基于網絡藥理學和分子對接探討紫蘇子治療糖尿病心肌損傷的機制*

彭志堅 陳正濤 鄧 斌 魏山寅 范治力 宋銀枝△

糖尿病心肌損傷(Diabetic heart injury,DMI)是糖尿病主要并發癥之一，有研究表明在排除了冠心病或風濕性心臟病病史后，糖尿病患者的心衰風險仍增加4～5倍，DMI已經成為糖尿病患者致死的重要原因之一[1]。《本經逢原》認為：“蘇子性能下氣，故胸膈不利者宜之”，現代藥理學研究發現紫蘇子提取物能增加糖尿病小鼠的胰島素敏感性和減少氧化應激反應[2]，但紫蘇子在治療DMI的保護作用機制研究較少。網絡藥理學目前被廣泛應用于預測單味中藥或復方作用機制，其通過構建“成分-靶點-基因-疾病”的分子網絡闡述中藥生物學功能和作用機制的方法與中藥及其復方的多成分、多靶點、多通路協同作用的特點相吻合。本文采用網絡藥理學與分子對接的方法對紫蘇子治療DMI的潛在機制及作用網絡展開了研究。

1 材料與方法

1.1 紫蘇子主要化學成分和靶點篩選通過TCMSP數據庫以生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18作為ADME篩選條件收集紫蘇子主要化學成分對應的靶點[3，4]，再經UniProt數據庫轉化為基因名。

1.2 疾病靶點的篩選將“Diabetic heart injury”及“Diabetes cardiomyopathy”作為關鍵詞，從GeneCards數據庫和OMIM數據庫檢索獲得DMI相關的疾病靶點并刪除重復基因。

1.3 活性成分-交集靶點網絡圖的構建及交集靶點靶蛋白相互作用(PPI)網絡構建紫蘇子和DMI相關靶點運用Venny 2.1.0獲得交集靶點，利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制“活性成分-交集靶點”網絡，借助STRING 11.0平臺進行PPI網絡的構建，限定物種為“Homo sapiens”，置信度為中置信度0.4，其余參數均為默認設置，得到下載tsv格式文件，將文件導入Cytoscape 3.7.2作圖。應用軟件中的cytoNCA插件對網絡拓撲參數進行篩選，篩選出Degree值前9個的節點作為關鍵靶點。

1.4 GO與KEGG通路富集分析將交集靶點數據導入Metascape平臺，設置P<0.01，分析紫蘇子主要的生物學過程與代謝通路并進行富集分析，將數據運用微生信平臺進行可視化處理。

1.5 分子對接將紫蘇子核心成分與PPI網絡中篩選出的9個核心蛋白進行分子對接。從TCMSP數據庫下載紫蘇子核心成分的MOL2格式文件，從蛋白質數據庫獲得9個核心蛋白的3D結構。利用AutoDockTools 1.5.6和PyMOL 2.3.4軟件關鍵靶點蛋白質進行：去除水分子，分離配體和受體，加入極性氫，計算Gasteiger電荷，分配AD4類型，將小分子配體柔性鍵設置為可旋轉等操作。對接過程使用AutoDock Vina 1.1.2執行，得到結合能數據，最后運用PyMOL 2.3.2軟件展示結合活性最高的模型。

2 結果

2.1 紫蘇子有效成分和靶點篩選根據1.1篩選條件共篩選出16個化合物，剔除預測不到靶點的化合物共得到14個有效成分。考慮到紫蘇子主要成分為亞麻酸及亞油酸，其中亞麻酸含量高達50%～62%[5]，故將此二者也納入，最終共篩選出有效成分16個。見表1。其主要活性成分對應的靶點經UniProt數據庫轉化為相應的基因ID名稱，剔除重復靶點后共得到139個有效作用靶點。

表1 紫蘇子活性成分表

2.2 與DMI相關疾病靶點篩選通過GeneCards數據庫獲得與DMI相關的疾病靶點并刪除重復基因，共得7345個靶點，取兩倍中位數后獲得靶點2150個；通過OMIM數據庫獲得靶點584個。合并上述獲得的疾病靶點，并再次剔除重復靶點，最終獲得相關疾病靶點2579個。

2.3 活性成分交集靶點成分-靶點-疾病網絡圖的構建將與DMI相關的疾病靶點與紫蘇子預測作用靶點取交集繪制韋恩圖,得交集靶點105個(見圖1)。利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制“活性成分-交集靶點”網絡(見圖2)，超過14個靶點的活性成分有木犀草素(Luteolin)、花生四烯酸(Arachidonic acid)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、亞麻酸(Linolenic acid)、豆甾醇(Stigmasterol)、β-胡蘿卜素(Beta-carotene)，這些成分可能是治療糖尿病心肌損傷的主要有效成分。

圖1 紫蘇子-DMI交集靶點

圖2 活性成分交集靶點網絡圖

2.4 靶蛋白相互作用(PPI)網絡構建根據1.3所述方法構建PPI網絡，共有105個節點，1500條邊，應用軟件中的cytoNCA插件對網絡拓撲參數進行篩選，篩選出Degree值大于60的靶點作為核心靶點9個。見表2。

表2 紫蘇子治療DMI的核心靶點及degree值

2.5 交集靶點GO和KEGG富集分析將交集靶點進行GO和KEGG富集分析(見圖3、圖4)。結果顯示，生物過程主要涉及細胞氮化合物反應、有毒物質反應、無機物反應、細胞成分運動的正調控、炎癥反應等，細胞組成中主要影響膜筏、細胞質的核周區域、突觸后膜、受體復合物、胞質泡膜等，分子功能主要包括蛋白質域特異性結合、蛋白質同源二聚活性、脂質結合、激酶結合、轉錄因子結合等方面。參與調控多個KEGG信號通路，主要有癌癥通路、PI3K-Akt信號通路(見圖5)、前列腺癌、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化、細胞凋亡、TNF信號通路、鈣信號通路等。

圖3 交集靶點GO富集分析條形圖交集靶點GO富集分析條形圖

圖4 交集靶點KEGG富集分析氣泡圖

圖5 PI3K-AKT信號通路圖

2.6 分子對接將核心成分木犀草素、花生四烯酸、β-谷甾醇、亞麻酸、豆甾醇與核心靶點ALB、AKT1、IL6、VEGFA、TNF、TP53、MAPK1、CASP3、EGFR進行分子對接，計算核心化合物和關鍵靶點之間的結合能以預測它們的親和力，結合能低于0表明2個分子能夠自發結合，結合能負值越高提示構象越穩定。分子對接結果(見表3)核心化合物與靶蛋白的最低結合能都小于0，說明紫蘇子核心成分能夠很好地與關鍵靶點結合，這也一定程度表明了紫蘇子治療DMI的科學性。綜合分析木犀草素、花生四烯酸、β-谷甾醇、亞麻酸、豆甾醇可能是紫蘇子治療DMI的關鍵成分，可作為未來紫蘇子單體成分提取用于治療糖尿病心肌病的研究對象。

表3 紫蘇子活性成分與DMI潛在作用靶點的分子對接結果

3 討論

對紫蘇子治療DMI的作用網絡與潛在機制的研究表明：紫蘇子治療DMI的關鍵成分可能是木犀草素、花生四烯酸、β-谷甾醇、亞麻酸、豆甾醇。木犀草素能改善DMI，主要是通過逆轉心肌組織中AR、NOS及Na+-K+-ATPase活性減輕氧化應激反應[6]，及抑制RhoA/ROCK2信號通路減少糖尿病小鼠心肌細胞凋亡[7]。β-谷甾醇具有抗炎作用，其機制是增強機體氧自由基清除能力[8]，減少NO的合成，抑制巨噬細胞IL-6活性，減少IL-1、TNF-α等炎性因子的分泌[9]。花生四烯酸能通過調節自由基生成、一氧化氮生成、炎癥反應和免疫反應等調節糖尿病的發病[10]。飲食中亞麻酸具有降壓、調脂等作用，從而保護心血管[11，12]。豆甾醇具有GLUT4葡萄糖轉運體靶向作用，通過增加GLUT4的轉運和表達改善2型糖尿病[13]。本研究通過網絡分析預測發現木犀草素、花生四烯酸、β-谷甾醇、亞麻酸、豆甾醇具有改善DMI的作用，亦有文獻證實上述5個單體成分具有改善糖尿病或者具有心血管保護作用，但目前針對DMI的相關研究相對較少，值得進一步研究。

從PPI網絡圖可發現ALB、AKT1、IL6、VEGFA、TNF、TP53、MAPK1、CASP3、EGFR等靶點可能為紫蘇子治療DMI的關鍵靶點。研究表明炎癥反應是DCM發病機制之一，炎癥小體可能是治療DCM的關鍵靶點，促炎細胞因子(如TNF-α、IL6等)的上調會影響有助于心臟病理性重塑和氧化應激的細胞群，包括心肌細胞、內皮細胞、成纖維細胞和平滑肌細胞[14]。EGFR可加速糖尿病性心肌病大鼠心肌纖維化[15]。Akt1能促進生理性心肌肥大而抑制病理性心肌肥大[16]。CASP3屬于促凋亡因子，在細胞凋亡信號的刺激下參與糖尿病胰島β細胞的凋亡[17]。VEGFA能誘導血管內皮細胞增殖、促進血管新生，預防VEGFA的下調可維持毛細血管密度，從而改善糖尿病對小鼠心臟的損傷[18]。有文獻指出，抑制p53能阻止早期細胞凋亡和細胞衰老、減少糖酵解和抑制血管生成，進而改善糖尿病性心肌病[19]。分子對接顯示，紫蘇子關鍵成分與以上關鍵靶點均能有良好的結合，說明紫蘇子關鍵成分和DMI關鍵靶點有結合活性。

GO分析顯示紫蘇子治療DMI主要通過細胞氮化合物反應、有毒物質反應、無機物反應、細胞成分運動的正調控、炎癥反應等生物過程發揮作用。KEGG信號通路分析主要集中在癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、前列腺癌、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化、細胞凋亡、TNF信號通路等。有研究顯示，糖尿病患者的AGE水平與血管僵硬度、頸動脈內中膜層厚度成正相關[20]，AGE/RAGE系統的激活使得促纖維生長因子分泌增多，進而膠原沉積導致組織纖維化，導致心肌間質纖維成分增多，造成心肌纖維化、心功能障礙等[21]。PI3K/Akt通路信號通路的表達增加可以抑制核轉錄因子κB的表達，減輕炎癥反應，增加胰島素敏感性[22]，而長期攝食亞麻酸能通過激活PI3K-Akt信號通路有效減輕糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注損傷[23]。GLUT為PI3K/Akt信號通路的下游信號靶點，PI3K/Akt信號通路通過抑制GLUT-4向細胞膜異位，激活GLUT增加細胞攝取葡萄糖，降低血漿中葡萄糖的水平，從而減輕糖脂毒性[24]。豆甾醇具有GLUT4葡萄糖轉運體靶向作用，可能是通過PI3K/Akt信號通路發揮作用。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學及分子對接研究紫蘇子治療DMI的機制，發現中藥紫蘇子通過木犀草素、花生四烯酸、β-谷甾醇、亞麻酸、豆甾醇等藥效成分協同作用于ALB、AKT1、IL6、VEGFA、TNF、TP53、MAPK1、CASP3、EGFR等多個靶點，參與癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、前列腺癌、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化等多信號通路改善DMI，為紫蘇子的藥效物質基礎與作用機制研究提供方向，為進一步系統地開展紫蘇子單體治療糖尿病心肌病的研究及臨床應用提供理論依據。