糖皮質激素誘導細胞凋亡的研究進展

項曉洪 胡景偉

內蒙古醫科大學赤峰臨床醫學院兒內科，赤峰 024000

糖皮質激素（glucocorticoids，GC）是腎上腺皮質分泌的一類甾體激素，也可人工合成，是臨床治療中主要用于抑制免疫應答、抗炎、抗休克的藥物［1］。但GC 使用也受到不良反應的限制，例如骨質疏松、高血糖、心血管疾病、加重神經損傷等。其機制可能是由GC誘導細胞凋亡引起。在GC敏感細胞中，細胞凋亡通過糖皮質激素受體（glucocorticoid receptors，GR）來誘導的。然而，在不同組織細胞中，GC 誘導細胞凋亡信號通路機制不盡相同。本文將從各個器官系統層面講述其誘導凋亡信號傳導通路的研究成果，為臨床使用GC提供一定的理論基礎。

GC誘導細胞凋亡的一般機制

在GC敏感細胞中，細胞凋亡和其他細胞效應是通過激活GR 來誘導的GR 是一種類固醇激素受體，與配體結合后移位到細胞核，發揮多種基因組和非基因組的效應。GR 兩種主要的亞型：GRα 和GRβ。GRα 具有誘導細胞凋亡。雖然GRβ無法結合GC，但是其可通過競爭共調節因子或形成無活性的GRα/GRβ 異源二聚體抑制GRα［2］。GR 介導的基因激活對于GC誘導的細胞凋亡的啟動是必不可少的，因為后者在放線菌素D 和放線菌亞胺的存在下被阻斷，從而表明需要從頭轉錄和翻譯［3］。GC誘導細胞凋亡途徑主要包括外在途徑、內在途徑及內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS），但是GC 誘導的細胞凋亡的經典途徑涉及到外在和內在的凋亡途徑的激活。具體見圖1。

圖1 GC誘導細胞凋亡的內源性及外源性凋亡途徑

1、內源性途徑

內源性途徑是GR 信號誘導的和線粒體依賴地對各種內源性刺激（如紫外線照射和饑餓）做出的反應。Bcl2家族成員中抗凋亡成員：Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w，促凋亡成員：Bax、Bcl-Xs、Bad、Bak、Bik、Bid、Bim 等［4］。促凋亡和抗凋亡的Bcl2家族成員之間的相互作用密切調控著細胞的凋亡反應。半胱天冬酶的家族成員（caspases）與凋亡相關的凋亡啟動因子和效應因子。細胞凋亡啟動子：caspase-8、caspase-10、C-FLIPL、caspase-9、caspase-2；細胞凋亡效應因子：caspase-3、caspase-7、caspase-6［5］。GC 信號通過上調促凋亡蛋白Bim 的表達，激活促凋亡蛋白Bak 與Bax，從而促進Bak、Bax形成Bax/Bak寡聚體。Bax/Bak破壞線粒體膜電位，導致細胞色素c和其他凋亡蛋白釋放至胞漿中。然而，這一過程遭到了抗凋亡的Bcl2的家族成員抵抗，如Bcl-2和Bcl-XL，它們結合并中和了促凋亡的對應分子。細胞色素c 激活caspase-3通過形成細胞色素c/Apaf-1/caspase-9復合體介導。這最終導致細胞凋亡［3］。

2、外源性途徑

外源性途徑是由腫瘤壞死因子受體超家族的死亡受體如Fas（CD95）和腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）啟動的。配體與受體結合導致死亡受體寡聚，并通過招募適配分子FADD、caspase-8/10和抑制因子flip形成死亡誘導信號復合體（death inducing signaling complex，DISC）［6］。在 DISC 復合體上，caspase-8/10 被自動催化激活后激活下游的caspase-3［5］。 同時 DISC 復合體 上的 caspase-8/10 介 導 的Bid被切割，它將Bid轉化為一種活性形式，從而觸發細胞色素c 從線粒體中釋放。細胞色素c 結合APAF-1，從而激活另一個啟動子caspase-9，進而激活效應器caspase-3［6］。

循環系統

1、GC 可通過 ERS 或連接蛋白（junction-mediating and regulatory protein，JMY）誘導細胞凋亡和功能障礙來損傷血管內皮細胞

雖然ERS是內質網中錯誤折疊的蛋白質大量地積累引起，但是內質網可激活未折疊蛋白反應來緩解這種壓力。在應激狀態下，內質網最初試圖通過未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）信號恢復內環境平衡，如果UPR 誘導的各種機制不能緩解ERS，內源性和外源性的細胞凋亡通路都可以被激活［7］。

1.1、蛋 白 激 酶 樣 ER 激 酶（PKR-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）-eIF2α - 激 活 的 轉 錄 因 子4（activating transcription factor 4，ATF4）-轉錄因子C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）信號通路 ERS可激活應激感受器，包括PERK、激活的轉錄因子6（ATF6）和肌醇需求激酶1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1），參與細胞內穩態的調節。已知ERS 激活3 個主要信號通路，即PERK-ATF4 軸、ATF6 信號轉導和 IRE1a 級聯反應，對于血管內皮細胞PERK-ATF4 通路起關鍵作用。當感受到ERS時，PERK寡聚并磷酸化自身和翻譯起始因子eIF2α，從而間接失活eIF2α 并抑制其翻譯。通過這種方式，PERK 有助于減少進入內質網的蛋白質流量，以緩解內質網壓力［8］。然而，強烈或持續的ERS 可能會破壞UPR 的動態平衡。隨后PERK-CHOP 信號通路被激活，誘導細胞凋亡［9］。而IRE1a級聯反應不僅能誘導內皮細胞凋亡，還可以導致內皮細胞自噬。IRE1α 信號的激活上調了X-box 結合蛋白的表達，且其與自噬、分化、耐藥、低氧耐受和細胞存活相關，從而對內皮細胞的存活和增殖起到保護作用，避免了GC對細胞的進一步損傷［10］。

1.2、JMY 凋亡通路 最近有少數學者認為JMY 參與了內皮細胞的凋亡。JMY 被發現是一種損傷反應蛋白。GC處理的情況下，過表達JMY 可增加細胞的凋亡率，而下調JMY 可降低GC 誘導的內皮細胞的凋亡率。當GC 處理后Bax 表達增加時，JMY 基因的下調可顯著降低GC 誘導的內皮細胞中Bax 的表達，而JMY 基因的過表達可增加GC 誘導的內皮細胞中Bax 的表達。因此，JMY 可通過上調凋亡蛋白Bax進一步誘導促凋亡途徑［11］。

2、血管平緩肌的相關凋亡通路

Price 等［12］在其小鼠模型中證實地塞米松可能通過抑制核因子κB 的作用，誘導大鼠肺動脈高壓大鼠肺動脈平滑肌細胞發生凋亡，從而發揮抗血管重塑的作用。另一些學者發現GC 通過抑制了miR-25 的表達，同時增加了活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生介導血管平滑肌細胞凋亡［13］。

神經系統

1、GR/鹽皮質激素受體（mineralocorticoid receptor，MR）表達和激活的失衡通路

一些數據表明，至少在海馬體中，這些效應是由不同的細胞內受體亞型介導的：GR 和 MR［14］。GR/MR 表達和激活的平衡被發現是維持海馬神經元正常功能和結構的先決條件。GR激活過多或持續時間過長或MR激活和表達不足會抑制海馬神經元的神經發生，促進細胞凋亡和樹突萎縮，導致認知、情緒和神經內分泌障礙及空間記憶功能障礙［15］。GC 和血漿皮質酮對下丘腦室旁核細胞的存活與否具有相反的作用，并且GC的有害作用具有劑量和時間依賴性。大劑量GC 上調GR 的表達和活化，但不能上調MR 的表達，破壞了GR/MR 平衡，從而導致下丘腦室旁核中的細胞凋亡。相反，低劑量皮質醇或是血漿皮質酮通過上調MR的表達和激活發揮抗凋亡作用［16］。許多研究報道了GC 和信號通路之間的串連［17］。已有的應激模型說明了慢性應激或長期外源性GC 給藥抑制海馬腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和 cAMP 反 應 元 件 結 合 蛋 白（cAMP responsive element binding protein，CREB）的表達，導致神經元凋亡；大劑量MP 對GR 的激活作用主要是通過上調Bax 表達、降低Bc1-2 表達和激活Bad 來實現的，而小劑量的皮質醇替代通過增加Bax 表達、滅活Bad 和降低Bax 表達來激活 MR，綜上說明 GR 和 MR 通過 Akt/CREB/BDNF 通路調節海馬細胞的凋亡與抗凋亡作用［16］。因此，GR 的激活可顯著抑制蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）/CREB 的激活，降低BDNF 和Bcl2 的表達。相反，低劑量皮質醇對MR的激活增加了Akt/CREB 的激活，并增加了BDNF 和Bcl2 的表達。RU486 和SPIRO 分別拮抗MP 的促凋亡作用和血漿皮質酮的抗凋亡作用，也驗證了它們的促凋亡即抗凋亡作用是通過GR和MR介導的［16］。

2、ERS途徑

已有研究表面，血液中高濃度的GC 可以穿過血腦屏障，導致神經元損傷甚至死亡。當ERS 持續存在時，PERK和IRE1可以被激活。激活的PERK在自身磷酸化形成低聚體后，啟動下游的ATF4-CHOP途徑。過量的ERS可以導致IRE1 的自磷酸化，然后通過其磷酸激酶活性啟動下游信號通路。作為凋亡因子，CHOP持續表達可通過阻斷細胞周期和誘導細胞凋亡而導致機體損傷［18］。然而GC 也具有保護神經細胞的作用。GC 誘導的亮氨酸拉鏈多肽可防止視網膜上的光感受器細胞凋亡的作用，具有保護視網膜功能免于退化，因此是治療退行性視網膜疾病的潛在選擇［19］。

運動系統

1、股骨頭壞死是臨床常見病，致殘率高

大劑量短期或長期小劑量GC 誘導的骨細胞及成骨細胞凋亡是可通過蛋白激酶C-β（PKCβ）-p66（shc）-c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）或是ERS 通路。其原理也成為激素性股骨頭缺血壞死的一些生物學基礎［20］。

1.1、PKCβ-p66（shc）-JNK 信號通路 GC 通過 GR 依賴機制激活促凋亡蛋白酪氨酸激酶2（proline-rich tyrosine kinase 2，PYK2）和JNK促進骨細胞的凋亡，從而對抗整合素誘導的存活，這種快速的細胞內信號向細胞外傳導導致細胞脫離是由于細胞凋亡導致的［21］。Wang等［22］發現GC 可通過 PKCβ/p66（shc）信號轉導產生 ROS，而 ROS 可以激活JNK；p66（shc）為一種線粒體中產生過氧化氫的放大因子，從而增加ROS。由此可以推斷GC 對細胞的促凋亡作用需要 PKCβ/p66（shc）/JNK 信號級聯的激活的ROS 導致骨細胞凋亡。同時在ROS 作用下，Forkhead box O（FOXO）轉錄因子的活性也升高，FOXO 的激活不僅抑制Akt的磷酸化以及Wnt 誘導的增殖和成骨細胞分化，因而ROS 的激活不僅促進細胞凋亡而且通過JNK介導的ROS誘導得細胞凋亡［23］。

1.2、ERS 途徑 最近的研究表明，大劑量的GC 可以引起內質膜鈣通道的改變，導致內質網鈣離子耗竭或超載，從而擾亂內質網蛋白質的合成、折疊和修飾導致錯誤折疊的蛋白質增多導致 ERS。在 ERS 時，不僅 IRE1、PERK 和ATF-6 的激活通路都可以促進CHOP 的表達，而且ATF4 和ATF3 的合成增加，也促進 CHOP 的表達［24］。CHOP 的過量表達促進促凋亡基因的表達來誘導細胞凋亡，也因此可以抑制抗凋亡基因的表達來誘導細胞凋亡［25］。高水平的CHOP 激活了細胞的凋亡途徑，加速骨細胞凋亡，導致了骨質疏松［24］。

2、骨髓間充質干細胞PERK-核因子E2 相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）凋亡通路

GC 也可導致骨髓間充質干細胞凋亡。GC 可激活PERK-Nrf2 通路促進ERS，最終影響骨髓間充質干細胞的增殖和凋亡。Nrf2是一種存續轉錄因子，被PERK磷酸化后從細胞質移動到細胞核，磷酸化后的Nrf2 可抑制蛋白質翻譯，誘導氧化還原動態平衡基因，從而誘導細胞凋亡［26］。

消化系統

長期服用地塞米松——一種合成的GC 藥物。GC 會導致高血糖或類固醇誘導的糖尿病。有研究表明地塞米松直接誘導胰腺β 細胞凋亡，但其分子機制尚不清楚。Suksri等［27］認為地塞米松通過與 GR 結合，誘導 TRAIL 死亡受體（DR5）和TRAIL 途徑，誘導胰腺β 細胞發生凋亡。其在小鼠研究中發現GC不僅可上調TRAIL基因和蛋白表達，還能上調DR5 蛋白，但抑制誘騙受體蛋白。敲除DR5 可降低地塞米松誘導的 caspase-3 活性，caspase-8 和 caspase-9 抑制劑可保護胰腺β 細胞免受地塞米松促進誘導細胞凋亡，說明了地塞米松可能通過TRAIL 途徑誘導胰腺β-細胞凋亡。而相關研究證明了糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase-3，GSK3）參與了 GC 誘導的 β 細胞死亡和胰島素分泌障礙。GSK3有兩個亞型：GSK3α和GSK3β。GSK3β的下調導致了GR 在β細胞中的表達顯著降低，單獨敲除GSK3β可導致GC 促凋亡作用的消除，其揭示了β 細胞中GR-GSK3 串連的一些機制，并確定GSK3β 是導致GC 誘導的β 細胞死亡的主要亞型。有趣的是在小鼠實驗中，哺乳高峰期的小鼠在接受地塞米松治療后胰腺β 細胞質量增加。其被證實為GC 通過刺激細胞增殖和β 細胞新生，加劇了妊娠相關的大鼠胰腺β細胞質量的增加［28］。

生殖系統

GC可能通過激活Fas系統而誘導卵母細胞和卵巢細胞凋亡的假說。在體內和/或體外暴露于GC 后，卵母細胞的功能明顯受損，并引發細胞凋亡，氧化應激增加，腫瘤壞死因子-α 和腫瘤壞死因子受體的表達增強。在體外，用RNA干擾或在體內敲除Fas可顯著減輕GC對卵母細胞和卵巢壁層顆粒細胞的不利影響。然而，在體外，GC 顯著下調輸卵管上皮細胞腫瘤壞死因子α 的表達。因而Yuan 等［29］認為GC 對腫瘤壞死因子-α 表達的影響可能因細胞類型而異。有趣的是Zheng 等［30］在小鼠實驗證實內源性GC 水平增高Fas系統激活增加。

免疫系統

多年來，人們對GC在免疫系統細胞中的凋亡作用進行了深入的研究，并已知GC 具有多種多效性。眾所周知，大劑量的GC可誘導T細胞、B細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、NK 細胞和胸腺細胞的凋亡［31］。有趣的是，GC 對中性粒細胞有相反的作用，實際上保護這些細胞免受凋亡［32］。

雖然許多已知的GC 誘導細胞凋亡的效應和具體機制已經在文獻中得到了廣泛的報道，但我們將在這里重點介紹一些關于凋亡的調節性T 細胞（regulatory T cells，Treg）分子作用機制。Treg 細胞對GC 誘導的體內凋亡具有一定水平的抵抗力。在Treg 細胞中，GC 誘導的Bcl-2 表達上調導致內源性凋亡途徑的抑制，從而促進其存活。與其他胸腺細胞相比，Treg 細胞中原本較高的基礎鈣水平的進一步升高可能解釋了它們對TCR 介導的信號的相對抵抗［33］。此外，生理性的GC 刺激表達的巨噬細胞移動抑制因子逆轉GC 的免疫抑制作用，部分是通過減少激活誘導的細胞凋亡和維持炎癥信號［34］。

小結與展望

GC 可通過外源性途徑、內源性途徑及ERS 等途徑誘導細胞凋亡。臨床使用GC不可避免地出現相關不良反應，但是作為臨床醫生充分認識GC誘導凋亡機制過程，有利于指導臨床使用GC。雖然現有研究已經說明GC 具有誘導細胞凋亡的作用，但其具體機制仍舊不清楚。因此，我們仍需要努力探索研究為研制新的不良反應更少的藥物提供新的理論依據。