G6PD調控PI3K/Akt信號通路誘導肝癌細胞索拉非尼耐藥的機制研究Δ

楊蕙華，陳大紅，刁文婧，吳亞菲，李琴#a，劉皋林1，#b（1.上海交通大學藥學院，上海 0040；.上海交通大學醫學院附屬第一人民醫院臨床藥學科，上海 00080）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球發病率增長最迅速的癌癥之一，其主要危險因素包括肥胖、吸煙、乙型肝炎病毒及酒精性肝炎，患者的5年生存率僅20%[1]。索拉非尼是一種多激酶抑制劑，可抑制Raf激酶、血管內皮細胞生長因子受體、血小板衍生生長因子受體、Fms樣酪氨酸激酶3、原癌基因c-Kit及孤兒受體酪氨酸激酶等的活性，具有抑制腫瘤生長和阻斷腫瘤新生血管形成的雙重抗腫瘤效應[2]。2007年索拉非尼被批準用于手術不能切除的晚期HCC的一線治療，成為HCC治療的重大突破[3]，但隨之產生的耐藥問題給肝癌治療帶來了巨大的挑戰[4]。因此，闡明HCC索拉非尼耐藥的機制及尋找HCC治療的新靶點將具有重要臨床意義。

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydro‐genase，G6PD）是磷酸戊糖途徑的限速酶和關鍵酶，可促進磷酸戊糖代謝產生還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸而平衡氧化應激水平，且其高表達與多種惡性腫瘤（如腎細胞癌、肺癌等）的進展密切相關[5―7]。相關研究還發現，G6PD可促進非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌等對順鉑、紫杉醇及厄洛替尼產生耐藥[8―10]，因此，抑制G6PD可增強抗腫瘤藥物對耐藥細胞的毒性作用。目前，有關G6PD在HCC索拉非尼耐藥中的作用未見報道。基于此，本研究將探討G6PD在HCC索拉非尼耐藥中的作用機制，以期為尋找逆轉HCC索拉非尼耐藥的潛在靶點提供理論依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括BB150型細胞培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）、5424R型低溫離心機（德國Eppendorf公司）、J2-MC型高速冷凍離心機[貝克曼庫爾特商貿（中國）有限公司]、BD_Accuri_C6型流式細胞儀（美國BD公司）、Epoch 2t型全波長酶標儀（美國BioTek有限公司）、Tannon 5200型化學發光成像系統（上海天能科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

索拉非尼、G6PD抑制劑6-氨基煙酰胺（6-aminonicotinamide，6AN）、鹽酸嘌呤霉素、CCK-8試劑盒購自美國 MCE 公司（批號分別為 83807、87547、87126、100266）；Annexin V FITC Apop Dtec Kit I購自美國BD公司（批號0076884）；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養基購自美國Gibco公司（批號分別為2148169CP、8121521、2462637）；ECL發光試劑盒購自蘇州新賽美生物技術有限公司（批號P10300）；兔源蛋白激酶B（pro‐tein kinase B，Akt）、磷酸化 Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、磷脂酰肌醇 3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、G6PD抗體和小鼠源β-肌動蛋白（β-actin）抗體均購自美國CST公司（貨號分別為4685S、4060S、4257S、12263S、58169S）；兔源磷酸化 PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔免疫球蛋白G和HRP標記的羊抗鼠免疫球蛋白G均購自上海愛必信生物科技有限公司（貨號分別為abs130869、abs20002ss、abs20039ss）。

1.3 細胞

人肝癌細胞Huh7購自中國科學院化學與細胞生物學研究所。G6PD穩定過表達的肝癌細胞Huh7-G6PD及其對照細胞Huh7-CT購自上海和元生物技術有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養

Huh7細胞培養于含1%青霉素-鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM培養基中（以下簡稱“培養基”），置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。每隔2 d換液1次，當細胞生長融合度為80%～90%時進行細胞傳代。Huh7-G6PD細胞及其對照細胞Huh7-CT均培養于含2 μg/mL鹽酸嘌呤霉素的培養基中，其他條件與Huh7細胞相同。

2.2 索拉非尼耐藥肝癌細胞的構建

采用間歇梯度濃度法構建索拉非尼耐藥肝癌細胞Huh7-SR：將Huh7細胞按“2.1”項下方法培養，當細胞融合度為60%～70%時，加入含索拉非尼的培養基（索拉非尼濃度從2 μmol/L開始設置，后續每穩定1次則增加1 μmol/L），間隔12 h觀察1次，當細胞融合度為80%～95%時進行細胞傳代。不斷重復以上步驟直至細胞在含特定濃度的索拉非尼培養基中穩定生長。本研究構建的Huh7-SR細胞可在索拉非尼濃度為6 μmol/L的培養基中穩定生長，故后續用此濃度來維持Huh7-SR細胞的耐藥性。

2.3 實驗方法與技術

2.3.1 CCK-8法檢測細胞活力 將對數生長期細胞以5×103個/孔接種于96孔板中，培養24 h后，將細胞分為空白孔（含培養基，不含細胞、藥物）、對照孔（含培養基、細胞，不含藥物）及藥物干預孔（含培養基、細胞、藥物），平行設置3個復孔。各組細胞加或不加藥物干預后，棄培養基，每孔加入CCK-8試劑，孵育1 h后，采用酶標儀測定各孔光密度（optical density，OD）值，并計算細胞存活率或抑制率，其中細胞存活率＝[（藥物干預孔OD值－空白孔OD值）/（對照孔OD值－空白孔OD值）]×100%，藥物抑制率＝1－細胞存活率。

2.3.2 Western blot法檢測蛋白表達水平 將對數生長期細胞鋪于6 cm培養皿，待細胞生長至60%時，加或不加藥物干預后，以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞后保存于－80℃備用。冰上解凍細胞，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取總蛋白，并采用BCA法檢測總蛋白濃度。將總蛋白變性后，取30 μg總蛋白在10%分離膠中進行90 V恒壓電泳，隨后300 mA恒流轉膜 80 min；封閉液封閉10 min、TBST洗滌10 min，分別加入相應一抗，于4℃孵育過夜，TBST洗滌10 min×3次；加入二抗室溫孵育60 min，TBST洗滌10 min×3次；以ECL發光試劑顯色，并于化學發光成像系統中顯影，采用Image J軟件測定蛋白灰度值，以目的蛋白與磷酸化蛋白或內參蛋白的灰度值比值表示蛋白磷酸化水平或表達水平。

2.3.3 流式細胞術檢測細胞凋亡水平 將對數生長期細胞以2×105個/孔接種于6孔板中，加藥干預后，以胰酶消化細胞，離心，收集細胞；細胞以PBS洗滌3次后，重懸于100 μL的BD binding buffer中，轉移至流式管中，加入Annexin Ⅴ FITC和碘化吡啶（iodide pyridine，PI）各5 μL，避光孵育15 min。采用流式細胞儀檢測細胞的早期、晚期凋亡率，并計算總凋亡率（總凋亡率＝早期凋亡率+晚期凋亡率）。

2.4 Huh7-SR細胞對索拉非尼耐藥性的考察

2.4.1 索拉非尼對Huh7-SR細胞活力的影響 采用CCK-8法進行檢測。將Huh7細胞和Huh7-SR細胞按“2.3.1”項下方法分組與給藥，索拉非尼的給藥濃度為3、10、30 μmol/L，干預時間為24 h，然后檢測細胞存活率。上述實驗重復3次。

2.4.2 索拉非尼對Huh7-SR細胞凋亡水平的影響 采用流式細胞術進行檢測。將Huh7細胞和Huh7-SR細胞按“2.3.3”項下方法分組與給藥，索拉非尼的給藥濃度為6 μmol/L，干預時間為24 h，然后檢測細胞總凋亡率。上述實驗重復3次。

2.5 G6PD對Huh7-SR細胞索拉非尼敏感性的影響

2.5.1 G6PD在Huh7-SR細胞中的表達水平 采用Western blot法進行檢測。將Huh7細胞和Huh7-SR細胞按“2.3.2”項下方法培養，不用藥干預，直接檢測2種細胞中G6PD的表達水平（以G6PD蛋白與內參β-actin灰度值的比值表示G6PD的表達水平）。上述實驗重復3次。

2.5.2 G6PD抑制劑對Huh7-SR細胞活力的影響 采用CCK-8法進行檢測。將Huh7-SR細胞按“2.3.1”項下方法分組與給藥，6AN的給藥濃度為1、3、10、30、100、300、1 000 μmol/L（濃度根據預實驗結果設置），干預時間為24 h。上述實驗重復3次。采用在線計算工具（https：//www.aatbio.com/tools/ic50-calculator），計算半數抑制濃度（IC50）值。

2.5.3 G6PD抑制劑對Huh7-SR細胞的耐藥逆轉作用考察 采用CCK-8法進行檢測。將Huh7-SR細胞分為對照組（無藥物干預）、索拉非尼組（2 μmol/L）、索拉非尼+6AN組（索拉非尼2 μmol/L+6AN 20 μmol/L），各組給藥濃度根據“2.5.2”項下結果和預實驗結果設置，干預時間為48 h，然后按“2.3.1”項下方法培養后測定各組細胞存活率。上述實驗重復3次。

2.6 G6PD過表達對Huh7細胞索拉非尼敏感性的影響

2.6.1 G6PD過表達對Huh7細胞活力的影響 取G6PD穩定過表達的肝癌細胞Huh7-G6PD及其對照細胞Huh7-CT，按“2.3.1”項下方法分組與給藥，索拉非尼的干預濃度為3、10、30 μmol/L，干預時間為24 h，然后測定細胞存活率。上述實驗重復3次。

2.6.2 G6PD過表達對Huh7細胞凋亡水平的影響 采用流式細胞術進行檢測。取G6PD穩定過表達的肝癌細胞Huh7-G6PD及其對照細胞Huh7-CT，按“2.3.3”項下方法培養后測定細胞凋亡率，索拉非尼的干預濃度為6 μmol/L，干預時間為24 h。上述實驗重復6次。

2.7 G6PD調控肝癌細胞對索拉非尼耐藥的機制考察

2.7.1 Huh7-SR細胞中PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達的檢測 采用Western blot法進行檢測。將Huh7細胞與Huh7-SR細胞按“2.3.2”項下方法培養，然后檢測2種細胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表達，以p-PI3K與PI3K、p-Akt與Akt的灰度值比值分別表示PI3K、Akt蛋白的磷酸化水平。上述實驗重復3次。

2.7.2 G6PD抑制劑對Huh7-SR細胞中PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達的影響 采用Western blot法進行檢測。將Huh7-SR細胞分為對照組（無藥物干預）和6AN組（20 μmol/L），6AN的干預時間為48 h，然后按“2.7.1”項下方法檢測細胞中PI3K、Akt蛋白的磷酸化水平。上述實驗重復3次。

2.7.3 G6PD過表達對細胞中PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達的影響 采用Western blot法進行檢測。將Huh7-G6PD細胞和Huh7-CT細胞按“2.3.2”項下方法培養，然后按“2.7.1”項下方法檢測2種細胞中PI3K、Akt蛋白的磷酸化水平。上述實驗重復3次。

2.8 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0、SPSS 25.0對數據進行統計學分析，計數資料以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 Huh7-SR細胞對索拉非尼耐藥性的考察結果

在索拉非尼干預下，與Huh7細胞相比，Huh7-SR細胞存活率顯著升高（P＜0.05），細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），由此表明，相比于Huh7細胞，Huh7-SR細胞對索拉非尼的耐藥性增強。結果見圖1。

圖1 Huh7-SR細胞對索拉非尼耐藥性的考察結果

3.2 G6PD對Huh7-SR細胞索拉非尼敏感性的影響結果

如圖2A所示，與Huh7細胞比較，G6PD在Huh7-SR細胞中的表達水平顯著升高（P＜0.05）。CCK-8結果顯示，在Huh7-SR細胞中，單用索拉非尼干預后細胞存活率無明顯變化，表明該細胞對索拉非尼耐藥；而經G6PD抑制劑6AN（IC50為47.89 μmol/L）和索拉非尼聯合干預后，Huh7-SR細胞存活率顯著降低（P＜0.01），表明G6PD抑制劑可恢復Huh7-SR細胞對索拉非尼的敏感性，逆轉索拉非尼耐藥。結果見圖2B、圖2C。

圖2 G6PD對Huh7-SR細胞索拉非尼敏感性的影響結果

3.3 G6PD過表達對Huh7細胞索拉非尼敏感性的影響結果

在索拉非尼干預下，與Huh7-CT細胞比較，Huh7-G6PD細胞存活率顯著升高（P＜0.01），細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01），表明G6PD過表達降低了Huh7細胞對索拉非尼的敏感性。結果見圖3。

圖3 G6PD過表達對Huh7細胞索拉非尼敏感性的影響結果

3.4 G6PD調控肝癌細胞索拉非尼耐藥的機制考察結果

與Huh7細胞比較，Huh7-SR細胞中PI3K、Akt蛋白的磷酸化水平均顯著升高（P＜0.05），表明活化后的PI3K/Akt信號通路參與了Huh7-SR細胞對索拉非尼的耐藥。采用G6PD抑制劑6AN干預后，Huh7-SR細胞中PI3K、Akt蛋白的磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05），表明G6PD抑制劑能抑制PI3K/Akt信號通路的激活。此外，與Huh7-CT細胞比較，Huh7-G6PD細胞中PI3K、Akt蛋白的磷酸化水平和G6PD表達水平均顯著升高（P＜0.01），表明G6PD過表達能激活PI3K/Akt信號通路。由此可知，G6PD可通過激活PI3K/Akt信號通路誘導Huh7細胞索拉非尼耐藥。結果見圖4。

圖4 G6PD調控肝癌細胞索拉非尼耐藥的機制考察結果

4 討論

一直以來，耐藥是腫瘤治療的主要限制因素，腫瘤細胞表觀遺傳改變、自噬增加、缺氧及有氧糖酵解增加等均可使腫瘤細胞對索拉非尼產生抵抗，從而嚴重影響索拉非尼的治療效果[11]。PI3K/Akt信號通路是腫瘤發生、發展與耐藥的經典信號通路[12―13]。相關研究表明，PI3K/Akt可通過調控免疫逃逸[14]、轉運體[15]、有氧糖酵解[16]等，引起肝癌細胞對索拉非尼耐藥。G6PD作為磷酸戊糖代謝氧化還原階段的關鍵酶，除了參與氧化還原的調節，還可以通過促進磷酸戊糖代謝物的生成間接參與Akt的激活[17]。相關研究發現，在口腔鱗狀細胞癌和膀胱癌細胞中敲減G6PD基因可使Akt活性被抑制[18―19]，這表明G6PD可調控Akt的活性。然而，在肝癌細胞索拉非尼耐藥過程中G6PD是否可調控Akt尚不明確。

本研究首先在索拉非尼耐藥的Huh7-SR細胞中發現G6PD的表達顯著升高，但經G6PD抑制劑干預后，Huh7-SR細胞可恢復對索拉非尼的敏感性。與之相反，G6PD過表達可降低Huh7細胞對索拉非尼的敏感性。這提示G6PD高表達更容易導致索拉非尼耐藥的發生。此外，在耐藥細胞中抑制G6PD的表達可使PI3K/Akt信號通路活性被抑制，但在G6PD過表達的肝癌細胞（Huh7-G6PD細胞）中PI3K/Akt信號通路則被激活，這表明G6PD可通過激活PI3K/Akt信號通路誘導索拉非尼耐藥。另外，有研究者報道，在腫瘤細胞中，PI3K/Akt信號通路的上下游相關分子如血管內皮細胞生長因子受體[20]、絲裂原活化蛋白激酶[21]及糖原合成酶激酶[18]等均可被G6PD調控，后續也可基于這些相關分子探討G6PD激活PI3K/Akt信號通路的具體機制。

綜上所述，G6PD可通過激活PI3K/Akt信號通路誘導肝癌細胞索拉非尼耐藥。