禽傳染性喉氣管炎病毒分離鑒定及gD 基因序列分析

何云鳳，顧宇華，匡華麗，李蘊(yùn)玉，李佩國(guó)

（河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島 066604）

傳染性喉氣管炎（infections laryngotracheitis，ILT）是由雙鏈DNA 皰疹病毒1 型（通常稱為傳染性喉氣管炎病毒，ILTV）引起的家禽急性上呼吸道疾病[1]。ILTV 主要通過(guò)呼吸道和消化道感染，患病禽和帶毒禽以及畜舍內(nèi)被污染的墊料是其主要傳染源。也有報(bào)道[2]稱，接種活疫苗的雞可長(zhǎng)時(shí)間排毒，感染后康復(fù)雞可排毒兩年。該病在一年四季都可發(fā)生，但秋冬季節(jié)發(fā)病率更高一些。ILTV可感染不同日齡的禽，青年和成年禽群感染后常呈現(xiàn)急性暴發(fā)，產(chǎn)蛋禽感染后出現(xiàn)產(chǎn)蛋率急劇下降甚至停產(chǎn)現(xiàn)象，雛禽也可感染，但較為少見(jiàn)[3]。該病有很高的發(fā)病率和死亡率，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大威脅。

2021 年12 月，河北省滄州市一養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)的510 日齡蛋雞發(fā)生了以雞冠邊緣發(fā)紺、發(fā)出怪音、張口伸脖為主要癥狀的疾病。剖檢可見(jiàn)：氣管有血及血樣分泌物，喉頭有干酪樣假膜，卵泡充血呈紅色，腺胃發(fā)軟，腸黏膜變薄，內(nèi)容物稀薄，扁桃體輕度出血。本研究以該養(yǎng)殖場(chǎng)病死雞為研究對(duì)象，從氣管組織中分離病原，通過(guò)PCR 擴(kuò)增、序列分析確定為ILTV，并分析了分離毒株的遺傳變異情況，以期為河北省ILT 防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

SPF 雞胚，購(gòu)于北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司；0.22 μm 濾膜，購(gòu)自密理博中國(guó)有限公司；2×EsTaqMaster Mix（Dye），購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；病毒核酸提取試劑盒，購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；ILTV、禽傳染性支氣管炎病毒（IBV）、新城疫病毒（NDV）、J 型禽白血病病毒（ALV）核酸，由本實(shí)驗(yàn)室保存；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；pMD18-T 載體、DNA 連接酶、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；第一鏈cDNA 高效合成（逆轉(zhuǎn)錄）試劑盒，購(gòu)自亞太恒信生物科技（北京）有限公司。

1.2 樣品來(lái)源和處理

樣品為來(lái)自河北省滄州市養(yǎng)殖戶送檢的疑似ILTV 感染病雞的氣管組織樣品。將組織樣品用無(wú)菌剪刀剪碎后，與無(wú)菌PBS 按體積比1:5 混合，用組織勻漿機(jī)充分混勻；將勻漿液反復(fù)凍融3 次，4 ℃ 12 000 r/min 離心2 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾后置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)

參照文獻(xiàn)[4]合成ILTVgD基因序列，參照文獻(xiàn)[5]合成IBVS1基因序列，參照文獻(xiàn)[6]合成NDVF基因序列，參照文獻(xiàn)[7]合成ALVgp85基因序列。所有引物由上海生物工程有限公司合成（表1）。

表1 PCR 擴(kuò)增引物序列

1.4 病毒分離

取上述病料勻漿上清液接種9 日齡 SPF 雞胚尿囊腔，每胚0.2 mL；接種等量高壓滅菌的PBS作為陰性對(duì)照，置孵化器內(nèi)孵育；棄去24 h 內(nèi)死亡雞胚，72 h 后取出雞胚于4 ℃冰箱過(guò)夜；收集雞胚絨毛尿囊膜研磨后接種9 日齡SPF 雞胚，連續(xù)盲傳3 代；收獲每代的雞胚絨毛尿囊膜和尿囊液，并觀察雞胚與雞胚絨毛尿囊膜病變情況。

1.5 分離病毒PCR 擴(kuò)增及序列分析

參照核酸提取試劑盒說(shuō)明，提取第3 代雞胚絨毛尿囊膜和尿囊液的核酸進(jìn)行RT-PCR 和 PCR 反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。以上述提取的DNA 和逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，對(duì)ILTV、IBV、NDV、ALV 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，取5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；將ILTV gD基因擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后連接 PMD-18T 載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞；挑取單菌落，接種于含氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR 檢驗(yàn)后，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送生工生物工程股份公司測(cè)序。

1.6 遺傳進(jìn)化分析

應(yīng)用DNAMAN 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，以GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的ILTV 疫苗株、國(guó)內(nèi)外部分流行株作為參考株，利用MEGA7.0 軟件對(duì)分離株和參考株的gD基因核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，利用DNAstar 7.1 軟件中的MegAlign 程序進(jìn)行ILTVgD基因核苷酸同源性分析，并采用Neighbor-Joining 方法構(gòu)建ILTV 分離株及參考株gD基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，boot strap 設(shè)置為1 000 次重復(fù)。參考毒株信息見(jiàn)表2。

表2 參考株信息

1.7 gD 蛋白生物信息學(xué)分析

采用SOPMA 在線服務(wù)器預(yù)測(cè)分離株與參考株gD基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，采用YinOYang-1.2、NetNGlyc-1.0 在線服務(wù)器分別預(yù)測(cè)分離株與參考株O-連接和N-連接的糖基化位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離

病料勻漿上清液接種9 日齡雞胚后，初次傳代的雞胚在接種后120 h 內(nèi)未見(jiàn)死亡，但取出胚體后可見(jiàn)胚體體積小于對(duì)照組。收集尿囊液并用濾膜過(guò)濾除菌，繼續(xù)接種雞胚，傳至第3 代時(shí)，雞胚在接種后48 h 開(kāi)始出現(xiàn)死亡，打開(kāi)雞胚氣室可見(jiàn)雞胚絨毛尿囊膜出現(xiàn)痘斑，胚體取出后可觀察到胚體蜷縮，雙爪彎曲呈抱頭樣，死亡胚體表面可見(jiàn)明顯出血點(diǎn)，符合ILTV 致雞胚病變表現(xiàn)，而對(duì)照胚體無(wú)肉眼可見(jiàn)病變，表明在雞胚尿囊液中成功分離出ILTV。

2.2 病料樣品PCR 檢測(cè)

以前述所提第3 代雞胚尿囊液的DNA 和cDNA 為模板，采用IBV、NDV、AIV、ILTV 特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。結(jié)果（圖1）顯示，病料樣品中NDV、AIV、IBV 均為陰性，僅ILTV 為陽(yáng)性，凝膠電泳顯示約1 133 bp 的條帶，表明雞胚尿囊液中存在ILTV，分離得到1 株ILTV，將其命名為Hebei2021 株。

圖1 ILTV 分離株gD 基因PCR 結(jié)果

2.3 ILTV gD 基因核苷酸同源性結(jié)果分析

應(yīng)用DNAMAN 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，發(fā)現(xiàn)gD基因分離株核苷酸長(zhǎng)度為1 133 bp，編碼377 個(gè)氨基酸。應(yīng)用DNAstar 7.1 軟件中MegAlign程序進(jìn)行ILTVgD基因同源性分析，發(fā)現(xiàn)分離株與河南、黑龍江、江蘇分離株的gD基因序列同源性為99.0%～99.4%，與國(guó)內(nèi)K317 株弱毒疫苗株（JX458824）同源性為99.4%，與澳大利亞、埃及、韓國(guó)參考株同源性為99.4%～99.5%（圖2）。

圖2 ILTV 分離株與參考株核苷酸同源性分析結(jié)果

2.4 ILTV gD 基因遺傳進(jìn)化分析

利用MEGA7.0 軟件構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)（圖3）顯示，江蘇分離株單獨(dú)在一分支上，河北分離株與其他國(guó)內(nèi)參考株、國(guó)內(nèi)疫苗株以及國(guó)外參考株在同一分支上，表明河北分離株與國(guó)內(nèi)疫苗株，河南、黑龍江參考株，以及澳大利亞、韓國(guó)、埃及參考株親緣關(guān)系近，而與江蘇分離株親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖3 ILTV 分離株與參考株gD 基因分子進(jìn)化樹(shù)

2.5 ILTV gD 蛋白氨基酸序列分析

采用MEGA7.0 軟件對(duì)河北分離株和國(guó)內(nèi)疫苗株及國(guó)內(nèi)外參考株進(jìn)行ILTV gD 蛋白氨基酸序列比對(duì)。結(jié)果（表3）顯示：與疫苗株相比，河北分離株在3、219 aa 兩位點(diǎn)分別發(fā)生了T3A、V219Q突變；與河南、黑龍江、江蘇分離株相比，河北分離株與其分別在3、23 aa，3、208、282、334 aa，3、71、107 aa 等位點(diǎn)處發(fā)生了突變，分別為T(mén)3A、H23L，T3A、G208E、Q282R、R334C，T3A、K71E、K107E。

表3 ILTV 分離株、疫苗株、參考株gD 蛋白變異情況

2.6 ILTV gD 蛋白生物信息學(xué)分析

分離株與參考株蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均包含α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈，且分離株的無(wú)規(guī)則卷曲含量占肽鏈的45.89%。α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角占比分別為35.01%、14.59%、4.51%，部分二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。分離株和疫苗株gD蛋白均可能有49 個(gè)O-連接的糖基化位點(diǎn)（圖5），分離株和參考株均無(wú)N-連接的糖基化位點(diǎn)。

圖4 分離株和疫苗株gD 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖5 分離株和疫苗株O-連接的糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)雞胚傳代、PCR 擴(kuò)增、測(cè)序分析，成功分離鑒定出1 株ILTV。gD基因具有高度保守性[8]，其編碼的糖蛋白是病毒的主要保護(hù)性抗原，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，同時(shí)也是病毒主要抗原之一，是病毒吸附、穿入、復(fù)制所必需的[9]，故本試驗(yàn)對(duì)ILTV 的gD基因序列進(jìn)行了相關(guān)分析。gD基因核苷酸序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，河北分離株與疫苗株及國(guó)內(nèi)外參考株的同源性均在99.0%以上；氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，河北分離株與參考株絕大部分位點(diǎn)的氨基酸序列一致，僅極個(gè)別位點(diǎn)發(fā)生了突變，表明分離株的gD基因序列較為保守，遺傳進(jìn)化較穩(wěn)定。gD 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和糖基化預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，分離株和疫苗株相比并未發(fā)生突變。

通過(guò)詢問(wèn)該養(yǎng)殖場(chǎng)人員得知，該養(yǎng)殖場(chǎng)近半年內(nèi)未進(jìn)行ILT 免疫，因此可以認(rèn)為該分離株為自然感染的野毒株。分離株與弱毒疫苗株的gD基因序列在遺傳進(jìn)化關(guān)系上很接近，因此只要正確合理地進(jìn)行疫苗免疫，就可以使雞群產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)力。但是也有文獻(xiàn)[10]報(bào)道，疫苗毒引發(fā)埃及養(yǎng)殖場(chǎng)疫情，這也提示存在疫苗毒株毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，因此在未發(fā)生疫情地區(qū)應(yīng)慎重使用弱毒疫苗免疫，即使是在疫情發(fā)生區(qū)，在接種ILTV 弱毒疫苗后也應(yīng)采取相應(yīng)的生物安全防護(hù)措施，防止疫苗病毒感染周圍健康雞群。

為了預(yù)防ILTV 感染，一定要加強(qiáng)禽群的飼養(yǎng)管理，采用全進(jìn)全出的養(yǎng)殖模式，禽舍要定期通風(fēng)換氣，降低飼養(yǎng)密度，降低舍內(nèi)粉塵和氨氣濃度[4]。早期診斷對(duì)于防控ILT 十分重要，應(yīng)定期觀察禽群的臨床表現(xiàn)，對(duì)出現(xiàn)呼吸困難的病禽要立即隔離，并采集病禽的喉頭氣管分泌物送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行PCR 檢測(cè)[11]。由于病禽和康復(fù)禽體內(nèi)可能帶毒，從而成為本病的主要傳染源[12]，所以易感禽群應(yīng)與康復(fù)禽群分開(kāi)飼養(yǎng)，及時(shí)淘汰康復(fù)禽群，以減少ILT 發(fā)生和流行所帶來(lái)的損失。