤中有益微生物的數量，使土壤微生物的抗病性更強。通過對西瓜藤蔓長度和成活率的測定，同樣發現施用油菜秸稈處理（GSL和B_GSL處理）促進了西瓜生長，提高了西瓜的成活率。其原因可能不僅是提高了有益微生物的豐度，還可能是降低了有害微生物的數量。研究表明土壤中（水崎桿菌）豐度與西瓜的成活率呈顯著負相關關系，這可能解釋了為什么施用油菜秸稈處理顯著提高了西瓜的成活率。本研究發現施用油菜秸稈處理中，水崎桿菌的相對豐度在GSL和B_GSL處理中分別比CK處理低了88.7%和92.7%。另外，與CK處理相比，添加油菜秸稈處理（GSL和B_GSL處理）顯著提高了（固氮弓菌屬）的相對豐度，而降低了（硝化菌屬）等的相對豐度，表明添加油菜秸稈（生物熏蒸劑）可能會對土壤氮循環產生影響。如SENNETT等研究發現生物消毒劑能夠影響土壤硝化作用，減少NO的產生，表明施用油菜秸稈能夠改變土壤的物質流動和能量循環等功能。

3.4 淹水條件下添加油菜秸稈和菌劑改變了土壤功能

近期的研究表明，將十字花科植物中的高硫苷作物殘體施用到土壤中可以改變微生物群落結構以及土壤的功能。例如，SENNETT等發現施用油菜秸稈降低了NO的產生量，改變了土壤中氮循環微生物的豐度。本研究同樣發現油菜秸稈的施用改變了微生物的群落結構和功能。如施用油菜秸稈顯著提高了土壤中與氮代謝相關的功能，使土壤氮呼吸加快，促進了土壤氮代謝。另外，利用平均數差異顯著性檢驗兩兩比較不同處理對土壤微生物功能的影響，發現GSL處理顯著提高了土壤硝酸鹽呼吸和氮呼吸的功能，而對其他功能影響不顯著；而B_GSL處理不僅提高了硝酸鹽呼吸和氮呼吸的功能，還顯著提高了甲醇氧化、反硝化作用等功能，并抑制了好氧氨氧化、硝化作用和芳香族化合物降解等功能。該研究結果與WU等的研究結果一致，即秸稈和微生物菌種混合接種促進秸稈的腐解和秸稈功能作用的發揮。另外本研究結果還與HUANG等、CHEN等接種植物根際促生菌通過改變土壤微生物群落結構促進土壤氮循環相關功能、減弱微生物群落功能的氮損耗、加強土壤有機質積累等結果一致。這些研究以及本研究的結果均表明添加油菜秸稈的同時接種菌劑比單獨添加油菜秸稈更能促進油菜秸稈功能的發揮。

4 結論

（1）淹水條件下施用油菜秸稈以及油菜秸稈和菌劑混施改變了設施化栽培土壤的理化性質，提高了土壤有機質含量，緩解了土壤酸化問題。

（2）淹水條件下施用油菜秸稈以及油菜秸稈和菌劑混施可以提高土壤微生物的豐富度，改變微生物的群落結構及功能。

（3）在施用油菜秸稈的同時添加功能菌劑可以促進油菜秸稈對土壤改良作用的發揮，提高土壤硝酸鹽呼吸、氮呼吸、甲醇氧化、反硝化作用等功能，降低好氧氨氧化、硝化作用和芳香族化合物降解等功能。