基于中性紅染色的原水藻類細(xì)胞快速檢測(cè)方法

馬 越，陳 琳，黃宗耀

(深圳市深水龍華水務(wù)有限公司，廣東深圳 518000)

水庫(kù)水季節(jié)性藻類激增是影響水廠水處理工藝的重要因素之一。藻類激增不僅會(huì)嚴(yán)重影響水質(zhì)，更有堵塞砂濾池的風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，藻類激增會(huì)使水體pH增高、總堿度降低，影響水處理效果[1]。藻細(xì)胞的死亡、腐敗會(huì)產(chǎn)生藻源性嗅味物質(zhì)，常規(guī)水處理工藝很難將其去除，進(jìn)而引起出廠水的嗅味風(fēng)險(xiǎn)[2]。此外，在針桿藻激增時(shí)，倘若不能及時(shí)預(yù)警并采取相應(yīng)措施，過多的針桿藻會(huì)堵塞砂濾池，嚴(yán)重影響生產(chǎn)。為使水廠能夠及時(shí)有效預(yù)警該情況，對(duì)水源水中藻類種屬及數(shù)量進(jìn)行快速檢測(cè)尤為重要。

隨著技術(shù)的發(fā)展，PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、基因芯片、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)被應(yīng)用到藻類檢測(cè)領(lǐng)域[3-8]，但是繁多的檢測(cè)方法中仍缺少兼具強(qiáng)普適性、高準(zhǔn)確性的適用于水廠化驗(yàn)室的快速檢測(cè)法。目前水廠化驗(yàn)室對(duì)水源水中藻類的檢測(cè)方法主要為葉綠素a測(cè)定法[9]和顯微鏡計(jì)數(shù)法。葉綠素a測(cè)定法多用于水廠在線儀表對(duì)水源水中藻類數(shù)量的監(jiān)測(cè)，由于水源水渾濁度高、雜質(zhì)較多、前處理不充分等，該方法存在檢測(cè)結(jié)果偏差較大、不能準(zhǔn)確反映水源水藻類含量、不能區(qū)分藻類種屬的問題。顯微鏡計(jì)數(shù)法是目前水廠化驗(yàn)室藻類計(jì)數(shù)的主要方法，通過顯微鏡與計(jì)數(shù)框進(jìn)行直接定量，前處理為沉淀法和抽濾萃取法[10]：沉淀法通常采用魯哥試劑固定48 h，利用虹吸法去除上清液，將剩余的25 mL藻細(xì)胞沉淀液轉(zhuǎn)移并定容到50 mL，利用顯微鏡進(jìn)行物種鑒定，定性、定量分析藻類的豐度，該方法耗時(shí)較長(zhǎng)，前處理和濃縮操作要求較高，需要有經(jīng)驗(yàn)的化驗(yàn)員完成；抽濾萃取法為直接使用0.45 μm的濾膜對(duì)1 L水樣進(jìn)行抽濾，濃縮到50 mL后取100 μL溶液鏡檢，該方法耗時(shí)較短，但存在部分小且透明的藻細(xì)胞不易被觀察到的問題，與國(guó)標(biāo)規(guī)定的魯哥試劑檢測(cè)方法存在一定的誤差，多用于應(yīng)急檢測(cè)。

已有研究表明，中性紅易溶解在脂類物質(zhì)中[11]，而微藻細(xì)胞表面的質(zhì)膜含有豐富的卵磷脂和膽固醇，因此，中性紅可用于微藻細(xì)胞染色。王帥等[12]發(fā)現(xiàn)，相較于5-氯甲基熒光素二乙酸酯、熒光素二乙酸酯，中性紅更適合于檢測(cè)船舶壓載水中微藻活細(xì)胞。王珂等[13]以銅綠微囊藻為材料，發(fā)現(xiàn)中性紅質(zhì)量濃度為2 mg/L染色15 min時(shí)，染色率達(dá)到98%以上，而常用的臺(tái)盼藍(lán)染色效率只能達(dá)到50%左右。由此可見，中性紅在銅綠微囊藻、船舶壓載水微藻活細(xì)胞的檢測(cè)中有較好的應(yīng)用效果，但其在藻類種屬較為復(fù)雜的水源水檢測(cè)中應(yīng)用較少。目前，實(shí)驗(yàn)室藻類檢測(cè)方法繁多，但是沒能找到一種或幾種適用于水廠化驗(yàn)室的精確度高、快速的檢測(cè)方法。在已有研究基礎(chǔ)上結(jié)合實(shí)際應(yīng)用的痛點(diǎn)，本研究圍繞水廠化驗(yàn)室藻類檢測(cè)沉淀法耗時(shí)長(zhǎng)、抽濾萃取法誤差較大等問題，嘗試將中性紅染色與抽濾萃取法相結(jié)合，利用中性紅可積聚在植物細(xì)胞質(zhì)或液泡內(nèi)的特性，對(duì)深圳某水庫(kù)中的藻細(xì)胞進(jìn)行短時(shí)染色檢測(cè)，結(jié)果顯示中性紅能夠快速、高效地使水庫(kù)水中常見的3種門23種屬的藻細(xì)胞著色。本研究為水廠化驗(yàn)室提供了普適性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高的快速藻細(xì)胞檢測(cè)方法。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選擇的藻種為不分種群的自然群體，取自深圳市某水庫(kù)。該水庫(kù)水溫均值為23 ℃，渾濁度均值為2.7 NTU，總氮平均質(zhì)量濃度為2.03 mg/L，總磷平均質(zhì)量濃度為0.015 mg/L。原水藻細(xì)胞量為2×105～9×106個(gè)/L，主要為綠藻、硅藻和藍(lán)藻。

1.2 染色劑的配制

中性紅[13]：取1 g中性紅粉末溶于100 mL蒸餾水中，30～40 ℃加熱，待中性紅溶解后，用濾膜過濾，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的中性紅儲(chǔ)存液，裝入棕色瓶中置于4 ℃保存。使用時(shí)用蒸餾水將中性紅溶液稀釋至所需濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

魯哥試劑[14]：將20 g碘化鉀溶于200 mL 冰醋酸(10%)溶液中，溶解后再加10 g碘，全部溶解后配制成碘質(zhì)量濃度為50 mg/mL的魯哥氏碘液，貯存于密閉的棕色試劑瓶中，避光保存。

1.3 細(xì)胞染色與鏡檢

中性紅：分別在1 L水樣中加入1.00、0.50、0.33、0.25、0.20 mL的中性紅儲(chǔ)存液，混合均勻，分別染色10、20、30、40 min，用0.45 μm的濾膜抽濾，隨后用25 mL蒸餾水洗脫，定容至50 mL后，取100 μL在顯微鏡(奧林巴斯BX51)下檢測(cè)，用拍攝系統(tǒng)(CMOS相機(jī)、萬深A(yù)lgaeC浮游生物鑒定計(jì)數(shù)軟件)記錄染色情況，并計(jì)數(shù)拍攝染色情況。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

魯哥試劑：在1 L水樣中加入10 mL的魯哥氏碘液，混合均勻后自然沉降48 h，利用虹吸方法去除上清液，將剩余的25 mL藻細(xì)胞沉淀液轉(zhuǎn)移并定容到50 mL，取100 μL，在同樣條件下拍攝染色情況，并計(jì)數(shù)拍攝染色情況。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

染色后采用100 μL浮游植物計(jì)數(shù)框鏡檢藻細(xì)胞。

染色率(r)計(jì)算如式(1)：藻細(xì)胞被中性紅染成紅色，每個(gè)視野里分別計(jì)算著色細(xì)胞和未著色細(xì)胞。

r=B/(A+B)×100%

(1)

其中：r——染色率；

A——視野中未著色細(xì)胞數(shù)，個(gè)；

B——視野中著色細(xì)胞數(shù)，個(gè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分析組內(nèi)檢測(cè)結(jié)果的精密度，計(jì)算如式(2)。

RSD=(SD/X)×100%

(2)

其中：SD——標(biāo)準(zhǔn)偏差；

X——算數(shù)平均值。

組間分析：(1)采用中性紅檢測(cè)均值相對(duì)于傳統(tǒng)魯哥試劑檢測(cè)均值的偏差來表示準(zhǔn)確性；(2)采用組間單因素方差分析進(jìn)行中性紅檢測(cè)均值相對(duì)于傳統(tǒng)魯哥試劑檢測(cè)均值的差異性分析。

2 結(jié)果和討論

2.1 中性紅染藻細(xì)胞的濃度和時(shí)間

染色劑濃度對(duì)細(xì)胞染色存在較大影響，通常低濃度染色效果不好，濃度過高可能影響細(xì)胞活性。為探究中性紅染色的最適質(zhì)量濃度，本研究將10 mg/mL中性紅儲(chǔ)存液稀釋為10.0、5.0、3.3、2.5、2.0 mg/L進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示，10.0 mg/L時(shí)染色過深，不適合鏡檢計(jì)數(shù)，2.0 mg/L染色效果較差，染色率<30%，故而排除這兩種染色濃度。如圖1所示，隨著中性紅濃度的升高，染色率逐漸增高，質(zhì)量濃度增大至5.0 mg/L時(shí)染色率雖有明顯提高，但是藻細(xì)胞出現(xiàn)明顯的聚集現(xiàn)象，影響觀察和計(jì)數(shù)；質(zhì)量濃度達(dá)到3.3 mg/L時(shí)，染色率大于75%，明顯優(yōu)于魯哥試劑經(jīng)48 h固定的染色率。結(jié)果表明，使用3.3 mg/L中性紅對(duì)水源水中藻細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)效果最佳。

圖1 魯哥試劑和不同濃度中性紅對(duì)染色效果的影響

確定針對(duì)水源水染色時(shí)中性紅的最佳使用濃度后，本研究繼續(xù)使用3.3、2.5 mg/L中性紅對(duì)水源水中藻細(xì)胞分別染色10、20、30、40 min，重復(fù)染色3次，計(jì)算染色率。如圖2所示，在10～30 min，隨著染色時(shí)間的增長(zhǎng)，染色率增加；30 min后染色率開始下降。該試驗(yàn)結(jié)果表明，3.3 mg/L中性紅染色30 min鏡檢效果最佳，染色率大于80%。

圖2 染色時(shí)間對(duì)染色效果的影響

2.2 基于中性紅快速檢測(cè)的準(zhǔn)確性分析

中性紅可將藻類檢測(cè)時(shí)間縮短到30 min，相對(duì)于常規(guī)魯哥試劑48 h檢測(cè)有較大的提升，接下來，本研究連續(xù)5周使用中性紅(3.3 mg/L染色30 min)和經(jīng)典方法魯哥試劑[15](固定染色48 h)檢測(cè)深圳某水庫(kù)藻細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果如表1所示，中性紅快速染色檢測(cè)法的檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)魯哥試劑檢測(cè)方法的結(jié)果偏差在-7.74%～3.12%，小于±10%。對(duì)兩種檢測(cè)方法進(jìn)行組間單因素方差分析，P值為0.970 6。以上結(jié)果表明中性紅檢測(cè)法可作為替代常規(guī)魯哥試劑的快速染色檢測(cè)法，具有較好的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

表1 基于中性紅快速檢測(cè)的準(zhǔn)確性分析

2.3 中性紅快速檢測(cè)法在深圳某水庫(kù)水藻類檢測(cè)中的應(yīng)用

藻類是含有光和色素的低等植物，多數(shù)個(gè)體微小，需借助顯微鏡檢測(cè)。部分藻細(xì)胞含有大而明顯的液泡，例如硅藻門中的直鏈藻、針桿藻、菱形藻，該類藻細(xì)胞便于鏡檢觀察；部分藻細(xì)胞小且透明，不便于鏡檢觀察，例如綠藻門的小球藻、空星藻、四角藻、卵囊藻、鼓藻等。已有研究表明，中性紅可以通過細(xì)胞攝取進(jìn)入細(xì)胞并滯留在溶酶體內(nèi)[16]。在活細(xì)胞中，中性紅可將液泡染為紅色；當(dāng)細(xì)胞死亡后，中性紅會(huì)充滿整個(gè)細(xì)胞[17]。

鑒于此，本研究將中性紅與抽濾萃取法相結(jié)合，以水源水中藻細(xì)胞為檢測(cè)對(duì)象，探究了染料的最佳使用濃度和染色時(shí)間，并將該檢測(cè)方法應(yīng)用于深圳某水庫(kù)水藻細(xì)胞的檢測(cè)中。取1 L水庫(kù)水于燒杯中，使用質(zhì)量濃度為3.3 mg/L的中性紅染色30 min，抽濾后鏡檢，結(jié)果如圖3所示，中性紅能夠快速、高效地使水庫(kù)水中常見的3個(gè)門的藻細(xì)胞著色。該方法不僅能將藻細(xì)胞的液泡染為紅色(圖3中的綠藻門小球藻屬、柵藻屬、盤星藻屬、卵囊藻屬；藍(lán)藻門橋彎藻屬、微囊藻屬等)，而且能夠使藻細(xì)胞的輪廓呈現(xiàn)出清晰的紅色，便于鏡檢分析，較好地解決了小且透明的藻細(xì)胞的檢測(cè)難題。使用該方法對(duì)深圳某水庫(kù)水藻類進(jìn)行連續(xù)6個(gè)月的檢測(cè)，結(jié)果如表2所示，該水庫(kù)水藻類主要包含5個(gè)門28個(gè)屬，其中，最常見的為硅藻門、綠藻門、藍(lán)藻門中的26個(gè)種屬，該水庫(kù)水大于85%的常見藻類(24個(gè)屬)能夠被中性紅染色。綜上，中性紅快速檢測(cè)法能夠較好地解決小且透明的藻細(xì)胞的鏡檢難題，對(duì)于水庫(kù)水中的主要藻類有較好的染色效果。

圖3 中性紅快速檢測(cè)法的顯微鏡檢測(cè)結(jié)果

表2 深圳某水庫(kù)主要藻類和中性紅染色

3 結(jié)論

(1)本文將中性紅與抽濾萃取法相結(jié)合，搭建基于中性紅染色的水源水藻細(xì)胞快速檢測(cè)方法。中性紅染色效果明顯，染色最佳質(zhì)量濃度為3.3 mg/L，染色時(shí)間為30 min，檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)魯哥試劑檢測(cè)結(jié)果相一致(偏差小于±10%)。該方法既能確保準(zhǔn)確性，又能將檢測(cè)時(shí)間從48 h縮短到30 min。

(2)基于中性紅染色的水源水藻細(xì)胞快速檢測(cè)方法能夠快速、高效地使水庫(kù)水中常見的3個(gè)門24個(gè)屬的藻細(xì)胞著色。該方法不僅能將藻細(xì)胞的液泡染為紅色，而且能使藻細(xì)胞的輪廓被標(biāo)記為紅色，便于鏡檢分析，有效地解決了小且透明的小球藻、空星藻、四角藻、卵囊藻、鼓藻、菱形藻、橋彎藻、微囊藻的檢測(cè)難題，為提高水廠化驗(yàn)室藻類檢測(cè)效率和應(yīng)對(duì)原水水質(zhì)突變能力提供了有力的支持。