蘇萸痛風方通過ROS/TXNIP/NLRP3信號通路抗痛風性關節炎的作用機制Δ

程媛，張禮，唐熠，譚億民，李涓，宋英，袁強華，譚曉語（.成都中醫藥大學附屬醫院藥理室，成都 6007；.成都市新都區中醫院呼吸內科，成都 60500；.成都中醫藥大學附屬醫院藥劑科，成都 6007；4.成都中醫藥大學附屬醫院檢驗科，成都 6007）

痛風是長期嘌呤代謝紊亂及（或）尿酸排泄減少引起的一種代謝疾病[1]。目前我國痛風的患病率為1%～3%，呈逐年上升趨勢，且發病年齡呈現出低齡化趨勢[2]。痛風的臨床表現為高尿酸血癥及反復發作的急性關節炎，常累及腎臟，引起慢性間質性腎炎、腎結石等[3]。痛風的臨床分期包括無癥狀期、急性關節炎期、間歇期和慢性關節炎期[4]。痛風急性關節炎期的治療藥物以非甾體抗炎藥、秋水仙堿、糖皮質激素為主[5]，間歇期的治療藥物主要有抑制尿酸生成的別嘌呤醇、非布司他和促進尿酸排泄的丙磺舒、苯溴馬隆等[6]。總體而言，抗痛風藥物無法同時達到急性關節炎期抗炎和間歇期降尿酸的效果，且停藥后患者易復發，不良反應較多[7]。蘇萸痛風方是基于《備急千金藥方》卷七引蘇長史方茱萸湯加薏苡仁化裁而成，具有降尿酸和抗炎鎮痛的作用[8]，成都中醫藥大學附屬醫院擬將其開發成抗痛風性關節炎藥物。

已有研究表明，炎性小體在痛風性關節炎發病機制中起核心作用，尿酸鹽結晶可通過上調活性氧（reactive oxygen species，ROS），誘導硫氧還蛋白互作蛋白（thiore‐doxin interacting protein，TXNIP）與NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermaoprotein domain related protein 3，NLRP3）結合，激活NLRP3炎性小體從而引起下游炎癥因子釋放[9]。由此可知，ROS/TXNIP/NLRP3信號通路對痛風性關節炎具有重要作用。本研究擬基于ROS/TXNIP/NLRP3信號通路，探討蘇萸痛風方抗痛風性關節炎的作用機制，以期為痛風治療藥物的開發及臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有PV-200型足趾容積測量儀（成都泰盟科技有限公司）、3-5M型臺式低速離心機（湖南恒諾儀器設備有限公司）、DZKW-4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）、SpectraMAX Plus384型酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]、UV752N型紫外-可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）、CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

蘇萸痛風方干粉由成都中醫藥大學附屬醫院藥劑科提供（批號20210617，其中吳茱萸堿含量為3.471 mg/g，吳茱萸次堿含量為2.298 mg/g）。秋水仙堿片（國藥準字H53021534，批號18LA，規格1 mg/片）購自昆藥集團股份有限公司；尿酸鈉（批號BCCB4889）購自美國Sigma公司；黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、ROS的測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所（批號分別為20210309、20210326、20210406、20210507）；白細胞介素 1β（inter‐leukin 1β，IL-1β）、IL-18、腫瘤壞死因子α（tumor necro‐sis factor α，TNF-α）的酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司（批號均為202103）；兔源TXNIP、NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis re‐lated spot like protein，ASC）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體均購自成都正能生物技術有限責任公司（批號分別為382206、381207、340097、380624）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批號511203）購自成都正能生物技術有限公司。其余試劑為實驗室常用規格，水為純凈水。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級雄性SD大鼠，體質量為180～220 g，由成都達碩生物科技有限公司提供，動物生產許可證號為SCXK（川）2020-030。大鼠飼養于成都中醫藥大學實驗動物中心，動物使用許可證號為SYXK（川）2019-049。飼養觀察室溫度為22～24℃，相對濕度為65%～75%。本實驗遵循3R原則，并經成都大學附屬醫院動物倫理委員會批準（批準號為2022DL-006）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

取雄性SD大鼠60只，按體質量隨機分為正常對照組、模型組、秋水仙堿片組（陽性對照藥，0.3 mg/kg，劑量根據臨床等效劑量換算而得）和蘇萸痛風方高、中、低劑量組（5、2.5、1.25 g/kg，劑量分別為臨床等效劑量的4、2、1倍），每組10只。給藥組大鼠以10 mL/kg每日灌胃相應藥物1次，連續給藥7 d。正常對照組和模型組大鼠同法灌胃等體積水。第6天給藥后1 h，除正常對照組外，其余各組大鼠均參照文獻[10―11]方法復制痛風性關節炎模型：采用1 mL注射器，于大鼠后肢右踝關節背側45°方向沿脛骨肌腱內側插入至關節腔，注入25 mg/mL尿酸鈉混懸液50 μL。正常對照組同法注射等體積0.9%氯化鈉溶液。第7天給藥后（即末次給藥后）1 h，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉大鼠，取血，取材進行后續檢測。

2.2 大鼠關節腫脹度的檢測

采用足趾容積測量儀檢測各組大鼠造模后2、6、24 h的關節腫脹度，各時間點重復測量2次后取平均值。關節腫脹度（mL）＝造模后各時間點足趾容積―造模前足趾容積。

2.3 大鼠關節炎癥指數評分的檢測

大鼠造模后2、6、24 h，各組大鼠參照文獻[10,12]進行關節炎癥指數分級評定：0分為正常；1分為關節皮膚輕度紅腫，骨性標志可見；2分為關節明顯紅腫，骨性標志消失，但局限于關節部位；3分為關節及以外肢體腫脹。

2.4 大鼠血清中氧化應激相關指標活性及炎癥因子水平的檢測

末次給藥1 h后，各組大鼠麻醉后腹主動脈取血，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，采用紫外-可見分光光度法測定血清中氧化應激指標SOD、XOD、MDA的活性，采用ELISA法測定血清中炎癥因子IL-1β、IL-18、TNF-α的水平。

2.5 大鼠踝關節組織中ROS水平的測定

取大鼠右后踝關節組織適量，剪碎，用預冷的生理鹽水沖洗后，加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。收集組織勻漿，以300目尼龍網過濾，濾液以800 r/min離心2 min，收集沉淀細胞；將沉淀細胞以磷酸鹽緩沖液重懸，取部分懸液進行蛋白定量分析后，再按試劑盒說明書相關方法檢測大鼠踝關節組織中ROS水平（以ROS熒光強度與蛋白含量的比值表示）。

2.6 大鼠踝關節組織的病理形態學觀察

取大鼠右后踝關節組織，以4%多聚甲醛溶液固定，經20%的乙二胺四乙酸溶液脫鈣后使用梯度乙醇進行脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，于倒置顯微鏡下觀察大鼠踝關節組織的病理形態學改變。

2.7 大鼠踝關節組織中TXNIP/NLRP3信號通路相關蛋白的表達水平檢測

取大鼠右后踝關節組織適量，加入預冷的裂解液于冰上進行勻漿，離心后取上清液，采用BCA法檢測蛋白濃度。蛋白經變性后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，室溫封閉，洗膜，加入TXNIP、NLRP3、ASC、β-actin一抗（稀釋度均為1∶500），4 ℃孵育過夜；洗膜，加入二抗（稀釋度為1∶1 000），室溫孵育2 h。采用ECL法顯色，經凝膠成像儀拍照后，采用Image J軟件分析目的蛋白灰度值，以目的蛋白條帶與內參蛋白（β-actin）條帶的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 大鼠關節腫脹度及炎癥指數評分檢測結果

關節腫脹度結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠造模2 h后，關節腫脹度顯著升高（P＜0.01），且在造模6 h后達到高峰并持續至24 h。與模型組比較，蘇萸痛風方各劑量組大鼠在造模2 h后，關節腫脹度均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），蘇萸痛風方中劑量組藥物作用時間持續至6 h，蘇萸痛風方高劑量組藥物作用時間持續至24 h，具有一定劑量依賴趨勢。炎癥指數評分結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠造模2、6、24 h后，炎癥指數評分均顯著升高（P＜0.01），關節紅腫明顯，骨性標志消失。與模型組比較，蘇萸痛風方高、中劑量組大鼠炎癥指數評分均顯著降低（蘇萸痛風方中劑量組造模24 h后除外，P＜0.01或P＜0.05），關節紅腫減輕；秋水仙堿片組大鼠各時間點的關節腫脹度和炎癥指數評分均顯著降低（P＜0.01）。結果見表1。

表1 各組大鼠造模后不同時間點的關節腫脹度和炎癥指數評分測定結果（±s，n＝10）

表1 各組大鼠造模后不同時間點的關節腫脹度和炎癥指數評分測定結果（±s，n＝10）

a：與正常對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05

組別正常對照組模型組秋水仙堿片組蘇萸痛風方高劑量組蘇萸痛風方中劑量組蘇萸痛風方低劑量組2h 6h 24h炎癥指數評分0.1±0.3 1.8±0.4a 0.5±0.5b 1.2±0.6b 1.4±0.5 1.7±0.5關節腫脹度/mL 0.094±0.032 0.486±0.089a 0.291±0.053b 0.343±0.089b 0.373±0.099c 0.397±0.094c炎癥指數評分0.3±0.5 1.7±0.5a 0.8±0.4b 1.1±0.3b 1.3±0.5c 1.4±0.5關節腫脹度/mL 0.114±0.053 0.541±0.102a 0.342±0.073b 0.418±0.092c 0.437±0.081c 0.454±0.082炎癥指數評分0.2±0.4 2.2±0.4a 0.9±0.6b 1.4±0.5c 1.6±0.5c 1.9±0.3關節腫脹度/mL 0.034±0.029 0.505±0.106a 0.272±0.058b 0.385±0.071b 0.403±0.097 0.441±0.076

3.2 大鼠踝關節組織的病理形態學觀察結果

與正常對照組比較，模型組大鼠滑膜組織增厚，炎癥細胞數量增加，提示炎癥和水腫形成。與模型組比較，秋水仙堿片組大鼠滑膜組織未明顯增厚及水腫，炎癥細胞數量明顯減少；蘇萸痛風方各劑量組大鼠滑膜組織厚度降低，炎癥細胞數量減少，說明蘇萸痛風方能減輕大鼠踝關節滑膜組織的炎癥。結果見圖1。

圖1 各組大鼠踝關節組織的病理形態學觀察結果（HE染色，×100）

3.3 大鼠血清中氧化應激相關指標活性及炎癥因子水平的檢測結果

與正常對照組比較，模型組大鼠血清中SOD活性顯著降低（P＜0.01），XOD、MDA活性以及IL-1β、IL-18、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，蘇萸痛風方高劑量組和秋水仙堿片組大鼠血清中上述指標活性/水平均顯著逆轉（P＜0.05或P＜0.01），蘇萸痛風方中、低劑量組大鼠血清中XOD活性以及IL-1β、IL-18水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組大鼠血清中氧化應激相關指標活性及炎癥因子水平的檢測結果（±s，n＝10）

表2 各組大鼠血清中氧化應激相關指標活性及炎癥因子水平的檢測結果（±s，n＝10）

a：與正常對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05

組別正常對照組模型組秋水仙堿片組蘇萸痛風方高劑量組蘇萸痛風方中劑量組蘇萸痛風方低劑量組SOD/（U/L）322.58±25.35 258.39±32.01a 294.87±28.08b 300.01±31.58c 281.76±40.37 276.71±36.43 XOD/（U/mL）37.60±6.22 48.88±5.99a 7.37±3.96b 38.14±8.79c 40.46±8.05c 40.53±5.86b MDA/（nmol/mL）8.44±1.95 12.10±2.72a 9.24±2.16b 8.92±2.53c 11.94±2.09 11.33±1.83 IL-1β/（pg/mL）52.35±11.75 156.30±18.72a 68.39±12.38b 112.86±20.08b 130.51±12.15b 134.94±20.19c IL-18/（pg/mL）139.84±14.63 226.37±26.07a 133.90±24.18b 178.48±18.64b 192.45±15.63c 203.96±19.18c TNF-α/（pg/mL）89.48±14.95 114.29±17.78a 87.74±14.28b 92.04±15.65c 94.89±18.23 106.69±13.40

3.4 大鼠踝關節組織中ROS水平的檢測結果

與正常對照組比較，模型組大鼠踝關節組織中ROS水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，秋水仙堿片組和蘇萸痛風方高、中劑量組大鼠踝關節組織中ROS水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表3。

表3 各組大鼠踝關節組織中ROS水平的檢測結果（±s，n＝10）

a：與正常對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05

ROS水平139.2±32.8b 194.6±43.0c 216.8±37.9組別正常對照組模型組秋水仙堿片組ROS水平52.7±18.0 236.7±36.3a 68.0±24.2b組別蘇萸痛風方高劑量組蘇萸痛風方中劑量組蘇萸痛風方低劑量組

3.5 大鼠踝關節組織中TXNIP/NLRP3信號通路相關蛋白表達水平的檢測結果

與正常對照組比較，模型組大鼠踝關節組織中TXNIP、NLRP3、ASC蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，秋水仙堿片組和蘇萸痛風方高、中劑量組大鼠踝關節組織中TXNIP、NLRP3、ASC蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖2、表4。

表4 各組大鼠踝關節組織中TXNIP/NLRP3信號通路相關蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝10）

a：與正常對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05

組別正常對照組模型組秋水仙堿片組蘇萸痛風方高劑量組蘇萸痛風方中劑量組蘇萸痛風方低劑量組TXNIP/β-actin 0.886±0.207 1.422±0.218a 0.349±0.113b 1.102±0.131b 1.234±0.175c 1.366±0.268 NLRP3/β-actin 0.774±0.192 1.301±0.231a 0.603±0.171c 0.857±0.217b 1.031±0.227c 1.210±0.201 ASC/β-actin 0.903±0.117 1.482±0.185a 0.841±0.153b 0.927±0.226b 1.215±0.201c 1.362±0.260

4 討論

痛風在中醫學中類似于“痹證”“歷節”“腳氣”“痛風”等病癥，病機主要為痰濕濁毒內阻血脈、四肢以致脈絡不通，不通則痛。蘇萸痛風方方中吳茱萸為溫降之品，既能理氣降逆，又可止痛除濕、逐風行痹；木瓜味酸、性溫，具有舒筋活絡、祛濕的功效；薏苡仁利水滲濕、除痹散結；諸藥合用，共奏祛濕降濁、舒筋通絡之功。本研究結果顯示，蘇萸痛風方能明顯減輕痛風性關節炎模型大鼠的關節腫脹度，降低關節炎癥指數評分和滑膜組織水腫，減少炎癥細胞浸潤。這表明蘇萸痛風方能有效降低關節炎癥反應，改善痛風性關節炎。

現代醫學認為，痛風性關節炎是由沉積在關節處的尿酸鹽結晶通過活化巨噬細胞等固有免疫細胞釋放多種促炎細胞因子和趨化因子（如IL-1β、TNF-α等），進而誘導大量中性粒細胞浸潤至關節腔的炎癥反應[13]。研究表明，NLRP3炎性小體活化在痛風性關節炎炎癥反應中處于中心位置[14]。尿酸鹽結晶被NARP3蛋白C端的亮氨酸重復序列識別后，使NLRP3發生結構上的變化，形成高度有序的NLRP3蛋白寡聚體，隨后通過募集ASC與Pro-caspase-1激活形成NLRP3炎性小體復合物，活化caspase-1，然后將無活性的pro-IL-1β、pro-IL-18剪切為成熟的IL-1β和IL-18，并分泌相應的活性成分至細胞外，引起炎癥反應[15]。另有研究表明，NLRP3炎性小體被尿酸鹽結晶激活可能有3種機制：（1）溶酶體破裂導致組織蛋白酶釋放[16]；（2）鉀離子外流[17]；（3）ROS的產生[18]。ROS的來源主要有NADPH氧化酶、線粒體呼吸鏈、XOD等[19―20]。XOD活力增強可引起氧自由基產生增多；SOD能夠分解有害的氧自由基，消除組織細胞脂質過氧化；MDA是氧自由基作用于脂質發生過氧化反應的終產物[21―22]。TXNIP是NLRP3 的配體，對ROS敏感，在正常生理條件下，硫氧還蛋白（thioredoxin，TRX）可與TXNIP結合形成復合物，從而抑制TXNIP的活性；當細胞內ROS濃度增加時，該復合物解離，TXNIP與NLRP3結合，進而激活NLRP3炎性小體[18]。由此說明，尿酸鹽結晶能上調ROS，經ROS/TXNIP/NLRP3信號通路誘導NLRP3炎性小體激活，從而釋放炎癥因子導致痛風[18]。本研究結果顯示，經蘇萸痛風方干預后，大鼠血清中SOD活性升高，XOD、MDA活性以及IL-1β、IL-18、TNF-α水平降低，踝關節組織中ROS水平和TXNIP、NLRP3、ASC蛋白表達水平也降低，這表明蘇萸痛風方可能是通過下調ROS、TXNIP、ASC水平干擾NLRP3炎性小體復合物的激活，從而抑制炎癥因子IL-1β、IL-18、TNF-α的分泌，進而發揮抗痛風性關節炎的作用。

綜上所述，蘇萸痛風方可通過ROS/TXNIP/NLRP3信號通路抑制NLRP3炎性小體激活，進而發揮抗痛風性關節炎的作用。