葛根素對腹瀉型腸易激綜合征腸道平滑肌神經遞質調節機制的影響研究

林雨康 易書林 楊梅林 李幸展 李璟弘 陳濤 談博 張佳敏

1湖南中醫藥大學中西醫結合學院，長沙 410208；2廣州中醫藥大學基礎醫學院，廣州 510006

腹瀉型腸易激綜合征（irritable bowel syndrome with predominant diarrhea，IBS-D）是一種常見的功能性腸道疾病，以腹痛、腹部不適為主癥，伴隨排便習慣和/或性狀的改變［1］。根據調查當前國人腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）患病率為1.4%～2.3%［2］。IBS共有4種亞型，而IBS-D 是國內最常見的分型［1］。雖然IBS-D 并非致命性疾病，但其難根治、易復發的特征嚴重影響著患者的日常生活，尤其是睡眠質量、心理狀態和社交活動等方面，大大降低了患者生活質量和學習工作能力。目前中醫治療IBS-D效果尚可，因此深入探索中藥藥物對治療IBS-D 的藥效物質基礎有著巨大前景［3］。本研究通過建立IBS-D動物模型，應用葛根素進行治療，以內臟敏感性及腸組織的神經遞質水平為評價指標，探討葛根素對IBS-D 腸道平滑肌神經系統傳導的影響，有望為IBS-D 的中藥治療提供新的實驗依據和轉化應用基礎。

材料與方法

1、實驗動物

實驗動物采用SPF 級4 周齡雄性SD 大鼠，體質量為（100±10）g，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（粵）2018-0034，實驗單位使用許可證［SCXK（粵）2018-0085］。

本研究通過廣州中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準（202103160003）。

于2021 年11 月開始，適應性飼養1 周，正常進食和飲水，晝夜光照恒定，各循環12 h。環境溫度保持于22～25 ℃，濕度為45%～55%，大鼠分4 籠飼養，每籠6 只，每天及時給水及添加滅菌全價顆粒飼料，及時清理排泄物及每日更換鼠籠，并且對鼠籠進行消毒處理。

2、主要藥物與試劑

葛根素（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-22-10407）；乙酰膽堿（Ach）測試盒（南京建成生物工程研究所，批號：A105-1）；一氧化氮（NO）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A102-1）；大鼠五羥色胺（5-HT）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（天津安諾瑞康生物技術有限公司，批號TAE-106r）。

3、主要儀器

BioSpec-nano 島津紫外可見分光光度計（日本島津公司）；勻漿機（北京天根生化科技有限公司）；各種量程可調型移液器（德國Eppendorf公司）；HR/T16M 高速冷凍離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；醫用彈力網狀繃帶（天津市華澳醫療保健有限公司）；臺式水銀血壓計（上海魚躍醫療設備有限公司）；8Fr導尿管（重慶加加林世紀醫療器械有限公司）。

4、實驗方法

4.1、IBS-D 大鼠模型的建立及評價 根據文獻建立IBS-D 大鼠模型［4］。造模方法為每日給予 2 h 束縛刺激，連續14 d。具體刺激方法為：乙醚輕度麻醉后，用醫用彈性網狀繃帶束縛大鼠的前上肢、前肩、胸部，限制前上肢搔抓頭面部，但不限制其他活動。造模完成后統計模型組大鼠內臟敏感性、排便面積指標，并觀察模型組病理學有無器質性改變，以確定IBS-D 模型復制是否成功。若模型組與對照組大鼠對比出現內臟敏感性升高、排便面積增加的癥狀并有統計學差異，且模型組病理學無器質性改變，說明IBS-D模型成功復制。

4.2、動物分組及給藥 24 只大鼠按照隨機數字表法分為對照組6 只、造模組18 只。造模組在造模成功后分為模型組、葛根素低劑量組、葛根素高劑量組，每組6 只。在造模完成后連續14 d 給予灌胃給藥，藥物劑量依據2020 版《中國藥典》［5］規定葛根臨床用量為9～15 g，葛根素的得率為1.2%，按成人70 kg、葛根10 g 用量算，則人用葛根為142.86 mg/kg，換算后大鼠葛根劑量為0.9 g/kg，換算為葛根素為11 mg/kg。根據預實驗結果本實驗設葛根素低、高劑量組的大鼠給藥量分別為22、44 mg/（kg·d），每日灌胃前精確稱量4.4 g 葛根素，取少量純水充分溶解后轉入250 ml 容量瓶中定容，混勻后使用，低劑量組將溶液用純水稀釋1 倍后使用，每日灌胃前稱量大鼠質量，計算出所需灌胃劑量。同時對照組與模型組給予等量生理鹽水灌胃。

4.3、大鼠結腸組織病理改變評估 采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察各組大鼠結腸組織病理改變，沿結腸肌肉方向取大鼠結腸組織標本，厚度0.2～0.3 cm，盡量剔除結腸組織上附著的脂肪組織，生理鹽水沖洗后，使用甲醛固定脫水、浸入石蠟包埋、切片后使用HE 染色法進行染色、封片，進行病理學分析。觀察是否存在潰瘍或炎癥性病理改變。

4.4、大鼠內臟敏感性評估 采用球囊結直腸擴張（CRD）方法，在第28 天時檢測其內臟敏感性。操作步驟如下：實驗前禁食不禁水24 h，將導尿管和球囊通過肛門插入大鼠結直腸后用膠帶固定，肛門外側端球囊固定在距肛門1 cm 的尾部，將血壓計通過三通閥與之連通，限制大鼠運動。逐步增大壓力并仔細觀察大鼠反應，記錄大鼠在結直腸內壓力達到60 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）時的活動并進行腹壁回縮反射（AWR）評分［6］。具體標準為：大鼠對CRD無行為反應計0 分；大鼠頭部有短暫活動但身體無反應計1 分；大鼠腹壁肌肉出現收縮計2 分；大鼠腹部肌肉收縮并能離開桌面計3 分；大鼠身體呈弓形并伴有骨盆抬起計4分。

4.5、大鼠糞便情況評估 根據文獻［4］方法，第21天和第28 天將其分別轉移到鋪有干凈濾紙的籠內，每日相同時間段采集每只大鼠4 h糞便，在合適的高度對放有標準刻度尺的濾紙進行圖像采集，通過ImageJ圖像處理軟件，計算大鼠4 h糞便面積。

4.6、微板法測定結腸組織Ach 含量 第28 天取大鼠組結腸組織后，使用組織勻漿機制備大鼠結腸組織勻漿，按照試劑盒說明書，取上清后依次加入各試劑制備6 組反應液，每組4 管（空白管、標準管、測定管、對照管），最后再次取上清加至96孔板在酶標儀550 nm波段處測定各孔OD值。記錄每管對應OD值，計算結腸組織中的Ach含量。

4.7、硝酸還原酶法測定結腸組織NO 含量 第28 天取大鼠結腸組織后，使用組織勻漿機制備大鼠結腸組織勻漿，按照試劑盒說明書，取上清加入硝酸還原酶等試劑后滴入96 孔板，在酶標儀550 nm 波段處測定各孔OD 值。記錄每管對應OD值，計算每組結腸組織中的NO含量。

4.8、ELISA 測定大鼠結腸組織5-HT 含量 應用ELISA定量測定大鼠結腸組織5-HT 的含量，在第28 天取大鼠結腸組織后，使用組織勻漿機制備大鼠結腸組織勻漿，按照試劑盒說明書，取上清后，使用純化的抗5-HT 捕獲抗體包被微孔內壁的表層，制成固相的載體。檢測過程中依次加入各試劑樣品，最后通過讀取標準品吸光度值繪制標準曲線，并在標準曲線上根據樣品吸光度值計算出待測樣品的濃度。

5、統計學方法

采用SPSS 21.0 統計軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊使用LSD 檢驗，若方差不齊使用Dunnett’s T3檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1、病理評價

在光學顯微鏡下，模型組大鼠與對照組比較，結腸組織樣本均無明顯的病理改變，基本可排除炎癥性病變，符合IBS-D 定義與組織學表現。同時，模型組大鼠病理切片未發現潰瘍病灶，提示束縛應激的強度相對溫和，未造成應激性潰瘍。病理評價結果提示造模成功。具體見圖1。

圖1 各組腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠結腸病理變化（HE 染色 ×200）。A 為對照組（以等量生理鹽水灌胃），B 為模型組（造模完成后以等量生理鹽水灌胃），C 為葛根素低劑量組[造模完成后給予葛根素22 mg/（kg·d）灌胃]，D 為葛根素高劑量組[造模完成后給予葛根素44 mg/（kg·d）灌胃]

2、葛根素對IBS-D模型大鼠內臟敏感性的影響

在CRD 為60 mmHg 條件下，對照組大鼠AWR 評分為（0.53±0.02）分，模型組為（0.84±0.03）分，葛根素低劑量組（0.48±0.06）分，葛根素高劑量組（0.54±0.06）分；模型組與對照組比較差異有統計學意義（t=15.293，P＜0.001）；葛根素低、高劑量組與模型組比較差異均有統計學意義（t=11.811、9.338，均P＜0.001）。

3、葛根素對IBS-D模型大鼠4 h排便面積的影響

與對照組比較，第21、28 天模型組大鼠4 h 排便面積均顯著增加（均P＜0.01）；與模型組比較，第21、28 天葛根素低、高劑量組的4 h排便面積均顯著減少（均P＜0.01）。具體見表2。

表2 葛根素對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠4 h排便面積的影響（mm2，）

表2 葛根素對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠4 h排便面積的影響（mm2，）

注：對照組以等量生理鹽水灌胃，模型組造模完成后以等量生理鹽水灌胃，葛根素低劑量組造模完成后給予葛根素22 mg/（kg·d）灌胃，葛根素高劑量組造模完成后給予葛根素44 mg/（kg·d）灌胃

第28天206.21±151.55 611.84±276.03 130.60±88.15 178.59±141.70 2.923 0.010 4.068 0.002 3.420 0.006組別對照組模型組葛根素低劑量組葛根素高劑量組只數6 6 6 6 t值對照組比模型組P值對照組比模型組t值葛根素低劑量組比模型組P值葛根素低劑量組比模型組t值葛根素高劑量組比模型組P值葛根素高劑量組比模型組第21天249.70±106.83 654.22±120.21 351.73±89.60 337.60±135.31-6.161＜0.001 4.942＜0.001 4.285 0.002

4、葛根素對IBS-D 模型大鼠結腸組織Ach、NO、5-HT表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠結腸組織Ach表達升高、NO含量降低、5-HT 表達升高（均P＜0.05）；與模型組比較，葛根素低劑量組的Ach 表達降低、NO 含量升高、5-HT 表達降低（均P＜0.05），葛根素高劑量組的Ach、5-HT 表達均降低（均P＜0.05）具體見表3。

表3 葛根素對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠結腸組織乙酰膽堿、一氧化氮、五羥色胺表達的影響（）

表3 葛根素對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠結腸組織乙酰膽堿、一氧化氮、五羥色胺表達的影響（）

注：對照組以等量生理鹽水灌胃，模型組造模完成后以等量生理鹽水灌胃，葛根素低劑量組造模完成后給予葛根素22 mg/（kg·d）灌胃，葛根素高劑量組造模完成后給予葛根素44 mg/（kg·d）灌胃

組別對照組模型組葛根素低劑量組葛根素高劑量組只數6 6 6 6五羥色胺（μg/L）111.73±4.66 131.97±16.64 115.01±12.07 109.01±6.59-2.869 0.017 2.021 0.071 3.143 0.010 t值對照組比模型組P值對照組比模型組t值葛根素低劑量組比模型組P值葛根素低劑量組比模型組t值葛根素高劑量組比模型組P值葛根素高劑量組比模型組乙酰膽堿（μg/mgprot）1.56±0.52 3.67±0.87 2.65±0.87 2.26±1.05-5.126＜0.001 2.034 0.069 2.533 0.030一氧化氮（μg/mgprot）29.07±11.24 9.61±1.50 16.32±4.15 9.34±5.80 4.204 0.002-3.725 0.004 0.110 0.914

討 論

IBS-D 是以腹痛或腹部不適為主要癥狀的腸功能紊亂性疾病，IBS-D 的病因及發病機制尚未明確，研究表明胃腸運動異常、內臟高敏感性、腦-腸軸調節異常、腸道感染及免疫功能紊亂、腸道菌群紊亂、精神心理應激、飲食及遺傳因素等都與其發病有關，目前主要采取對癥治療的方式進行干預［1］。

IBS-D 屬中醫學“泄瀉”范疇，其中醫病機多為脾運失職，小腸無以分清泌濁，大腸無法轉化，水反為濕，谷反為滯，合污而下，則發泄瀉，核心病機在于脾虛濕盛。治療多以升陽化濕、健脾止瀉為法。第10 版《中藥學》教材中記載葛根具有止瀉、生津、升陽的功效，在臨床上多用于治療脾虛型泄瀉。葛根素是葛根的特有成分且含量最高，有研究指出葛根素對腸道平滑肌的舒張作用可能與其對腸神經遞質釋放的調控有關［7-8］。李嬌嬌［9］的研究結果指出葛根素可以保護腸道組織結構，預防結腸組織中5-HT 的濃度升高，從而影響腸道的蠕動功能。張鳳杰［10］的研究指出葛根素對大鼠離體的平滑肌具有明顯的抑制作用。綜上所述，葛根素或可通過調控腸神經遞質的釋放進而對IBS-D 產生治療作用。故本次實驗通過制備大鼠慢性束縛應激模型，觀察了葛根素對大鼠的相關各項指標的影響。

根據相關報道，IBS-D 模型評價的主要指標是糞便情況的改變，腸、大鼠內臟敏感性的改變以及病理學無器質性改變［4，11-12］。本研究運用慢性束縛應激刺激，模型組大鼠出現有內臟敏感性顯著升高、排便面積顯著增加的癥狀，且模型組病理學無器質性改變，說明IBS-D模型成功復制。

本實驗中葛根素低、高劑量均能顯著減少IBS-D 大鼠的排便面積并降低內臟敏感性，說明葛根素對慢性束縛應激誘導的IBS-D大鼠具有一定的治療作用，

腸神經系統（ENS）由位于腸道壁內的神經元及其支持細胞所組成，為腸內固有的神經支配系統，支配腸道平滑肌的運動。膽堿能神經元和非腎上腺素能非膽堿能（NANC）神經元是ENS重要的組成部分。膽堿能神經元合成釋放的Ach 是最主要的興奮性運動神經遞質。NANC 是新近發現的一類抑制性運動神經元主要包括NO、三磷酸腺苷、5-HT、血管活性腸肽等。從中選取Ach、NO、5-HT 3個相對具有代表性的神經遞質進行實驗分析。

Ach 是膽堿能神經元分泌的神經遞質，屬于腸道的興奮性神經遞質。其受體主要為M 受體，其中M2 和M3 亞型主導腸道平滑肌收縮［13］。本實驗結果發現，葛根素低、高劑量均對IBS-D 大鼠結腸組織Ach 表達水平有明顯下調作用（均P＜0.05），提示葛根素可能通過抑制Ach 表達水平從而降低Ca2+釋放和底物蛋白發生磷酸化改善大鼠結腸平滑肌舒縮狀態。

NO 是平滑肌神經肌肉接頭的主要抑制性神經遞質，是一種腸動力強抑制性神經遞質。NO 由一氧化氮合成酶生成，NO 通過激活可溶性鳥苷酸環化酶產生環磷酸腺苷，促進平滑肌舒張［15-16］。Jang 等［17］的研究證明 NO 水平降低可直接導致腸道蠕動加快，縮短結腸中水的吸收時間，從而導致IBS-D 大鼠大便含水量的增加，內臟敏感性增高，從而出現腹痛、腹瀉等癥狀。本實驗模型組大鼠結腸組織中NO含量明顯降低，低劑量組葛根素可使大鼠結腸組織NO表達水平顯著增高，改善平滑肌收縮從而改變排便情況達到止瀉作用。

5-HT 是一種參與中樞神經系統和腸道活動的神經遞質，在腸上皮細胞內分布的5-HT可以控制腸平滑肌舒縮和分泌反射［18］。有研究提示 5-HT 通過 5-HT2B 受體直接作用于腸道黏膜上皮細胞或平滑肌細胞調節結腸的運動及分泌，5-HT 還可通過作用于外源性傳入神經元上的5-HT3、5-HT4 受體，增加細胞內Ca2+的濃度，調節中樞神經和外周神經元的興奮性，導致內臟高敏感性和腹部不適等腸道功能異常［19］。本實驗研究發現葛根素可明顯降低大鼠結腸組織中5-HT 的濃度（P＜0.05），提示葛根素可能通過下調5-HT的表達水平從而發揮治療IBS-D的作用。

綜上所述，本實驗通過建立IBS-D 大鼠模型探究葛根素對IBS-D 腸道平滑肌神經系統傳導的影響，研究結果提示葛根素能夠顯著改善IBS-D 大鼠的內臟高敏感性以及排便狀況，且從總體結果分析葛根素低劑量組取得的治療效果相對更顯著，提示在臨床應用當中應注意葛根素的使用劑量。其機理或是通過上調結腸NO 表達水平，下調結腸Ach、5-HT 表達水平來對IBS-D 起到治療效果。葛根素影響神經遞質的釋放的機制，是不是因為其能影響ENS 的囊泡轉運或通過影響腸道菌群從而導致腸神經元功能改變，值得進一步思考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突