叢枝菌根真菌減少污染土壤Cd淋溶流失的效應研究

張金秀，蘇琳，蔣明，李明銳，王燦，何永美，陳建軍，湛方棟*

（1.云南農業大學資源與環境學院，昆明 650201；2.昆明市生態環境科學研究院，昆明 650032；3.中國冶金地質總局昆明地質勘查院，昆明 650203）

由于金屬礦產開采冶煉、污水灌溉和污泥施用等工農業生產活動，農田土壤重金屬污染日益嚴重，成為全球重大環境問題之一。鎘（Cd）是農田土壤常見的污染元素，具有較強的活性與遷移能力，易隨水體淋溶流失。在灌溉、降雨等情形下，污染農田土壤Cd離子發生淋溶流失，遷移到周邊水體中，進而導致流域水體Cd污染。因此，污染土壤的Cd淋溶流失問題引起了普遍關注。

叢枝 菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是土壤中重要的微生物，即使在重金屬嚴重污染的土壤中，AMF也普遍存在。AMF侵染寄主植物根系后，根外菌絲在土壤中分枝延伸形成龐大的菌絲網絡，其生態學作用引起人們的廣泛關注。AMF菌絲在土壤中能迅速分解轉化，顯著改變土壤結構和理化性質，對土壤Cd等元素的環境行為與生態效應產生重大影響。然而，這方面的研究主要集中在AMF增強植物對Cd的耐受性、影響Cd在土壤-植物系統中遷移上，但對AMF影響污染土壤Cd的淋溶流失及其作用機制的了解很有限。

土壤團聚體組成會顯著影響污染土壤Cd的淋溶流失。其中，大團聚體是由微團聚體黏合而成的一類比表面積大、多孔的土壤團粒結構，其黏附力遠大于環繞在周圍的微小團粒。大團聚體對土壤養分和水分具有較好的固持作用，且對Cd離子具有較強的吸附作用，有助于減少污染土壤Cd的淋溶流失。值得注意的是，AMF能夠通過菌絲纏繞、分泌球囊霉素相關蛋白（Glomalin related soil protein，GRSP）等作用促進土壤團聚體的形成。因此，AMF可能會通過影響污染土壤的團粒組成，改變土壤Cd的淋溶流失，這為研究AMF影響污染土壤Cd淋溶流失的可能機制提供了思路。

本文以云南典型的鉛鋅礦區周邊Cd污染農田土壤為供試基質，制備高度為40 cm的土柱，以玉米為寄主植物，設置接種和不接種AMF處理，開展土壤淋溶試驗，研究AMF對玉米生長、Cd吸收、土壤團粒組成、壤中流Cd濃度與Cd淋溶流失的影響，分析土壤團粒組成與壤中流Cd濃度、Cd淋溶流失間的關系，以闡釋AMF影響污染土壤Cd淋溶流失的效應及其初步機制，豐富對污染土壤中AMF的生態功能及其作用機制等方面的認識。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試玉米（L）為會單4號，購于云南省昆明市小板橋種子市場，所選種子籽粒飽滿且大小一致。AMF供試菌種為摩西斗管囊霉（），其菌種保藏號為BGC YN05，1511C0001BGCAM0013，由北京市農林科學院植物營養與資源研究所提供，主要由土壤顆粒、孢子和細根段組成。

供試土壤采自云南省蘭坪鉛鋅礦（26°22'30.0″N，99°22'27.6″E）周邊污染農田，其基本理化性質如下：pH為6.11，有機質為32.12 g·kg，Cd和Pb全量分別為4.27 mg·kg和68.29 mg·kg，全氮和全磷含量分別為2.87 g·kg和1.58 g·kg，堿解氮和速效磷含量分別為72.54 mg·kg和58.03 mg·kg。土壤采回后，經自然風干，剔除雜物，搗碎研磨后過2 mm尼龍篩混勻，將土壤放入蒸汽高壓滅菌鍋，121℃高溫滅菌120 min后，常溫條件放置3 d待用。

1.2 試驗處理

2018年6 月，在云南農業大學試驗大棚內開始土柱試驗。試驗土柱為直徑110 mm、高45 cm的聚氯乙烯（PVC）管；采用滅菌土壤裝填土柱，每個土柱土壤裝填量為4.0 kg（圖1）。土柱底端封閉，設置1個出水閥，用于收集淋溶液；在土柱的10、20 cm和30 cm深度處設置壤中流取樣點，用于采集壤中流樣品。

圖1 試驗裝置與取樣位置示意圖Figure 1 Schematic diagram of test device

玉米種子首先在1%次氯酸鈉（NaClO）溶液中浸泡1 min，然后移入75%的乙醇溶液中浸泡3 min，取出后用無菌水沖洗3次，完成玉米種子的表面消毒。將玉米種子置于墊有浸濕濾紙的無菌培養皿中，25℃下恒溫培養4 d，待種子萌發冒白2 cm左右，挑選無污染且生長一致的萌發種子進行種植。

試驗設不接種AMF（CK）和接種AMF（AMF）2組處理，每組處理6個平行。先在土柱中裝入3.5 kg滅菌土，AMF處理將40 g AMF菌劑平鋪在土柱中，CK處理則加入40 g AMF滅活菌劑；種植2粒玉米種子，再均勻加入500 g滅菌土，以覆蓋玉米種子（圖1）。土柱試驗過程中不施用化肥和農藥，自然光照，溫室溫度為14～29℃；期間根據土柱土壤水分狀況澆灌去離子水20～30 mL，保持土壤濕潤。

1.3 樣品采集

在玉米種植第45天和第50天，進行人工灌溉，開展淋溶試驗。每次灌溉量為2.0 L，每15 min澆灌去離子水500 mL，共澆灌4次，相當于33.3 mL·min的降雨強度。

在澆灌開始后，打開土柱底部的出水閥，收集土柱產生的淋溶液，直至出水閥不產生水滴，使用容量筒測量淋溶液體積。澆灌30 min后，采用0.25μm陶瓷濾管（RHIZON MOM 19.21.21F）負壓抽取深度為10、20 cm和30 cm的土柱土壤溶液50 mL。

第2次土柱淋溶試驗后，采集玉米植株與根際土壤樣品。將玉米整株取出，抖去根部附著的疏松土壤，采集與根系緊密結合的根際土壤（厚度約為1 mm），室內自然風干、研磨后備用。將玉米植株分為地上部（莖葉）和地下部（根系），分別用無菌水漂洗干凈、晾干；除選取少量細根用于AMF侵染率指標測定外，玉米植株于105℃殺青30 min，再經75℃烘干72 h至恒質量，獲得植株干質量，碾磨粉碎備用。

1.4 測定方法

將根系鮮樣剪成1 cm左右的根段，堿解離、藍墨水染色后，采用曲利苯藍染色改良法測定AMF的侵染率。采用蔗糖離心法測定AMF孢子數：稱取10.0 g土樣，反復沖洗過0.25 mm篩，將殘留物轉移至100 mL的離心管中，3 000 r·min離心10 min，去掉上清液后加入50%蔗糖溶液，充分搖勻，3 000 r·min離心10 min得到上清液，用濾紙過濾上清液，在立體顯微鏡下觀察濾紙上AMF孢子的數量。

稱取1.0 g風干土樣，在0.11 MPa、121℃條件下，采用20 mmol·L檸檬酸緩沖液（pH 7.0）提取30 min，得到易提取球囊霉素相關蛋白（Easy extractive glomalin related soil protein，EE-GRSP）的待測液；50 mmol·L檸檬酸鈉緩沖液（pH 8.0）提取60 min，連續提取3次，得到總球囊霉素相關蛋白（Total glomalin related soil protein，T-GRSP）的待測液。采用Braford法測定土壤EE-GRSP和T-GRSP的含量。

稱取過2 mm篩的風干土樣30 g，放置于土壤團粒分析儀中，套篩孔徑依次為0.85、0.25 mm和0.075 mm，采用濕篩法分離不同粒徑的土壤團聚體，于105℃下烘至恒質量，分別稱量，獲得粒徑（）＞0.85、0.25～0.85、0.075～0.25 mm和＜0.075 mm的土壤團聚體含量。

稱取1.0 g土樣，采用0.1 mol·LHCl浸提-火焰原子分光光度法測定土壤有效態Cd的含量。稱取0.5 g植株干樣，采用HSO-HO消解-凱氏定氮法-釩鉬黃比色法測定植株全氮和全磷的含量。稱取0.1 g植株干樣，采用HNO-HClO消解-火焰原子吸收分光光度法測定植株的Cd含量。

吸取10 mL壤中流或20 mL淋溶液，采用HNO-HO消解，石墨爐原子吸收法測定溶液的Cd濃度。將淋溶液Cd濃度乘以其體積，獲得土柱Cd的淋溶流失量。

1.5 統計分析

采用Microsoft Excel 2018對數據進行處理，用SPSS 23.0軟件進行數據統計分析；用LSD法檢驗處理間差異顯著性，＜0.05為顯著，＜0.01為極顯著；采用Person法分析相關性，用OriginPro 9.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 玉米根系AMF侵染特征

AMF在玉米根系中的結構見圖2。經檢測，接種AMF土壤的根系侵染率為25%，菌絲密度為28.36 cm·g，孢子數為18.82個·g。

圖2 AMF在玉米根系中的結構Figure 2 Typical structures of AMF in maize roots

由圖3可知，與CK相比，AMF處理0～10 cm和10～20 cm土層土壤EE-GRSP含量顯著上升，分別增加24%和33%，0～10、10～20、20～30 cm和30～40 cm土層土壤T-GRSP含量分別顯著增加44%、36%、16%和11%。綜上可知，重金屬脅迫下接種AMF能不同程度增加0～40 cm不同土層土壤中EE-GRSP和TGRSP的含量。

圖3 接種AMF對土壤球囊霉素相關蛋白含量的影響Figure 3 Effects of AMF on contents of GRSP in soil

2.2 接種AMF對土壤團聚體粒徑分布的影響

由圖4可知，與CK相比，AMF處理0～10、10～20 cm和30～40 cm土層土壤中＞0.85 mm團聚體含量分別顯著增加28%、46%和13%，0～10、20～30 cm和30～40 cm土層土壤中0.85 mm＞＞0.25 mm團聚體含量分別顯著增加10%、22%和55%。而與CK相比，AMF處理0～40 cm土層土壤中0.25 mm＞＞0.075 mm團聚體含量均顯著降低，降幅為10%～12%，0～10 cm和10～20 cm土層土壤中＜0.075 mm團聚體含量分別顯著降低13%和16%。綜上可知，重金屬脅迫下土壤接種AMF能增加土壤＞0.25 mm團聚體含量，降低＜0.25 mm團聚體含量。

圖4 接種AMF對不同土層土壤不同粒徑團聚體含量的影響Figure 4 Effects of AMF on aggregate contents in soil

2.3 接種AMF對土壤有效態Cd含量和植物Cd吸收量的影響

由圖5可知，與CK相比，AMF處理0～10、10～20 cm和30～40 cm土層土壤中有效態Cd含量分別顯著降低26%、16%和27%，表明接種AMF能不同程度降低土壤不同土層的有效態Cd含量。

圖5 接種AMF對不同土層土壤有效態Cd含量的影響Figure 5 Effects of AMF on available Cd contents in soil

由表1可知，與CK相比，AMF處理玉米地上部生物量顯著增加36%，地上部和地下部Cd含量分別顯著降低45%和40%，地上部和地下部Cd吸收量分別顯著降低25%和31%。

表1 接種AMF對玉米Cd含量和累積量的影響Table 1 Effects of AMF inoculation on biomass，Cd content and accumulation in maize

2.4 接種AMF對壤中流Cd含量的影響

由圖6可知，與CK相比，第一次淋溶試驗后，AMF處理0～10 cm和20～30 cm土層的壤中流Cd含量顯著降低20%和23%，第二次淋溶試驗后，AMF處理10～20 cm和20～30 cm土層的壤中流Cd含量顯著降低22%和14%。表明重金屬污染脅迫下土壤接種AMF能減少不同土層壤中流的Cd含量。

圖6 接種AMF對壤中流Cd含量的影響Figure 6 Effects of AMF on Cd concentrations in interflow

2.5 接種AMF對Cd淋溶流失的影響

由表2可知，與CK相比，第一次淋溶試驗后，AMF處理對淋溶液Cd含量和Cd流失量均沒有顯著影響；第二次淋溶試驗后，AMF處理下淋溶液Cd含量和Cd流失量分別顯著降低30%和34%；第二次淋溶試驗后，AMF處理下淋溶流失總量降低29%。表明接種AMF能減少淋溶液中有效態Cd含量與流失量。

表2 接種AMF對土壤Cd含量和流失量的影響Table 2 Effects of AMF inoculation on Cd content and loss in soil

2.6 相關性分析

由表3可知，＞0.85 mm的團聚體含量與壤中流Cd含量呈顯著負相關；0.85 mm＞＞0.25 mm的團聚體含量與T-GRSP呈顯著正相關，與壤中流Cd含量和Cd淋溶流失量呈極顯著負相關；0.25 mm＞＞0.075 mm的團聚體含量與Cd淋溶流失量呈顯著正相關；＜0.075 mm的團聚體含量與T-GRSP和EE-GRSP含量呈顯著負相關，與Cd淋溶流失量呈顯著正相關。土壤有效態Cd含量與壤中流Cd含量和Cd淋溶流失量分別呈極顯著與顯著正相關。

表3 GRSP、淋溶液Cd含量、Cd流失量與土壤水穩態團聚體、有效態Cd含量的相關性Table 3 Correlations between contents of available Cd and GRSP，Cd concentration in interflow and leachate with contents of aggregate and available Cd in soil

3 討論

在重金屬脅迫下，與CK相比，接種AMF土壤的T-GRSP和EE-GRSP含量顯著增加，土壤有效態Cd含量顯著降低。GRSP是AMF代謝分泌的一類糖蛋白，能與土壤中重金屬結合，改變重金屬的生物有效性，GRSP含有的芳香烴、羥基等不穩定活性官能團，能夠通過離子交換吸附-配合-共沉淀作用，促使土壤中的重金屬由離子態向殘渣態轉變。有研究表明，GRSP能固定土壤中Cd、Pb等重金屬離子，且GRSP與土壤有效態Cd、Pb含量呈負相關，其結果與本試驗研究結果一致。

本試驗中，在重金屬脅迫下，接種AMF后，0～40 cm土層的＞0.25 mm團聚體含量顯著高于CK。AMF侵染寄主植物后形成的發達的根外菌絲與其分泌物GRSP的機械纏繞，聯合腐植酸類物質的超強黏合作用將土壤顆粒纏繞黏合形成土壤團聚體。菌絲、GRSP以及腐植酸在團聚體穩定性中扮演著重要的角色，其能將小土壤顆粒黏成＜0.25 mm的微團聚體，進而形成水穩態團聚體（＞0.25 mm）。有學者研究不同真菌對土壤結構的影響發現，土壤接種AMF后穩定性團聚體含量遠高于微團聚體含量；有學者研究接種不同真菌對水穩性大團聚體形成的作用得出，接種真菌的土壤形成水穩性大團聚體的含量顯著高于未接種土壤。但目前對于團聚體的形成因素中，AMF根外菌絲、GRSP以及腐植酸類物質哪種因素占主導地位或者為主要因素還未有準確結果，還需進一步驗證。

本研究結果表明，與CK相比，接種AMF后，0～40 cm土層的＞0.25 mm團聚體含量顯著增加，0～40 cm土層土壤有效態Cd含量顯著下降。這可能是由于不同粒徑團聚體對土壤中重金屬吸附固定作用有明顯的差異，此外，不同粒徑土壤團聚體中AMF菌絲、GRSP以及腐植酸類物質含量不同以及團聚體結構也存在差異。接種AMF能改善土壤團聚體的水穩定性，吸附固定土壤有效態重金屬。團聚體是農田土壤中重金屬吸持的關鍵因素，0.2～2 mm粒徑的團聚體能夠集聚大量的植物根系以及腐植酸類物質等，對重金屬有很強的吸附固持能力。

土壤中游離態Cd離子極易在土壤中遷移流動，在灌溉、降雨、降雪等淋溶作用下，Cd離子下滲到地下水，或擴散到流域出水口，影響地下水水質，擴大農田土壤Cd污染面積。降低Cd的移動性，將Cd固定在土壤中以減少Cd的流失量是解決Cd流失的關鍵性因素。GRSP是菌根共生體分泌物，含有大量土壤有機質、多環芳烴以及陰離子基團，其特殊的組成結構能改變土壤中有效態重金屬的生物有效性，將游離態金屬離子轉變為殘渣態金屬沉淀物。大量相關研究表明，重金屬脅迫下，接種AMF后能降低土壤環境中重金屬的生物有效性，其分泌的GRSP能夠固定土壤中的Cd；當土壤中Cd含量較高時，GRSP對Cd的固定量也較高。本研究結果表明，重金屬污染脅迫下，接種AMF土壤的GRSP濃度顯著上升，不同土層土壤有效態Cd含量顯著降低。

不同粒徑的土壤團聚體對土壤中Cd吸收率和淋溶流失的影響存在差異。＞0.25 mm的水穩性團聚體具有多孔性、比表面積大等特性，且富含大量的腐植酸類物質，能夠增加對Cd離子的吸附-絡合-螯合等作用，從而改變重金屬Cd在土壤中的存在形態，將游離態Cd固定在土壤中，減少Cd的淋溶流失。有研究表明，＞0.25 mm的水穩態團聚體吸附有效態重金屬的效率顯著高于＜0.25 mm的微團聚體，能使淋溶液中的有效態重金屬含量降低，重金屬流失量減少。本研究結果顯示，0～40 cm土層水穩態團聚體含量顯著增加，兩次淋溶0～30 cm土層壤中流有效態Cd含量顯著降低，第二次淋溶的淋溶液中有效態Cd含量和流失量均顯著降低，且Cd淋溶流失量與＞0.25的團聚體含量呈顯著負相關，與＜0.25 mm的團聚體含量和土壤有效態Cd含量呈顯著正相關。綜上可知，重金屬污染脅迫下，接種AMF能增加土壤水穩態團聚體含量，降低淋溶液中有效態Cd濃度和流失量。

4 結論

（1）重金屬污染脅迫下，接種叢枝菌根真菌能夠降低土壤中有效態Cd含量，從而減少土壤有效態Cd在玉米體內的富集，緩解重金屬對植物的毒害，促進植物生長。

（2）接種叢枝菌根真菌能夠強化土壤對壤中流Cd的固持效應，降低壤中流有效態Cd濃度，從而減少灌溉等淋溶作用下土壤Cd的流失量和擴散效應。