模擬微重力下柚皮苷對T細胞共育的成骨細胞增殖分化的影響Δ

陳建興，尹文哲，孫奇峰，周 森，張亞龍，王 翌（哈爾濱醫科大學附屬第二醫院骨四科，哈爾濱 150086）

太空飛行中，暴露在微重力環境中的宇航員易出現骨密度降低、肌肉萎縮、腎功能降低、免疫功能紊亂等生理問題[1]。自從骨免疫學的概念首次提出以來，骨組織與免疫細胞之間的相互作用受到越來越多研究者的關注[2]。太空實驗研究表明，微重力下T細胞的激活顯著減少，白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、γ-干擾素等炎癥因子的分泌水平也顯著改變[3―4]。

骨碎補是一味補腎壯骨中藥材，具有抗炎、加速骨折愈合、預防及治療骨質疏松等功效[5―6]。筆者課題組的前期研究表明，在模擬微重力下骨碎補能夠促進成骨細胞-破骨細胞共育體系中的成骨細胞增殖，提高堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，上調Runt相關轉錄因子2（Runt related transcription factor 2，Runx2）和骨保護素的基因表達[7]。柚皮苷是從骨碎補中提取的活性成分，具有抗氧化、抗炎、降低膽固醇、改善微循環等多種藥理作用[8―9]。近年來，柚皮苷的骨保護作用被廣泛研究。有研究表明，柚皮苷在去卵巢大鼠骨質疏松模型中能夠促進骨形成，同時促進體外成骨細胞的增殖、提高ALP活性[10―11]；也可以提高傷口組織的生長因子水平，下調IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子α的mRNA表達[12]。本研究通過建立T細胞-成骨細胞共育體系，探究模擬微重力下柚皮苷對成骨細胞增殖分化的影響，以期為航空醫學應對失重性骨質丟失及臨床上防治廢用性骨質疏松提供一定的理論基礎和研究思路。

1 材料

1.1 實驗動物與細胞

3日齡SD乳鼠12只，由哈爾濱醫科大學附屬第二醫院實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號為SCXK（黑）2021-001，用于提取原代顱頂骨成骨細胞。小鼠T細胞購自賽百慷（上海）生物技術股份有限公司。實驗方案經哈爾濱醫科大學附屬第二醫院倫理委員會批準，批件號為SYDW2022-058。

1.2 主要儀器

X70型光學倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司；HF240型細胞培養箱購自德國Heraeus公司；DL-CJ-2NDⅡ型超凈工作臺購自東聯北方科技（北京）有限公司；ST-16R型高速冷凍離心機購自美國Thermo Fisher Scientific公司；NY 14831型離心管、430488型凍存管、96孔板購自美國Corning公司；Infinite M200型多功能酶標儀購自奧地利Tecan公司；Applied Biosystems 7500型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀購自美國ABI公司；PowerPacTMBasic電泳儀購自美國Bio-Rad公司；Tanon GIS2010全自動數碼凝膠成像系統購自上海天能科技有限公司；BP310P型稱量天平購自德國Sartorius公司；TY3062型旋轉細胞培養系統（rotary cell culture sys‐tem，RCCS）購自上海易擴儀器有限公司。

1.3 主要藥品與試劑

柚皮苷（批號PCS-201021，純度≥98%）購自成都植標化純生物技術有限公司；二甲基亞砜、DMEM培養基、Ⅱ型膠原酶、胎牛血清、PBS（貨號或批號分別為D8371、20210519、1225C071、11011-8611、20211115）購自北京索萊寶科技有限公司；RIPA裂解液、0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗、非離子型表面活性劑TritonX-100、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號分別為0803320200921、071019190812、080421211029、P0096、062521211026）購自上海碧云天生物技術有限公司；ALP試劑盒（批號20210722）購自南京建成生物工程研究所；茜素紅染液（批號0518A21）購自北京雷根生物技術有限公司；CCK-8試劑盒（批號209586）購自上海尚寶生物科技有限公司；TB Green實時熒光定量PCR MasterMix試劑盒、逆轉錄試劑盒（貨號分別為RR420A、RR036Q）購自日本TaKaRa公司；Runx2兔源抗體、IL-6兔源抗體、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）兔源抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號分別為BA12249456、BA12227886、BA09211756、BA01235136）購自北京博奧森生物技術有限公司。

2 方法

2.1 成骨細胞培養

SD乳鼠使用頸椎脫位法處死，乙醇消毒，無菌條件下分離取出顱頂骨，去除骨膜、血管等結締組織，將顱頂骨剪成碎骨片；加入0.25%胰蛋白酶作用30 min，棄去胰蛋白酶，再加入Ⅱ型膠原酶消化60 min，以1 200 r/min離心5 min，加入含10%胎牛血清及1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養基（以下簡稱“完全培養基”），制成細胞懸液，接種到培養皿中培養，之后每2 d換液1次。取第3代原代顱頂骨細胞經茜素紅染液染色后，置于顯微鏡下觀察，若有成骨細胞分化成熟的標志——礦化結節，則該原代顱頂骨培養的細胞為成骨細胞，之后選擇第3代成骨細胞進行后續實驗。

2.2 T細胞培養

將儲存于凍存管中的T細胞放入37℃水浴鍋內復蘇，期間輕輕搖晃，融化后放入超凈工作臺內，將細胞懸液轉移至離心管內，再加入10倍體積的完全培養基，以1 200 r/min離心5 min，棄去上清液，加入完全培養基，輕輕吹打均勻，接種到培養瓶，放入細胞培養箱，24 h后半量換液，之后每2 d換液1次。收集T細胞進行計數，調整細胞密度為5×105個/mL。

2.3 柚皮苷溶液配制

取柚皮苷17.4 mg，溶于6 mL二甲基亞砜中，配制成濃度為5×10－3mol/L的母液，在超凈工作臺內過濾除菌后用完全培養基將母液稀釋為1×10－5mol/L（此時二甲基亞砜終體積分數＜0.1%），再置于4℃冰箱保存備用。

2.4 實驗分組與處理

本實驗設正常重力對照組、正常重力柚皮苷組、模擬微重力對照組、模擬微重力柚皮苷組。正常重力對照組：正常重力下T細胞與成骨細胞共育（將T細胞與第3代成骨細胞按照20∶1的比例共同培養建立共育體系，下同）。正常重力柚皮苷組：正常重力下T細胞與成骨細胞共育，加入1×10－5mol/L柚皮苷溶液（劑量依據文獻[13]設置，下同）。模擬微重力對照組：模擬微重力下T細胞與成骨細胞共育。模擬微重力柚皮苷組：模擬微重力下T細胞與成骨細胞共育，加入1×10－5mol/L柚皮苷溶液。根據文獻[14]描述的實驗方法建立模擬微重力環境：將模擬微重力對照組和模擬微重力柚皮苷組中的細胞接種于RCCS內，加入胎牛血清5 mL，然后加入完全培養基，用注射器排盡氣泡。RCCS設置轉速為30 r/min，作用時間為2 d（期間若產生氣泡，立即將氣泡趕盡，以避免流體剪切力的影響）。正常重力對照組和正常重力柚皮苷組于培養瓶中常規培養2 d。

2.5 成骨細胞形態學觀察

收集“2.4”項下分組處理的成骨細胞，在低倍鏡視野（×40）下觀察各組成骨細胞的形態。

2.6 成骨細胞增殖率檢測

采用CCK-8法檢測。將“2.4”項下分組收集的成骨細胞進行濃度調整，以1×103個/孔接種于96孔板，每孔加入200 μL細胞懸液，培養箱孵育4 h，細胞貼壁良好后放入超凈工作臺，根據說明書要求向各孔中加入CCK-8試劑10 μL，輕輕搖晃均勻后放入細胞培養箱孵育2 h，溶液變橙色后取出。另設只加培養基、不加細胞的空白組同法操作。使用酶標儀檢測450 nm波長處的光密度（OD），計算各組細胞增殖率。細胞增殖率＝（給藥組OD－空白組OD）/（對照組OD－空白組OD）×100%。

2.7 成骨細胞ALP活性檢測

采用ALP試劑盒檢測。收集“2.4”項下分組處理的成骨細胞，吸棄培養液，用PBS反復潤洗后加入適量1%TritonX-100覆蓋細胞。顯微鏡下觀察細胞形態消失說明細胞已經裂解充分，然后把待測液體轉移至96孔板中，根據試劑盒說明書要求，使用酶標儀檢測520 nm波長處的OD；同時提取細胞總蛋白，通過BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，再計算各組ALP活性。ALP活性＝（檢測OD/標準OD）×酚標準液濃度/樣本蛋白濃度，其中標準OD為試劑盒中標準品檢測出的OD，酚標準液濃度為試劑盒標注濃度。

2.8 成骨細胞中Runx2、IL-6 mRNA相對表達的檢測

采用實時熒光定量PCR法檢測。按“2.4”項下操作分組處理細胞，分別提取各組細胞總RNA，行RNA純度檢測；逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行擴增，擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳；經實時熒光定量PCR反應后分析基因擴增的循環閾值（Ct值），以β-actin為內參基因，根據公式 2－ΔΔCt計算所得數值表示 Runx2和 IL-6的mRNA相對表達水平。反應條件：95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s（共40個循環）。引物序列及產物長度見表1。

表1 引物序列及產物長度

2.9 成骨細胞中Runx2、IL-6蛋白相對表達的檢測

采用Western blot法檢測。按“2.4”項下操作分組處理細胞，使用RIPA裂解液提取蛋白，測定總蛋白濃度。取定量后的蛋白與PBS混合，加熱變性后進行凝膠電泳；然后加入Runx2、IL-6、GAPDH一抗（稀釋度分別為 1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000），4 ℃孵育過夜；洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋度為1∶5 000），室溫孵育，顯影。使用Image J軟件分析蛋白條帶，以目的蛋白與內參蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示目的蛋白的相對表達水平。

2.10 統計學分析

實驗均重復3次以上。采用SPSS 26.0軟件進行數據分析，計量資料滿足正態分布時以±s表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 成骨細胞形態學觀察結果

顯微鏡下可見，與正常重力對照組比較，模擬微重力對照組成骨細胞密度降低，僅有少量聚集，細胞形態以圓形居多；與模擬微重力對照組比較，模擬微重力柚皮苷組成骨細胞成梭形或多角形，形態飽滿，成魚群狀聚集。結果見圖1。

圖1 各組成骨細胞形態學觀察顯微圖（×40）

3.2 成骨細胞增殖率檢測結果

CCK-8法檢測結果顯示，與正常重力對照組比較，正常重力柚皮苷組成骨細胞增殖率顯著升高（P＜0.05），模擬微重力對照組成骨細胞增殖率顯著降低（P＜0.05）；與模擬微重力對照組比較，模擬微重力柚皮苷組成骨細胞增殖率顯著升高（P＜0.05）。結果見圖2A。

3.3 成骨細胞ALP活性檢測結果

ALP試劑盒檢測結果顯示，與正常重力對照組比較，正常重力柚皮苷組成骨細胞ALP活性顯著升高（P＜0.05），模擬微重力對照組成骨細胞ALP活性顯著降低（P＜0.05）；與模擬微重力對照組比較，模擬微重力柚皮苷組成骨細胞ALP活性顯著升高（P＜0.05）。結果見圖2B。

圖2 各組成骨細胞增殖率及成骨細胞ALP活性比較

3.4 成骨細胞中Runx2、IL-6 mRNA相對表達的檢測結果

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，與正常重力對照組比較，正常重力柚皮苷組成骨細胞的Runx2 mRNA相對表達水平顯著升高、IL-6 mRNA相對表達水平顯著降低（P＜0.05），模擬微重力對照組成骨細胞的Runx2 mRNA相對表達水平顯著降低、IL-6 mRNA相對表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模擬微重力對照組比較，模擬微重力柚皮苷組成骨細胞的Runx2 mRNA相對表達水平顯著升高、IL-6 mRNA相對表達水平顯著降低（P＜0.05）。結果見圖3。

圖3 各組成骨細胞Runx2、IL-6 mRNA相對表達水平比較

3.5 成骨細胞中Runx2、IL-6蛋白相對表達的檢測結果

Western blot法檢測結果顯示，與正常重力對照組比較，正常重力柚皮苷組成骨細胞的Runx2蛋白相對表達水平顯著升高、IL-6蛋白相對表達水平顯著降低（P＜0.05），模擬微重力對照組成骨細胞的Runx2蛋白相對表達水平顯著降低、IL-6蛋白相對表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模擬微重力對照組比較，模擬微重力柚皮苷組成骨細胞的Runx2蛋白相對表達水平顯著升高、IL-6蛋白相對表達水平顯著降低（P＜0.05）。結果見圖4。

圖4 各組成骨細胞Runx2、IL-6的蛋白相對表達水平比較

4 討論

骨免疫學研究表明，骨細胞和免疫細胞在骨髓中共享相同的微環境，并存在復雜而密切的相互作用，例如T細胞及其分泌的炎癥因子被證明在骨質疏松、類風濕性關節炎等疾病中發揮了關鍵作用[15―17]。

既往研究結果顯示，T細胞在活化后產生IL-6，經核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路途徑促進破骨細胞活性、加強骨吸收，Runx2是骨形成過程中必需的轉錄因子，其可以激活骨形態蛋白表達，從而促進成骨細胞的進一步分化[18―20]。本實驗結果顯示，模擬微重力環境下IL-6的mRNA和蛋白相對表達上調的同時，成骨細胞增殖率、ALP活性、Runx2的mRNA和蛋白相對表達均明顯降低，提示IL-6可促進成骨細胞中NF-κB通路的激活，從而參與微重力對成骨細胞的負性調控作用。既往研究發現，將成骨細胞前體細胞MC3T3-E1培養于RCCS中，ALP、Runx2、骨鈣素等成骨標志物表達下調，IL-6水平異常升高，NF-κB信號分子磷酸化水平升高[21―22]。這些研究結果與本實驗結果一致，提示模擬微重力條件下IL-6水平的異常升高及Runx2水平的降低是成骨細胞功能抑制的重要因素之一。

有研究顯示，柚皮苷能夠通過抑制NF-κB活性來抑制成骨細胞炎癥因子的分泌，此外，柚皮苷能提高成骨細胞Runx2的水平，從而激活骨形態蛋白表達，并促進成骨反應[23―26]。本實驗結果顯示，柚皮苷作用于模擬微重力條件下T細胞-成骨細胞共育體系，能夠顯著抑制炎癥因子IL-6的表達，提示柚皮苷可能通過降低IL-6水平，抑制NF-κB通路活性，從而減輕炎癥反應。同時，本實驗結果發現，柚皮苷干預下成骨細胞增殖率、ALP活性、Runx2的mRNA和蛋白相對表達均出現明顯升高，這提示柚皮苷可通過抑制炎癥因子表達促進成骨細胞的增殖分化。

綜上所述，在T細胞-成骨細胞共育體系中，模擬微重力可以抑制成骨細胞的增殖分化能力；該條件下柚皮苷可以改善成骨細胞的增殖分化能力，其作用機制與IL-6水平的降低及Runx2水平的升高有關。