青菜對三種土壤中典型抗生素的累積規律研究

王莉莉，孫浩，汪浪浪，李學德，2*

（1.安徽農業大學資源與環境學院，合肥 230036；2.農業農村部合肥農業環境科學觀測實驗站，合肥 230036）

磺胺類抗生素（SAs）和四環素類抗生素（TCs）在畜禽養殖業中廣泛用于治療或預防動物疾病，以提高動物生長速度和飼料轉化率。我國每年抗生素生產量約為21萬t，其中46.1%用于畜禽養殖業。據報道，畜禽攝入的抗生素約有30%～90%以原藥或代謝產物的形式排出體外，畜禽糞便的施用是造成蔬菜等農產品中獸用抗生素污染的重要途徑。有研究調查了65種抗生素在我國土壤中的空間分布，發現土壤中抗生素的檢出率非常高，有些農業土壤中抗生素的殘留濃度超過了歐盟規定的風險閾值（100μg·kg），如上海黃浦江上游養殖場附近土壤中四環素含量高達1 870～2 450 μg·kg，江蘇徐州施過畜禽糞便后的土壤中土霉素的最大檢出濃度為8 400 μg·kg。進入土壤中的抗生素，對生態環境和人類健康構成潛在威脅。研究表明，蔬菜能吸收累積土壤中的抗生素，如小白菜和白蘿卜可吸收土壤中的四環素和土霉素、菠菜和卷心菜可吸收土壤中的磺胺二甲嘧啶等。植物根際環境是植物與土壤之間進行物質交換的“橋梁”，也是污染脅迫的優先場所。抗生素被蔬菜的根系吸收后，主要沿蒸騰途徑分布在植物的不同部位。進入蔬菜中的抗生素通過食物鏈威脅人類健康，受到人們的廣泛關注。

土壤對抗生素的吸附性強弱是影響其遷移等環境行為的重要因素之一。研究表明，SAs在土壤中的吸附系數極低，比TCs具有更高的流動性，因此SAs具有更高的生物可利用性和淋溶性，以及轉移到各種環境和食物鏈的可能性。由此可見，土壤對抗生素的吸附作用越強，抗生素向地表水、地下水及植物中的遷移能力越弱。不同類型土壤的理化性質不同，青菜從不同類型土壤中吸收累積抗生素的差異性卻鮮見報道。本研究通過土壤盆栽試驗，研究了3類土壤中4種典型抗生素在青菜中的累積規律，探討了其影響機制，以期為土壤中抗生素的健康風險評估提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

試驗所用土壤包括砂姜黑土、黃褐土和紅壤，均為0～20 cm的耕作層土壤，土壤經風干、剔除雜草、石塊等雜質后磨碎過2 mm篩備用。砂姜黑土采自安徽農業大學皖北試驗站（宿州），pH 7.92，陽離子交換量17.40 cmol·kg，有機質含量32.50 g·kg；黃褐土采自安徽農業大學農萃園，pH 6.97，陽離子交換量14.60 cmol·kg，有機質含量11.10 g·kg；紅壤采自安徽省宣城市寒亭鎮，pH 5.81，陽離子交換量9.31 cmol·kg，有機質含量7.59 g·kg。經檢測表明這三類土壤中均不含四環素、土霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑的殘留。

1.2 供試蔬菜

選用人們經常食用的青菜為供試蔬菜，品種為上海青（合肥豐樂種業有限公司）。

1.3 藥品與試劑

磺胺二甲嘧啶（SM），純度≥99%，薩恩化學技術（上海）有限公司；磺胺甲噁唑（SMZ），純度≥98%，上海麥克林生化科技有限公司；四環素（TC），純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；土霉素（OTC），純度≥98%，上海泰坦科技股份有限公司，理化性質見表1；甲醇、乙腈、甲酸為HPLC級，其余試劑為分析純；實驗用水為超純水（美國Millipore公司）。

表1 供試抗生素的理化性質Table 1 Physicochemical properties of tested antibiotics

1.4 儀器設備

超高效液相色譜串聯質譜儀（Xevo TQ MS，美國Waters公司）；高效液相色譜儀（Agilent1200，美國安捷倫公司）；氮吹儀（EFAA-DC24，上海安譜實驗科技股份有限公司）；振蕩器（WHY-2，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）；離心機（TG20C，長沙英泰儀器有限公司）。

1.5 試驗方法

1.5.1 盆栽試驗方法

本研究采用土壤盆栽試驗，在安徽農業大學資源與環境學院植物培養室中進行。試驗所用的塑料小盆缽，上緣直徑15 cm，底面直徑12 cm，高11 cm。

青菜對三類土壤中抗生素的累積動態及生物量隨時間的變化：將4種抗生素（SMZ、SM、TC、OTC）的標準混合液分別添加到三類土壤（黃褐土、砂姜黑土、紅壤）中，充分混勻，使得同類土壤中每種抗生素的初始含量均為1.0 mg·kg，放在培養室中平衡老化一周（期間每隔1 d翻動混勻一次），裝盆，1.0 kg·盆，每盆施入復合肥（N∶P∶K為15∶15∶15）0.5 g，將生長一致的青菜苗（單株鮮質量5 g左右）移栽入盆，每盆3棵。試驗期間每隔2 d澆一次水（每盆50 mL）。分別在青菜移栽后第5、7、10、20天和30天取樣測定青菜中4種抗生素的濃度。同類土壤中均有15盆盆栽，到相應取樣天數時，每次取3盆。

三類土壤中抗生素種類和初始含量對青菜累積抗生素的影響：將不同含量的4種抗生素標準混合溶液分別與三類土壤充分混合均勻，使得同類土壤中每種抗生素的初始含量分別為0.1、0.5、1.0、5.0 mg·kg和25.0 mg·kg，其余步驟同上，在青菜移栽后第10天取樣測定青菜和土壤中4種抗生素的含量。每個處理設3個平行。

青菜連根取出后，用純水反復清洗根部，擦干水分，立即測定全株生物量，然后去除根部，將青菜可食部分勻漿，備用。每盆土壤混合均勻，取樣制備土壤樣品。

1.5.2 三類土壤對4種抗生素的等溫吸附試驗

參考有關文獻及預試驗，將磺胺類和四環素類抗生素在土壤中的吸附設置成不同的土液比和濃度梯度。吸附試驗參照批量平衡試驗方法進行，具體如下：

SMZ、SM的吸附試驗：吸附試驗在0.01 mol·LCaCl背景電解質中進行，土液比1∶5，分別稱取4.0 g砂姜黑土、黃褐土、紅壤，加入20 mL抗生素混合液（SM、SMZ），設置抗生素混合液濃度梯度：1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、15.0 mg·L。25℃下，180 r·min振蕩24 h，3 500 r·min離心5 min，過0.22 μm濾膜，供高效液相色譜儀測定。

TC、OTC的吸附試驗：吸附試驗在0.01 mol·LCaCl背景電解質中進行，土液比1∶100，分別稱取0.25 g砂姜黑土、黃褐土、紅壤，加入25 mL抗生素混合液（TC、OTC），設置抗生素混合液濃度梯度：10.0、15.0、20.0、30.0、50.0、80.0 mg·L，其余步驟同上。

1.6 樣品處理與分析

1.6.1 青菜和土壤中抗生素含量的測定

稱取5.0 g樣品（青菜/土壤）于50 mL離心管中，加入提取劑（青菜樣品加入10 mL、土壤樣品加入8 mL）0.1 mol·LNaEDTA-Mcllvaine（pH=4.0±0.01）緩沖溶液∶甲醇=1∶1，300 r·min、25℃下恒溫振蕩120 min，3 500 r·min離心10 min，倒出上清液，其中青菜樣品重復提取1次，土壤樣品重復提取2次，用Mcllvaine緩沖溶液定容至25.0 mL，再取5.0 mL加入含有分散固相萃取材料（60.0 mg PSA、25.0 mg C、250.0 mg MgSO）的離心管中，于多管振蕩器上渦旋1 min，10 000 r·min離心5 min，吸取2.0 mL上清液于玻璃離心管中，在35℃水浴中氮吹至近干，用1%甲酸溶液定容1.0 mL，過0.22μm濾膜，供UPLC-MS/MS測定。

儀器檢測條件色譜柱ACQUIT UPLC HSS T3（2.1×50 mm 1.8μm），柱溫35℃，流動相A為0.1%甲酸，流動相B為乙腈+0.1%甲酸，梯度洗脫：0～0.25 min，95.0%A；0.25～3.00 min，95%A；3.00～3.50 min，10%A；3.50～3.51 min，90%A；3.51～5.00 min，90%A。流速0.35 mL·min，進樣量5μL。質譜條件：多反應檢測模式（MRM）；電噴霧離子源，正離子掃描（ESI+）；反錐氣流量100 L·h；脫溶劑氣流量1 000 L·h；離子源溫度150℃；脫溶劑氣溫度500℃；毛細管電壓1 kV。目標物的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量等質譜多反應檢測條件如表2所示。

表2 不同種類抗生素的質譜分析參數Table 2 Mass spectrometric analysis parameters of different types of antibiotics

采用加標回收法測定了方法的準確度和精密度，在10.0、100.0、1 000.0 μg·kg加標濃度范圍內，4種抗生素在青菜、土壤中的回收率均在70.21%～117.32%之間，相對標準偏差為0.71%～20.70%。

1.6.2 土壤中抗生素有效態含量的測定

采用0.1 mol·LCaCl溶液作為提取劑，土液比為2∶8，振蕩提取30 min，3 500 r·min離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜，供UPLC-MS/MS測定，測定條件同上。

1.6.3 吸附試驗土壤上清液中抗生素濃度的測定

色譜柱：Eclipse Plus C18（4.6×250 mm，5μm），柱溫：40℃，流動相0.5%甲酸∶乙腈（∶=78∶22），流速1.0 mL·min，進樣量20 μL，VWD檢測器，測定波長為270 nm。

1.6.4 數據分析與處理

運用Excel和Origin 2018進行數據計算和繪圖，差異顯著性分析使用SPSS 21.0。

利用Handerson-hasselbalch（公式1），計算土壤中4種抗生素陰離子和中性分子的比例。

式中：pH為酸堿度；p為解離常數；A為以陰離子形態存在的抗生素；HA為以中性分子形態存在的抗生素（4種抗生素）。在三類土壤pH條件下，不存在陽離子形態。

2 結果與分析

2.1 青菜對三類土壤中抗生素的累積動態及生物量隨時間的變化

圖1為青菜對三類土壤中4種抗生素（初始濃度均為1.0 mg·kg）的累積動態。從圖1可見，青菜對三類土壤中4種抗生素的累積均隨時間的延長先增大后減小，在第10天時達最大含量（13.0～83.3 μg·kg），隨后，青菜中抗生素含量逐漸下降，第20～30天青菜中抗生素含量趨于平緩。

圖1 青菜對不同類型土壤中抗生素的累積動態Figure 1 Dynamics of antibiotic accumulation in different soils of Chinese cabbage

種植于三類土壤中的青菜生物量表現出差異性，從表3可以看出，隨著時間的延長，青菜的鮮質量均逐漸增大，在30 d培養結束后，砂姜黑土中青菜生物量增加35.2 g，黃褐土中青菜生物量增加23.2 g，紅壤中青菜生物量增加15.3 g。

表3 每盆青菜的生物量隨時間的變化（均值±標準差，g）Table 3 Variation of Chinese cabbage biomass over time（Ave±SD，g）

2.2 土壤中抗生素初始含量對其在青菜中累積的影響

為探究土壤中不同初始含量的抗生素在青菜中的累積規律，將土壤中抗生素初始含量設置為0.1、0.5、1.0、5.0、25.0 mg·kg，實驗結果見圖2，在0.1～25.0 mg·kg處理水平下，青菜對4種抗生素的累積均隨土壤中抗生素初始含量的增大而增大，說明土壤中抗生素的初始含量越大，青菜中抗生素的含量也越大，健康風險也越高。土壤中4種抗生素的初始含量均為25.0 mg·kg時，青菜從土壤中累積的4種抗生素含量（58.8～14 993.6μg·kg）顯著高于其他低含量處理組（7.6～3 609.1 μg·kg），而土壤中抗生素的初始含量在0.1～5.0 mg·kg之間時，青菜對抗生素的累積差異不顯著（＞0.05）。

圖2 青菜對土壤中不同初始含量抗生素的吸收（10 d）Figure 2 Uptake of different initial concentrations of antibiotics in soil by Chinese cabbage（10 d）

利用0.1 mol·LCaCl和NaEDTA-McIlvaine溶液為浸提劑可依次得到土壤中抗生素的有效態濃度、吸附態和固定態濃度。土壤中抗生素的有效態濃度是指容易被植物吸收的抗生素，與青菜從土壤中吸收的抗生素含量成正比。從表4可以看出，三類土壤中4種抗生素初始含量由5.0 mg·kg增加到25.0 mg·kg時，土壤中抗生素的有效態含量隨初始含量的增大而顯著增大（＜0.05），因此導致青菜累積抗生素的含量也隨之增大。土壤中的吸附態和固定態含量與有效態含量變化規律一致，且吸附態和固定態含量＞有效態含量，因此，抗生素進入土壤后，吸附態和固定態是土壤中抗生素的主要存在形態。

表4 土壤中吸附態和固定態、有效態抗生素含量（10 d）Table 4 Concentrations of adsorbed，fixed and effective antibiotics in soil（10 d）

2.3 不同類型土壤中同種抗生素在青菜中的累積差異

從圖3可見，青菜從不同類型土壤中累積同種抗生素的難易順序均為紅壤（646.1～14 933.6μg·kg）＞黃褐土（463.5～12 598.1 μg·kg）＞砂姜黑土（58.8～9 510.4 μg·kg）。這可能與不同土壤的理化性質差異有關，抗生素是離子型有機污染物，在不同土壤pH條件下，抗生素的存在形態和比例不同，可能會影響青菜對抗生素的吸收累積。TCs在pH值低于p時主要以陽離子形態存在，介于p和p之間時主要以中性分子形態存在，高于p和p時主要以陰離子形態存在；SAs在pH小于p時主要以陽離子形態存在，介于p和p之間主要以中性分子形態存在，pH大于p以陰離子形態存在。根據三類土壤的pH值及表1中4種抗生素的p值，利用Handerson-hasselbalch公式，計算三類土壤中4種抗生素陰離子和中性分子的比例（表5）。由表5可見，從紅壤到黃褐土、砂姜黑土，隨著土壤pH值的升高，4種抗生素陰離子形態的比例逐漸升高，而中性分子所占的比例逐漸降低，青菜對不同土壤中同種抗生素的累積規律與土壤中抗生素的中性分子所占的比例變化規律一致，可以推測，青菜主要吸收土壤中以中性分子形態存在的抗生素，而不是以陰離子形態存在的抗生素。

表5 不同類型土壤中4種抗生素的形態比例（%）Table 5 Speciation proportions of four antibiotics in different soils（%）

圖3 青菜對不同類型土壤中不同抗生素的吸收累積Figure 3 Uptake of different antibiotics by Chinese cabbage from different soils

抗生素在土壤中的吸附行為，影響其在土壤中的生態毒性、降解、運輸和生物累積。研究表明，抗生素在土壤中的吸附還取決于土壤有機質含量。表6為青菜中4種抗生素的含量與三類土壤中有機質含量的關系，由表6可見，青菜中抗生素的含量與土壤中有機質含量呈線性負相關，均在0.9以上，從紅壤到黃褐土、砂姜黑土，隨著土壤有機質含量的增加，青菜從土壤中吸收抗生素的含量減少。

表6 青菜中抗生素含量（y）與土壤有機質含量（x）關系Table 6 Relationships between antibiotics concentrations in Chinese cabbage and organic matter contents in soils

2.4 同類土壤中不同抗生素在青菜中的累積差異

從圖3可以看出，土壤中每種抗生素的初始含量為25.0 mg·kg時，青菜從紅壤、黃褐土和砂姜黑土中累積4種抗生素的含量順序均為SM（9 510.4～14 993.6μg·kg）＞SMZ（3 666.9～12 199.2 μg·kg）＞OTC（90.5～967.6μg·kg）＞TC（58.8～646.1μg·kg），其中，SM在青菜中的含量最大，是TC的161.9倍（砂姜黑土）。由此可見，土壤中的SAs比TCs更易被青菜吸收累積，健康風險更大，這可能是不同抗生素的理化性質差異所致。

吸附等溫模型是用于描述土壤對有機污染物吸附行為的方程，文獻表明，SAs和TCs在土壤上的吸附均符合Langmuir和Freundlich模型，因此，本研究根據Langmuir模型擬合計算，得到4種抗生素在三類土壤中的吸附參數、、，結果見表7。從表7可以看出，三類土壤對TC和OTC的吸附作用遠大于SM和SMZ，因此，土壤中同種抗生素的初始含量相同時，土壤中TC和OTC的有效含量小于SM和SMZ的有效含量，從而導致青菜對SM和SMZ的累積高于對TC和OTC的累積。

表7 三類土壤對4種抗生素吸附的Langmuir模型擬合參數Table 7 Fitting parameters of Langmuir model for adsorption of four antibiotics on three soils

3 討論

3.1 青菜對三類土壤中抗生素的累積動態及生物量隨時間的變化

青菜能吸收土壤中的抗生素，隨著時間的延長，青菜體內抗生素的含量先增加后降低，在第10天達到最高，與吳詩穎的研究結果一致。這可能是由于一部分抗生素在土壤中發生降解，導致10 d后青菜中抗生素含量逐漸降低，有研究表明抗生素可以通過光解、水解、氧化降解、生物降解等多種途徑降解，另一方面，隨著青菜的生物量逐漸增大，抗生素在青菜中能發生代謝作用、生長稀釋作用，從而導致10 d后青菜對抗生素的累積逐漸減小。在實際的蔬菜種植中，蔬菜在移栽后第10天采收食用具有最大的健康風險。

相較于黃褐土和砂姜黑土而言，種植于紅壤中的青菜生物量最低，有研究表明，酸性土壤影響蔬菜的根系生長及養分的吸收利用，并且青菜也最易從紅壤中吸收抗生素，使紅壤中的青菜更易受到逆境的影響，從而影響青菜的生物量。

3.2 土壤中抗生素初始含量對其在青菜中累積的影響

青菜中累積的抗生素含量隨土壤中抗生素初始含量的升高而升高，其對高含量（25.0 mg·kg）處理的土壤中累積的抗生素含量顯著高于低含量（0.1～5.0 mg·kg）處理的土壤。研究表明，經高含量的抗生素（150.0～1 350.0 mg·kg）處理土壤后，會顯著抑制土壤中的脲酶和根際土中的過氧化氫酶活性，抑制土壤微生物的生長與繁殖，減少土壤細菌和真菌的數量，從而減緩微生物降解抗生素的進程，導致抗生素的有效含量增大，青菜對抗生素的累積也隨之增加，這可能也是青菜從高含量抗生素（25.0 mg·kg）處理土壤中累積抗生素含量顯著高于其他處理組的原因。實驗過程中觀察到從5.0 mg·kg處理開始，青菜植株矮，葉片小，青菜的生長受到抑制。有研究表明，經5.0 mg·kgTC和CTC處理，小白菜芽長和根長生長開始受到抑制，25.0 mg·kgTC和CTC處理對根長的抑制率達72.7%。抗生素對植物生長發育的影響除了與其自身的化學性質、使用劑量有關，還與土壤吸附及植物品種等有關。

3.3 不同類型土壤中同種抗生素在青菜中的累積差異

在土壤中抗生素初始含量相同條件下，酸性土壤（紅壤）中的抗生素更容易被青菜吸收累積，中性土壤（黃褐土）次之，堿性土壤（砂姜黑土）中的抗生素在青菜中的累積含量最低。同種抗生素在不同類型土壤中的累積差異，與土壤的有機質含量和pH有關，土壤中有機質含量越高，抗生素在土壤中的吸附性越強，青菜在此類土壤中累積的抗生素越少，因此，可以通過增施有機肥來增加土壤中的有機質含量，從而減少土壤中的抗生素向蔬菜中遷移。青菜主要吸收以中性分子形態存在的抗生素，可通過調節青菜生長土壤的pH值，以降低土壤中以中性分子形態存在的抗生素的比例，從而減少青菜對抗生素的蓄積。

3.4 同類土壤中不同抗生素在青菜中的累積差異

由于青菜對同類土壤中SAs（SM、SMZ）的累積能力強于TCs（TC、OTC），導致青菜對不同抗生素具有累積差異，一方面是土壤對TCs的吸附能力強于SAs，與TCs分子中含有較多的強極性和離子型官能團有關，導致其在土壤中多次被吸附，TCs分子中的·OH、·CONH和帶正電的—NH（CH）等功能基團，可通過離子鍵橋、表面絡合、靜電作用、陽離子交換和氫鍵作用而被吸附，多種機理的共同作用使TCs表現出較強的吸附能力，SAs的分子結構中只含有苯胺基和酰胺基兩個離子型官能團，在土壤中的吸附作用較弱。另一方面，與不同抗生素的理化性質有關，SMZ和SM的分子要小于TC和OTC，有研究表明，小分子化合物更容易被植物吸收。兩種重要因素導致青菜對SAs吸收能力強于TCs。因此，SAs比TCs具有更大的遷移能力以及進入食物鏈的風險，從而對人類健康和環境造成嚴重威脅。畜禽糞便直接施用于土壤是土壤中抗生素的重要來源，為了防止含抗生素的肥料污染土壤，在施用肥料前實施預處理措施，可降低潛在風險。

4 結論

（1）青菜對土壤（砂姜黑土、黃褐土、紅壤）中4種抗生素的吸收累積上升期為移栽后0～10 d，第10天青菜中抗生素的含量達到最高，10 d后青菜體內抗生素的含量開始下降，第20天后趨于平緩。

（2）青菜可從土壤中吸收抗生素，青菜對4種抗生素的累積皆隨土壤中抗生素初始含量的增大而增大，且從高含量（25.0 mg·kg）處理的土壤中累積的抗生素含量顯著高于低含量（0.1～5.0 mg·kg）處理的土壤。

（3）在土壤中抗生素初始含量相同條件下，青菜從不同類型土壤中累積同種抗生素的難易順序為紅壤＞黃褐土＞砂姜黑土。

（4）在土壤中抗生素初始含量相同時，青菜從同類土壤中累積不同抗生素的強弱順序為磺胺二甲嘧啶＞磺胺甲噁唑＞土霉素＞四環素。