缺氧/復氧誘導心肌細胞分泌高表達miR-208b的外泌體而調控心肌成纖維細胞活化、遷移和鐵死亡

劉圣桂 宋風榮 別自東 鞏傳芬

山東醫學高等專科學校附屬費縣人民醫院心血管內科，臨沂 253400

逐漸有研究發現，外泌體等一些細胞外囊泡能攜帶特異的RNA和蛋白而介導細胞和組織間的通訊，進而參與調控多種重要的生物學事件，例如炎性反應、腫瘤進展、凋亡和鐵死亡等細胞死亡、血管生成和免疫應答等，從而有可能成為疾病診斷的早期標志物及靶向運載藥物的重要載體［1-2］。近年來，有研究表明，心肌細胞和心肌成纖維細胞間也能通過外泌體等進行信息交換，從而影響對方的生物學功能［3-4］。例如，心肌細胞在心肌梗死后能分泌大量的外泌體到血清和細胞間，從而影響疾病的生理病理過程［5］。目前，關于外泌體的研究已成為心臟疾病診治的研究熱點，但目前關于其中的作用機制的研究還不多。已有多項研究表明，各種外泌體中含有豐富的miRNAs，miR-208b就是其中一種［6-7］。miR-208b特異表達于心臟，且參與心肌肥厚、心肌梗死、心肌缺血、心肌纖維化及心力衰竭等多種心血管疾病的調控［7-9］。在多種心血管疾病發生的過程中，心肌組織均會分泌高表達miR-208b的外泌體，進而影響其他細胞的生理過程，從而影響疾病的進展過程［7-8］。但外泌體源性miR-208b是否能影響心肌成纖維細胞的生物學功能，目前研究甚少。另外，鐵死亡是新發現的一種細胞死亡模式，是鐵離子和活性氧（reactive oxygen species，ROS）不斷生成累積而導致的［10］。目前有研究指出，鐵死亡在多種心血管疾病中發揮重要作用，且與成纖維細胞的活化關系密切［11-12］。但miR-208b是否也參與了鐵死亡的調控，目前還未有研究報道。本研究通過缺氧/復氧誘導心肌細胞分泌外泌體，探討外泌體源性miR-208b是否影響心肌成纖維細胞的生物學功能，將為心肌疾病的防治提供新思路和新靶點，同時為外泌體和其來源的miRNAs的臨床應用提供更好的指導作用。

資料與方法

1、細胞培養和缺氧/復氧模型建立

人心肌細胞和人心肌成纖維細胞分別用含5%胎牛血清和雙抗的心肌細胞培養基和成纖維細胞培養基-2進行培養。心肌細胞轉染或不轉染50 nmol/L miR-208b 抑制劑后培養于缺氧條件（含1%氧氣）12 h，然后復氧（正常培養條件）培養12 h。

2、外泌體分離和鑒定

收集細胞培養上清液，在3 000×g下離心15 min，然后通過0.22 μm 膜過濾。用ExoQuick-TC 按照說明書進行分離外泌體，然后通過JEM-2100透射電子顯微鏡觀察外泌體形態。同時，裂解外泌體并進行蛋白質印跡分析，以檢測外泌體標志物CD63和TSG101的表達。

3、細胞轉染和熒光定量PCR（RT-qPCR）

根據試劑說明書，使用Lipofectamine 2000 分別將50 nmol/L miR-208b 抑制劑、miR-208b mimics 和 miRNA 陰性對照（NC）轉染進細胞。然后心肌細胞進行缺氧或缺氧/復氧處理，心肌成纖維細胞加入正常培養心肌細胞源性外泌體（N-Exo）、缺氧/復氧心肌細胞來源的外泌體（H/R-Exo）、鐵死亡誘導劑Erastin（10 μmol/L）或Erastin加H/R-Exo 進行共培養。用miRNeasy Mini Kit 試劑盒提取心肌細胞、外泌體和心肌成纖維細胞的總RNA，接著用M-MLV 逆轉錄酶、oligo（dT）和 random primer（或 miR-208b stem-loop RT primer）將RNA 逆轉錄成cDNA。使用SYBR Green qPCR SuperMix 通過 qRT-PCR 測定 RNA 表達水平。U6 和 GAPDH 被用作 miRNA 和 mRNA 的內部對照，相對表達水平通過 2-ΔΔCt值計算。

4、外泌體攝取檢測

在 37 ℃下用2 μl CellTracker CM-DiI 標記外泌體1 h，用ExoQuick-TC 沉淀DiI 標記的外泌體，然后添加到心肌成纖維細胞中進行共培養12 h。之后，固定并洗滌心肌成纖維細胞，并加入核染色（DAPI）對細胞核進行染色10 min。最后，使用熒光顯微鏡觀察心肌成纖維細胞。

5、Western blot實驗

使用含蛋白酶抑制劑的RIPA buffer 從心肌細胞、外泌體和心肌成纖維細胞中提取總蛋白。使用8% SDS-PAGE分離等量的每個蛋白樣品，并將分離的蛋白轉移到PVDF膜上。使用CD63、TSG101、α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）、谷胱甘肽過氧化物酶 4（glutathione peroxidase 4，GPX4）或β-肌動蛋白（β-actin）一抗和辣根過氧化物酶結合的二抗進行蛋白質印跡分析。最后，使用BeyoECL Plus顯示印跡信號。

6、細胞存活力檢測

心肌成纖維細胞培養24 h 后，使用細胞計數試劑盒-8（CCK-8）檢測細胞活力。每孔中加入10μl CCK-8 溶液，用酶標儀測量450 nm的吸光度。

7、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

收集心肌成纖維細胞的培養上清液，用human pro-collagen Ⅰ alpha 1 DuoSet ELISA kit 和 human collagenⅢELISA kit 根據試劑盒說明書分別檢測Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的濃度。

8、Transwell檢測細胞遷移

將200 μl 無血清培養基（含2×105個心肌成纖維細胞）接種到上室，下室加入含2.5%胎牛血清的培養基。放置培養箱8 h后，遷移細胞用4%多聚甲醛固定，接著用結晶紫染色10 min。最后，選擇5 個隨機區域進行細胞計數，評估細胞遷移水平。

9、脂質過氧化和Fe2+檢測

使用ROS assay kit 分析細胞內活性氧水平，先將心肌成纖維細胞與 10 μmol/L ROS 熒光探針 DCFH-DA 于 37 ℃避光孵育20 min，然后用熒光分光度計在488 nm 激發波長和525 nm 發射波長下檢測熒光強度。按照試劑盒說明書所示，使用lipid peroxidation MDA assay kit 檢測心肌成纖維細胞裂解物中丙二醛（malonaldehyde，MDA）的含量。用iron assay kit檢測心肌成纖維細胞中Fe2+水平。

10、統計學方法

使用GraphPad Prism 軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，多組間的顯著性分析使用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1、缺氧/復氧誘導心肌細胞分泌高表達miR-208b 的外泌體

對心肌細胞的檢測發現，其能分泌外泌體（圖1A），且外泌體顯著表達相關的標志物（圖1B）。缺氧和缺氧/復氧（H/R）均能促進miR-208b 在心肌細胞中的表達，且H/R 的促表達效果更顯著（圖1C）。檢測心肌細胞所分泌外泌體中miR-208b 的表達也發現，缺氧和H/R 顯著促進外泌體中miR-208b 的表達，且 H/R-Exo 中 miR-208b 的表達水平更高（圖1D）。心肌細胞轉染miR-208b 抑制劑后，外泌體中miR-208b的表達顯著減少（圖1C、D）。這表明，缺氧能促進miR-208b 在心肌細胞和其分泌外泌體中的表達，且H/R 進一步增強上述效果。不過心肌成纖維細胞進行缺氧和H/R處理時，miR-208b 在細胞中的表達變化不明顯（圖1E），表明缺氧和H/R 不影響miR-208b 在心肌成纖維細胞中的表達。

圖1 缺氧/復氧促進心肌細胞和其分泌外泌體高表達miR-208b。A：電鏡觀察心肌細胞所分泌外泌體；B：Western blot檢測外泌體標志物CD63和TSG101的表達水平；C～D：心肌細胞培養于缺氧條件（Hypoxia，含1%氧氣）12 h后，復氧（Reoxygenation，正常培養條件）培養12 h，或轉染miR-208b抑制劑后再進行H 或H/R 處理，接著用熒光定量PCR 檢測心肌細胞（C）和其分泌外泌體（D）中miR-208b的表達水平，NC為miRNA 陰性對照；E：心肌成纖維細胞進行缺氧或缺氧/復氧處理，然后用熒光定量PCR檢測細胞中miR-208b的表達水平

2、H/R-Exo 通過miR-208b 促進心肌成纖維細胞的存活和遷移

將H/R-Exo 加入到心肌成纖維細胞進行共培養時，可明顯觀察到心肌成纖維細胞攝入外泌體（圖2A）。同時，H/R-Exo 顯著增加miR-208b 在心肌成纖維細胞中的表達，而N-Exo無此作用（圖2B）。H/R-Exo 明顯促進心肌成纖維細胞的存活力，而抑制miR-208b 表達時，H/R-Exo 促細胞存活的作用顯著被減少，且N-Exo 無法促進細胞存活力（圖2C）。同時對細胞遷移的檢測表明，H/R-Exo 顯著促進細胞遷移，miR-208b 的抑制物能減弱上述外泌體的促遷移作用；而N-Exo對細胞的遷移無影響（圖2D～E）。這表明H/R心肌細胞所分泌外泌體通過高表達的miR-208b 促進心肌成纖維細胞的存活和遷移。

圖2 缺氧/復氧心肌細胞源性外泌體（H/R-Exo）通過miR-208b 促進心肌成纖維細胞存活和遷移。A：H/R-Exo 用熒光染料DiI 標記后加入到心肌成纖維細胞（CFs）中進行共培養，然后熒光顯微鏡觀察CFs 攝取外泌體，DAPI 為核染色；B～D：CFs 分別加入正常培養心肌細胞源性外泌體（N-Exo）和H/R-Exo，或轉染miR-208b 抑制劑后再加入H/R-Exo 進行共培養；B：熒光定量PCR 檢測miR-208b的表達水平；C：細胞計數試劑盒-8（CCK-8）檢測細胞存活力，D～E：Transwell檢測細胞遷移

3、H/R-Exo 通過miR-208b 增強心肌成纖維細胞的活化

另 外 ，H/R-Exo 顯 著 增 強 α -SMA、Collagen Ⅰ 和Collagen Ⅲ的mRNA 表達水平（圖3A～C），并促進α-SMA的蛋白表達（圖3D），增加Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的分泌水平（圖3E～F），而N-Exo 無此作用。轉染miR-208b 抑制劑的心肌成纖維細胞與H/R-Exo 共培養時，H/R-Exo 促進α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表達的作用顯著被減弱（圖3）。因此，H/R-Exo 通過攜帶高水平的miR-208b 而促進心肌成纖維細胞的活化。

圖3 缺氧/復氧心肌細胞源性外泌體（H/R-Exo）通過miR-208b 增強心肌成纖維細胞（CFs）的活化。CFs 分別加入正常培養心肌細胞源性外泌體（N-Exo）和H/R-Exo，或轉染miR-208b抑制劑后再加入H/R-Exo 進行共培養。熒光定量PCR 檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）（A）、Collagen Ⅰ（B）和Collagen Ⅲ（C）的表達，Western blot 檢測α-SMA 的蛋白表達水平（D），酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測Collagen Ⅰ（E）和Collagen Ⅲ（F）的分泌水平

4、H/R-Exo 通過miR-208b 增加心肌成纖維細胞的鐵死亡水平

最新的研究發現，鐵死亡，一種新的細胞死亡方式，參與了成纖維細胞的活化過程［12］。因此，研究繼續探討H/R-Exo 所含miR-208b 是否與鐵死亡相關。用鐵死亡誘導劑Erastin 處理心肌成纖維細胞發現，鐵死亡的主要指標ROS、MDA 和Fe2+的含量顯著增加（圖4A～C），而調控鐵死亡進程的關鍵因子GPX4的表達明顯下調（圖4D～E），表明細胞的鐵死亡水平增加。同時加入Erastin 和H/R-Exo 時，ROS、MDA 和 Fe2+的累積進一步增強（圖 4A～C），而GPX4 的表達進一步下調（圖4D～E）。心肌成纖維細胞轉染miR-208b抑制劑后再加入Erastin 和H/R-Exo 時，上述鐵死亡相關指標的變化水平顯著低于Erastin 和H/R-Exo（Erastin+H/R-Exo）處理組（圖4）。另外，miR-208b mimics也能增加ROS、MDA 和Fe2+的含量（圖4），表明miR-208b 能促進鐵死亡發生。因此，H/R-Exo 可通過攜帶高水平的miR-208b而增強心肌成纖維細胞的鐵死亡進程。

圖4 缺氧/復氧心肌細胞源性外泌體（H/R-Exo）通過miR-208b 誘導心肌成纖維細胞（CFs）的鐵死亡發生。CFs 分別加入鐵死亡誘導劑 Erastin、Erastin 和 H/R-Exo、Erastin 加 H/R-Exo 和miR-208b 抑制劑、miR-208b mimics。用活性氧（ROS）熒光探針 DCFH-DA 檢測ROS 生成量（A），用脂質過氧化丙二醛（MDA）檢測試劑盒檢測MDA 的產生（B），用鐵測定試劑盒測量Fe2+的含量（C），熒光定量PCR和Western blot檢測谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）的表達水平（D、E）

討 論

多種心臟病均會導致心肌纖維化，而纖維化的出現是決定心血管病預后的重要因素，會導致心律失常、心力衰竭甚至猝死等嚴重并發癥［13］。因此，了解清楚心肌纖維化發生發展的機制將有助于心臟疾病的預防治療，并可能找到合適的治療靶點。

逐漸有研究發現，在心肌疾病發生的過程中，不同細胞間可以通過外泌體等進行信息交流，從而影響疾病的進展過程［14］。例如，Luo 等［15］研究發現，缺血后處理可上調心肌成纖維細胞所分泌外泌體/微囊泡中miR-423-3p 的表達，進而這些外泌體/微囊泡通過miR-423-3p 靶向下游效應器RAP2C而在缺血再灌注損傷急性期發揮心臟保護作用。血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）會誘導心肌成纖維細胞釋放外泌體，進而通過激活Akt 和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路而增加心肌細胞中Ang Ⅱ的產生及其受體的表達，從而加劇Ang Ⅱ誘導的心肌細胞肥大［16］。本研究則發現，缺氧和缺氧/復氧均可以誘導心肌細胞分泌高表達miR-208b 的外泌體。Wang 等［17］研究表明，缺氧會導致 H9c2 細胞分泌高表達miR-208a/b 的細胞外小泡，而這些細胞外小泡會通過miR-208a/b 而靶向抑制 RNA 結合蛋白抖動（QKI）的表達，從而加劇缺氧/復氧（H/R）誘導的心肌細胞凋亡。本研究則進一步發現，H/R-Exo 明顯促進心肌成纖維細胞的存活力和遷移，增強α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表達，而miR-208b 的抑制物能顯著減弱上述外泌體對心肌成纖維細胞生物學功能的影響作用。因此，心肌細胞外泌體源性miR-208b在心肌疾病中具有重要意義。

本研究同時還發現，用鐵死亡誘導劑Erastin 處理心肌成纖維細胞時，H/R-Exo 能進一步增強鐵死亡主要指標ROS、MDA 和Fe2+的累積，抑制鐵死亡關鍵調控因子GPX4 的表達；miR-208b 的抑制物能明顯減弱Erastin 和H/R-Exo 對鐵死亡的影響作用，并且miR-208b mimics 具有誘發鐵死亡發生的作用。本研究首次發現，H/R-Exo 能通過miR-208a/b而影響心肌成纖維細胞的鐵死亡。而逐漸有研究表明，鐵死亡能影響成纖維細胞的活化［18-19］。例如，長鏈非編碼RNA-ZFAS1 在博萊霉素（BLM）誘導的肺纖維化大鼠肺組織和轉化生長因子-β1（TGF-β1）處理的HFL1 細胞中表達上調，可通過miR-150-5p/SLC38A1軸而誘導鐵死亡發生，從而促進TGF-β1 誘導的成纖維細胞活化、炎癥和脂質過氧化，增強BLM 誘導的脂質過氧化和肺纖維化進展［18］。而在缺血再灌注（I/R）大鼠模型和Ang Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞模型中，miR-375-3p 通過抑制GPX4 的表達而加速心肌細胞的鐵死亡，從而促進纖維化；miR-375-3p拮抗劑（或抑制劑）和Fer-1 促進心臟成纖維細胞的抗氧化能力，減少GPX4介導的鐵死亡過程，減輕I/R誘導的心臟成纖維細胞活化［19］。另外，MLK3主要調節鐵死亡導致的慢性心力衰竭晚期心肌纖維化和JNK/p53 信號通路介導的氧化應激，從而促進壓力超負荷引起的不良心肌纖維化［20］。上述研究均表明，鐵死亡能促進成纖維細胞的活化，表明鐵死亡是纖維化疾病的一個重要誘因。

綜合上述，H/R-Exo 能通過高表達的miR-208b 而調控心肌成纖維細胞的存活力、遷移、活化和鐵死亡等生物學功能，表明外泌體源性miR-208b 具有重要的功能，可能是心肌疾病密切相關的關鍵調控因子。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突