基于三維熒光光譜-平行因子分析(EEM-PARAFAC)的有機質研究進展

劉 稜，方逸川，孫孝龍

(西南林業大學濕地學院，國家高原濕地研究中心，云南昆明 650224)

天然有機質(NOM)是廣泛存在于自然界中的一種混合物，主要由動植物殘體的分解、降解等作用形成。普遍認為NOM是具有羧基、酚基、芳香基、酚羥基、脂肪鏈和苯環等活性官能團的混合物[1]。NOM分為腐殖質和非腐殖質兩類：腐殖質分為富里酸、胡敏素和胡敏酸；而非腐殖質則包括糖類、纖維素、蛋白質等[1]。在水體和土壤中成分以腐殖質為主，占據該兩種生態系統中總有機質的50%～80%[2]。腐殖質具有如酚基、氨基、羧基和硫醇基等官能團，可與金屬離子、離子性、極性有機化合物發生作用，改變形態和分布情況，參與營養元素循環[3]。NOM的結構、來源和化學組成十分復雜，所以常常通過研究含有羧基、苯酚、烯醇、醇、羰基、氨和硫醇等氮氧硫官能團的芳香族和脂肪族有機化合物的異質混合物溶解性有機物(DOM)來表征NOM的性質。在環境中扮演著不可或缺角色的DOM，該物質的復雜組成成分、化學結構、不同來源和濃度差異等性質特征的變化都會對生態系統和該物質的去除效率造成影響，并對過程中可能會產生致癌副產物的多種處理工藝等方面息息相關，是毒理學、生態學、環境質量標準、污染控制與治理工程等研究十分關注的問題，因此，對有機質相關的研究是目前科研工作中的一大熱點[4-5]。

三維激發-發射矩陣(EEM)是一種操作簡單、消耗量小、成本低廉、分析迅速、靈敏度高的技術，但是單獨使用EEM，則會出現熒光峰疊加、同類熒光峰的位置不同、無法識別等局限問題。Stedmon等[6]最早提出可有效識別EEM中信息成分并追蹤它在環境中行為的平行因子分析方法(PARAFAC)，如式(1)。

(1)

其中：F——熒光因子數；

xijk——第i個樣品在發射波長(Em)j和激發波長(Ex)k處的熒光強度；

εijk——模型殘差；

aif——負載矩陣A中的元素；

bjf——負載矩陣B中的元素；

ckf——負載矩陣C中的元素。

aif與樣品i中fth分析物的濃度(例如摩爾)成正比。bjf與fth分析物在發射波長j處的熒光量子效率(作為熒光發射的吸收能量的分數)線性相關。因此，具有典型元素bjf的矩陣是fth分析物的發射光譜的估計，直至達到標度。同樣，ckf與在激發波長k下的比吸收系數(例如摩爾吸收率)線性成比例。F定義了模型中組件的數量，殘差矩陣εijk代表了模型未考慮的可變性。通過最小化殘差平方和的過程找到模型[6]。該模型是通過交替最小二乘算法最小化殘差平方和來計算的。

多項研究表明，該方法可以去除散射峰所影響的光譜區域，如將瑞利峰以下的EEMs區域設為0，通過從樣品光譜中減去Milli-Q水光譜來去除拉曼效應區域。對高殘差值和杠桿值的樣本采用非負性約束，將高殘差值和杠桿值剔除為離群值，再進一步分析前應通過離群值函數去除[7]。通過殘差分析、半剖分分析、隨機初始化和目視檢測各組分的光譜形狀，驗證最優熒光DOM組分的數量[4]。現可使用Matlab上的DOM Fluor工具箱、efc平臺等可進行PARAFAC[6-7]。

三維熒光光譜-平行因子分析(EEM-PARAFAC)集成了EEM經濟、高效、選擇性好、靈敏度高且不破壞樣品結構等諸多優點。該方法不僅解決了單獨使用EEM出現的弊端，同樣還擁有了PARAFAC化繁為簡的特點，將大量的樣本數分解成單個的熒光成分，從而確定獨立熒光成分的強度和位置，還可用因子得分比值替代EEM中峰強度比值對水體進行空間區域的特征分析[8]。因此，EEM-PARAFAC擁有更系統和全面解釋數據和分析數據的特有優勢，易于分析DOM的結構組成等，有著非常廣闊的應用前景。本文通過歸納和總結EEM-PARAFAC表征DOM的來源、結構、降解和吸附絡合的相關研究，為未來該研究的進一步發展提供數據參考。

1 有機質來源

通過分析、研究和表征環境污染的源頭、源強及類別，為有效全面地了解和深入研究污染的環境行為特性、生態系統的維持穩定及影響、污染的控制修復治理提供基礎理論依據。

利用EEM-PARAFAC方法，發現不同土地利用類型、地區、時期、用途來源的DOM等，都會導致其中的結構和性質的不同。例如，兩種不同土地類型來源的有機質差異較大，森林和濕地沉積物相比較之下，森林土壤中DOM的芳香性、疏水性分數和分子大小更高，原生源沉積物比具有陸地腐殖質樣物質的土壤中類蛋白組分更高(與低聚縮芳烴結構和高含氧官能團有關)[5]；例如，不同植物來源的藻類為主的沉積物和大型植物為主的沉積物，藻類為主的沉積物中DOM類蛋白質物質多于大型植物為主的沉積物中的DOM(C峰強度較低的藻類衍生DOM具有高蛋白低腐殖質的特征)[9]；例如，不同產生來源的DOM，水中陸生源DOM含有的芳環結構多于自生源DOM，其腐殖化程度、芳香性、疏水性高[10]；例如，不同地區的土壤，黑龍江黑土、四川紫土和浙江紅土的DOM腐殖質樣物質較多，貴州黃土和廣東、廣西紅土的芳香度較低，微生物源蛋白樣成分C3比例較高[4]；例如，不同時段的來源，冬季DOM中的類色氨酸主要來源陸地和長江口，夏季海水輸入增多，光化學降解增多，微生物利用活性有機物增加，類腐殖質C4(峰值M)發生明顯變化等[11]，不同的來源導致DOM的分子結構千差萬別。EEM-PARAFAC方法涉及熒光EEMS采集、數據處理和PARAFAC擬合兩種算法，兩種算法都是根據熒光組分(熒光團)的相對組成生成指紋[12]。通過繪制得分矩陣，將成分得分相似的水樣分組，可對不同來源水樣進行客觀分類。該方法相比較現在大量使用的穩定同位素分析方法而言，雖無法溯源至具體某一種物質，但EEM-PARAFAC分析方法不必對各污染源與污染地點的物質進行比對、追蹤和分析校對，就可將污染物的來源方向判定清楚，之后通過有針對性地使用同位素等其他方法進行定向追蹤，可大大節省了時間和精力成本。表1為EEM-PARAFAC分析DOM后得到幾種來源的組分情況。

表1 熒光光譜參數描述

未來通過對不同來源數據(土壤、河流、廢水、生物糞便、雨水等)的不斷補充，EEM-PARAFAC方法已被廣泛應用于土壤和水體的研究中，且因其易于實時監測，未來將逐漸成為各方面辨別污染物來源的便捷方法之一，通過查詢數據庫得知有機質的主要來源和未來應重點關注區域內的治理方向。

2 DOM分子結構

熒光強度和熒光峰都與結構之間關系密切，而熒光峰、熒光強度又與性質和活性官能團密切相關，所以結構的研究有利于進一步了解和分析DOM在整個環境中的遷移轉化及作用機理和規律，進而研究多種物質與DOM相互作用，深入了解DOM在環境中的變化行為，為今后的相關環境研究和修復提供科學依據。

利用EEM-PARAFAC對DOM分子結構的研究已被廣泛使用，因EEM-PARAFAC不僅可分離出熒光峰的種類，同時還可確定熒光峰的強弱，跟蹤芳香族胡敏酸分子的分子大小變化，從而對DOM進行定性和定量的分析。通過EEM-PARAFAC技術，DOM在結構上的部分相關研究如表2所示。

隨著環境、來源等外界條件的改變和影響，DOM各組分中的結構與成分都會發生一定的改變，從而致使DOM顯現出不同的性質。例如，腐殖質分子在堿性溶液中呈現出線性結構，暴露出許多別的試驗中未檢測到的熒光基團[23]；城市區域DOM以類腐殖質物質為主，占比達到61.3%，而城鄉結合區域由于受到更多的生活污水排放的影響，類蛋白質物質的比例最高，為59.4%(羧基官能團、芳環氨基酸和芳香結構的占比差異，芳香結構在某種程度上可打破π*→π轉變等)[24]。這一系列的影響改變了分子結構，而分子結構的不同又會造成波長的藍移和紅移、熒光強度的強弱變化的不同以及熒光峰的不同等。反之，也可通過熒光峰的不同、熒光強度的不同、波長位移的變化，推理出分子結構的變化。

“素養”一詞的含義比“知識”和“技能”更加寬廣。“知識”與“技能”主要涉及具體學科領域的知識和基本技能，而素養是一個復雜的結構，其所涉及的內涵并非單一維度，而是多元維度的。核心素養不僅僅是知識技能，更重要的是正確的價值觀念、必備的品格和關鍵能力。

通過觀察光譜中各組分的波長，會發現光譜中常常出現從較長的波長區域逐漸移到較短的波長區域(藍移)，從較短的波長區域逐漸移到較長的波長區域的現象為紅移現象，對此類現象的解釋有：發射波長發生紅移，表明分子量和共軛部分增加，但具有脂肪族部分的π-π系統較少或共軛系統較少[25]；色氨酸殘基被蛋白質包裹時，發射光譜可能發生藍移[25-26]；微生物熒光峰發生藍移，是因為一些芳香環被酸和堿分解、轉化為更小的片段[23]。前人早已經歸納得出藍移和紅移是因為羧基、羰基、氨基、烷氧基等官能團含量的增多或減少。藍移和稠環芳烴的分解、減少和大轉小分子的結構相關(線性結構變成非線性結構、熒光波長變短、π電子系統的減少、羰基、羥基和氨基等官能團的消失、鏈狀結構及芳香環上共軛基團的減少等)；而紅移則是與分子量[4]、芳香性[27]、共軛部分[25]和特定熒光基團(羰基、羧基、羥基和氨基等)等部分的增加相關。

對于熒光強度，以羥基、甲氧基、氨基等低芳香性和剛性、共平面性結構為主的相對分子質量小的DOM產生的熒光強度較強，反之，分子結構以羧基、羰基等吸電子基團為主的相對分子質量大的DOM產生的熒光強度較弱。而對于熒光峰，部分研究表明Em<380 nm的熒光峰是基于含苯環的熒光團(如羥基和氨基)，Em>380 nm的熒光峰則是基于多環芳族的結構[26]。此外，也有研究表明不同波長的熒光峰與DOM中各組成分有關，例如較短的激發和發射波長熒光峰與簡單的芳香蛋白質類物質有關(酪氨酸)，較長激發波長和短發射波長熒光峰與溶解性微生物代謝產物有關(類酪氨酸、類色氨酸、類蛋白質等)，長激發和發射波長熒光峰與類腐植酸有關，短激發波長和長發射波長熒光峰與類富里酸物質有關等[27-29]。

分子結構是導致DOM各種反應的關鍵因素，通過針對DOM的分子結構特質，可將物質表面的峰值及熒光強度等參數變化、本身所具有的特征與內在結構變化相結合，從而進一步深入挖掘DOM分子結構與其他功能特征變化之間所存在的相關性及差異性[27-29]。

3 DOM降解

DOM的降解對環境中諸多污染物的降解具有一定的影響作用，也是NOM生物地球化學循環研究的關鍵，探究DOM降解機理和影響因素，對人類生存發展和環境保護以及為建立合理的生態風險評價和相關污染物的防控措施具有重要意義。光降解和生物降解舉例如表3所示。

表3 EEM-PARAFAC在DOM降解研究的應用

自然界中，DOM的降解主要可分為生物降解和光降解兩種降解方式。二者都是對DOM進行降解，但相較而言，光降解DOM的降解速度和芳香度的還原速度都強于生物降解[36]。

DOM的生物降解，是指微生物對DOM的利用，維持其生命活動。生物降解與光降解最大的區別在于，生物降解主要降解DOM中的類蛋白組分，例如通過EEM-PARAFAC的熒光成分可知對生物降解的抗性為腐植酸樣組>酪氨酸樣組>色氨酸樣組[37]；生物降解焦化廢水DOM中的類蛋白質物質會高于類腐殖質，因為類蛋白由氨基蛋白酶和多肽等較為簡單分子結構、分子縮合度較低的有機物質組成，易于降解[38]。單一討論生物降解DOM中的蛋白質，仍然會出現多種情況，例如生物降解率都隨陸地衍生芳香族化合物比例的增加而降低[39]；親水性類蛋白比疏水性類蛋白更易于被微生物降解；銅綠微囊藻和背星囊藻相比較卵形隱藻釋放的類蛋白，前者更易降解[40]，這都與不同來源的DOM內在結構相關。總之，生物降解DOM多數會讓其腐殖化程度增加、芳香性減小、不飽和度降低、氧化程度增加、極性增加等。

結果顯而易見，降解DOM的整個過程都受到了各種各樣因素的影響，但各種因素最終是通過改變DOM的分子結構和官能團，從而影響DOM的降解效果。通過EEM-PARAFAC的各組分熒光強度和組分變化情況，就可準確得出其中哪部分物質發生變化，但該分析方法并不能對分子結構的具體變化進行詳細描述和呈現，這時就需要結合紅外光譜等方法進一步分析。

4 吸附絡合

DOM參與了各種關鍵的環境和生態過程，特別是在重金屬(HMs)和持久性有機污染物的生物地球化學循環和運輸過程中。在有機污染物、HMs等物質和DOM的作用中，其作用力多種多樣，例如范德華引力、靜電吸引、π-π共軛效應、疏水性作用、電子給體/電子受體和陽離子橋等[46]，但EEM-PARAFAC方法，能較為準確地評估和分析它們之間的反應，EEM-PARAFAC方法已成為探索機制的重要工具，它們不僅可以減少重疊峰的干擾，還可以提供抗生素、HMs等物質遷移、對生物的毒性、生物利用度等定性、定量和特異性的相關指標[47]。這里主要介紹抗生素、HMs與DOM之間的吸附絡合反應。

DOM與抗生素的吸附反應受多方面的影響，但不同的抗生素與DOM作用的組分不同，例如羅克沙胂(ROX)、磺胺喹諾啉鈉(SQ-Na)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)、土霉素(OTC)、四環素(TC)和紅霉素(ERY)等都對DOM中的酪氨酸類和色氨酸類的成分(類蛋白組分)有顯著的猝滅反應，其中SMZ優先與DOM中類酪氨酸成分作用，之后是類色氨酸[48]。主要與類腐植酸組分有較為明顯的猝滅反應有雙酚A、卡馬西平等，布洛芬等則主要同類富里酸有猝滅反應[46]。DOM中的O-H、C-H、C-O、N-H、酰胺I和酰胺II，以及芳香族化合物和脂肪族化合物都可與TC反應，蛋白質樣熒光團的活性位點酰胺和脂肪族主要與DOM絡合的官能團，因此，類蛋白質與TC絡合產生的猝滅效應最為明顯[9]。傳統的類腐殖質相比較類色氨酸組分，磺胺甲惡唑(SMX)主要與類腐殖質反應，腐植酸的-COOH基團能吸附SMX的-NH2并與之反應，Li等[49]猜測是因為SMX的外層是吸電子基團的磺酰胺苯環，這導致苯中不存在電子態，使其成為π電子受體。類似地，胡敏酸的-OH、-O和-NH2是給電子基團，苯骨架富含電子，并且也是π-π電子給體，因此，SMZ可以被π-π電子供體和受體兩者吸附，SMX的N-H易于在胡敏酸表面共享來自H+的電子，并形成弱氫鍵；SMX的結構中有兩個S=O帶，它們是電子不足的，容易與胡敏酸的-COOH和-OH形成氫鍵。

但眾多研究已然表明，大多數的抗生素對含有苯環和給電子基團的類蛋白質物質(Em<380 nm的熒光峰)的猝滅效應(NOM的微環境和構象的變化)高于含有多環芳烴結構的腐殖質物質(Em>380 nm的熒光峰)[9]。不同種類的抗生素與DOM的反應不同，舉例如表4所示。

表4 EEM-PARAFAC在DOM與抗生素反應的研究應用

DOM與金屬的絡合反應，同樣受多方面因素的影響，例如含有許多與金屬結合的酚類、羥基和羧基官能團的天然非晶態交聯芳香三維聚合物木質素所衍生的腐植酸能與金屬離子發生較好的絡合反應。但酚類(-OH)、氨基、羧基、羥基和羰基等官能團(配位體)及含量在其中發揮十分重要的作用。例如銅與DOM的反應，與分布于低分子量DOM中類腐殖質和類富里酸的結合親和力高于分布于高分子量DOM中類蛋白的反應，其原因歸功于芳香族酸性官能團(酚羥基、酚類位點)的存在，而銅與其中的腐殖質反應，腐殖質中高分子量組分因具有較高芳香性，擁有更多的結合電位，因而結合親和性高于低分子量的芳香性組分[52-53]；鉛和Ca(Ⅱ)與類腐植酸的親和力高于類富里酸，其中Ca(Ⅱ)主要與其中的羧基類官能團結合；Cd(Ⅱ)與類富里酸組分的絡合能力強于類蛋白組分，也強于腐植酸組分的絡合能力，其歸因于Cd(Ⅱ)主要與DOM中的羧基發生絡合作用，在類富里酸組分中有大量羧基官能團、少量酚羥基官能團，而類蛋白組分中則含有大量酚羥基官能團、少量的羧基官能團[19]；Fe(Ⅲ)、Al(Ⅲ)主要與類腐殖質和類富里酸組分芳香族和羧基類結合，也可選擇性芳香類、類羧基類和酚類結合[54]，其中Fe(Ⅲ)先與胡敏酸中的腐殖質組分絡合，Fe(Ⅲ)與酯鍵合、醌型環、芳族基團、脂肪族基團和酚基反應[55]。一般情況下，金屬與DOM中的強點位酚羥基、含氮和含硫基團結合能力更強，因而大多數的金屬與類蛋白組分(含氮組分)的絡合能力更強[56]。

DOM的吸附絡合反應中，分子結構和官能團在其中扮演著重要的角色。在不同的環境條件下(pH、金屬濃度、來源、分子量、金屬種類等)都是通過改變金屬和DOM分子結構(官能團)的相關屬性來達到改變二者的相互作用，舉例如表5所示。

表5 EEM-PARAFAC在DOM與金屬反應的相關應用

5 結論

EEM技術結合PARAFAC方法能對NOM進行定性和定量的分析。本文簡述了EEM-PARAFAC在有機質4個方面：來源、分子結構、降解機理和吸附絡合的研究，發現分子結構可揭示和指引研究NOM與污染物相互作用的機理和研究方向發展。未來可通過EEM-PARAFAC對分子結構的進一步研究，將復雜多樣化的問題簡單化和系統化，將大大促進污染物與有機質反應的相關研究進展。本文對EEM-PARAFAC在有機質相關方面的研究內容結合分子結構，進行了部分歸納和總結，為今后NOM三維熒光光譜指紋數據庫的建立、NOM組分熒光特性指標標準的統一、污染物的快速識別分析和研究去除提供一定的幫助。