新疆鼠尾草酚酸類成分對HK-2細胞氧化損傷的保護作用及機制研究Δ

王曉梅，任春暉，王新玲，米仁沙·牙庫甫，胡君萍#（.新疆醫科大學藥學院，烏魯木齊 83007；.新疆伊犁州友誼醫院藥劑科，新疆伊寧 835099）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病所致的慢性腎臟病變，病變可累及全腎（包括腎小球、腎小管、腎間質等）。我國約有20%～40%的糖尿病患者合并DN，其已成為終末期腎病的主要原因[1]。有研究表明，持續高糖和高脂環境可以誘導腎小管損傷，而腎小管損傷在DN的發展過程中發揮重要的作用[2―3]。氧化應激被認為是DN發生發展中的關鍵因素，Kelch樣ECH 相關蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）/核轉錄因子 E2相關因子2（nuclear erythroid 2-related factor 2，Nrf2）信號通路是機體內調節氧化反應的重要通路，該通路激活后可以提高細胞抗氧化能力，減輕腎臟氧化應激損傷，從而發揮對腎臟的保護作用[4]。

新疆鼠尾草Salvia deserta Schang是唇形科鼠尾草屬植物，在新疆廣泛分布。本課題組前期研究顯示，新疆鼠尾草總酚酸提取物（總酚酸含量為40.97%）具有改善糖尿病模型大鼠腎臟損傷，減輕其腎臟氧化應激和炎癥反應的作用[5―6]。此外，本課題組前期還從新疆鼠尾草總酚酸提取物中分離得到了丹參素、原兒茶醛、咖啡酸及迷迭香酸等代表性酚酸類單體成分[7]。為進一步闡明新疆鼠尾草酚酸提取物及其化學成分改善DN的作用機制，本課題組擬制備酚酸類成分含量更高的新疆鼠尾草酚酸純化物，并以人腎小管上皮細胞HK-2為研究對象，建立高糖高脂損傷HK-2細胞模型，初步探討新疆鼠尾草酚酸純化物及上述4個代表性酚酸類單體成分對高糖高脂損傷模型細胞的存活率、氧化應激相關因子以及Keap1/Nrf2信號通路相關蛋白表達的影響，以期為新疆鼠尾草防治DN提供理論基礎和實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有AE240型分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、3-18KS型高速低溫離心機（美國Sigma公司）、Leitz Optilux型數碼顯微鏡（德國Leica公司）、FluorChem E型化學發光成像系統（美國Protein Simple公司）、Mini-PROTEAN Tetra Cell系統（美國Bio-Rad公司）、Epoch型酶標檢測儀（美國Bio-Tek公司）。

1.2 主要藥品與試劑

新疆鼠尾草藥材于2016年10月采于新疆烏魯木齊市水磨溝區，經新疆醫科大學藥學院王曉梅副教授鑒定為唇形科鼠尾草屬新疆鼠尾草S.deserta Schang的根及根莖?？ǜ窳袃羝ㄅ朒20170375，規格100 mg/片）購自西安楊森制藥有限公司；丹參素對照品（批號628B021，純度98%）、原兒茶醛對照品（批號1228A024，純度98%）、咖啡酸對照品（批號806D022，純度98%）、全蛋白提取試劑盒和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）凝膠制備試劑盒（批號分別為20200109、20201205）購自北京索萊寶科技有限公司；迷迭香酸對照品（批號Y06A9K67402，純度98%）購自上海源葉生物科技有限公司；MEM培養基購自美國Gibco公司；胰蛋白酶、雙抗購自以色列BI公司；超氧化物歧化酶（super‐oxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號分別為20200603、20200603、20200527）均購自南京建成生物工程研究所；FITC偶聯Annexin-Ⅴ凋亡檢測試劑盒（批號0027279）購自美國BD公司；兔抗Nrf2、Keap1、血紅素氧合酶 1（heme oxygenase-1，HO-1）、醌 NADH 脫氫酶 1（NADH：quinone acceptor oxidoreductase 1，NQO1）、β-肌動蛋白（β-actin）一抗購自美國Proteintech公司；辣根過氧化物酶標記的抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗購自美國CST公司；PVDF膜購自美國Milipore公司；其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為純化水。

1.3 細胞

本研究所用人腎小管上皮細胞HK-2購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 方法

2.1 新疆鼠尾草酚酸純化物的制備

根據文獻[8]方法制備新疆鼠尾草酚酸提取物，將提取物以上樣質量濃度為40 mg/mL、上樣體積為40 mL進行HPD-600大孔吸附樹脂吸附，吸附飽和后以3倍柱體積水洗脫（流速1 mL/min），然后以3倍柱體積的40%乙醇洗脫（流速0.67 mL/min），收集洗脫液后濃縮蒸干，即得新疆鼠尾草酚酸純化物（得率為67.6%）。經紫外分光光度法測定，純化物中總酚酸含量為60.80%；經高效液相色譜紫外檢測法測定，純化物中丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸4個酚酸類單體成分的含量分別為0.35%、0.17%、0.31%、5.36%[9]。

2.2 HK-2細胞的培養

將HK-2細胞復蘇后，培養于含10%胎牛血清、1%雙抗的MEM完全培養基中，并將細胞置于37℃、5%CO2及飽和濕度的細胞培養箱中貼壁培養。待到細胞長至80%～90%后，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，進行傳代培養。取對數生長期的HK-2細胞進行后續實驗。

2.3 新疆鼠尾草酚酸純化物及單體成分對正常細胞的毒性作用考察

采用CCK-8法進行測定。將處于對數生長期的HK-2細胞以8×104個/mL的密度接種于96孔板中，每孔100 μL。根據預實驗結果，將細胞分為對照組（培養基）、不同質量濃度（10、20、40、80、160、320 μg/mL）的新疆鼠尾草酚酸純化物組和不同濃度（25、50、100、200、400 μmol/L）的丹參素、原兒茶醛、咖啡酸和迷迭香酸組，每組設置3個復孔；并設置不加細胞的空白孔。加入培養基或藥物培養48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃放置2 h。采用酶標儀于450 nm波長處測定各孔的光密度（OD），并計算細胞存活率，以評價各藥物對正常細胞的毒性。細胞存活率（%）＝[（給藥孔OD－空白孔OD）/（對照孔OD－空白孔OD）]×100%。實驗重復3次。

2.4 新疆鼠尾草酚酸純化物對模型細胞存活率的影響

采用CCK-8法測定不同濃度新疆鼠尾草酚酸純化物對高糖高脂損傷細胞存活率的影響。將處于對數生長期的HK-2細胞以8×104個/mL的密度接種于96孔板中，每孔100 μL。根據預實驗結果，將細胞分為對照組、模型組、不同質量濃度（0.15、0.3、0.9、2.7、5.4、10.8、21.6 μg/mL）新疆鼠尾草酚酸純化物干預組，每組設置3個復孔；并設置不加細胞的空白孔。除對照組外，模型組和各給藥組均加入500 μmol/L棕櫚酸和30 mmol/L葡萄糖處理48 h（造模條件根據前期預實驗結果設置），復制高糖高脂損傷細胞模型。造模后，加入培養基或藥物培養48 h，再按“2.3”項下方法計算細胞存活率。

2.5 新疆鼠尾草酚酸純化物及單體成分對模型細胞凋亡的影響

采用AnnexinV-FITC/PI染色法進行測定。將對數生長期的HK-2細胞以1×105個/mL的密度接種于6孔板中，每孔2 mL。孵育24 h后，將細胞分為對照組、模型組、卡格列凈片組（陽性對照組，15 μmol/L）、新疆鼠尾草酚酸純化物組（10.8 μg/mL）、丹參素組（50 μmol/L）、原兒茶醛組（50 μmol/L）、咖啡酸組（50 μmol/L）及迷迭香酸組（50 μmol/L），每組設置3個復孔。新疆鼠尾草酚酸純化物濃度根據預實驗結果設置，各單體成分濃度依據“2.3”項下毒性作用考察結果設置。除對照組外，模型組和各給藥組均加入500 μmol/L棕櫚酸和30 mmol/L葡萄糖處理48 h（造模條件根據前期預實驗結果設置），復制高糖高脂損傷細胞模型。加入培養基或藥物培養48 h，然后用0.25%胰蛋白酶消化細胞，然后以1 500 r/min離心5 min（下同），棄去上清液；用2 mL PBS清洗細胞3遍，離心，棄去上清液。加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，每管加入5 μL Annnexin Ⅴ-FITC和5 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI），室溫避光孵育25 min，加入400 μL 1×Binding Buffer，在1 h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.6 新疆鼠尾草酚酸純化物及單體成分對模型細胞中氧化應激指標的影響

采用吸光光度法進行測定。細胞分組和處理同“2.5”項下。按照各指標試劑盒說明書方法操作，分別檢測各組細胞中MDA、GSH含量及SOD活性。

2.7 新疆鼠尾草酚酸純化物及單體成分對模型細胞中Keap1/Nrf2通路相關蛋白表達的影響

采用Western blot法進行檢測。將對數生長期的HK-2細胞以1×105個/mL的密度接種于6孔板中，每孔2 mL。常規孵育24 h后，將細胞分為對照組、模型組、卡格列凈片組（陽性對照組，15 μmol/L）、新疆鼠尾草酚酸純化物組（10.8 μg/mL）和迷迭香酸組（50 μmol/L，濃度依據“2.3”項下毒性作用考察結果設置），每組設置3個復孔。除對照組外，模型組和給藥組均加入500 μmol/L棕櫚酸和30 mmol/L葡萄糖處理48 h，復制高糖高脂損傷細胞模型。造模后，加入培養基或藥物培養48 h。采用RIPA裂解法抽提細胞中總蛋白，并采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定總蛋白濃度。將總蛋白高溫變性處理后，行SDS-PAGE電泳（分離膠電壓80 V、30 min，濃縮膠電壓120 V、60 min）分離，轉至PVDF膜（電流300 mA，轉膜時間50～55 min）；以TBST緩沖液清洗15 min×3次，加入Keap1（稀釋比例1∶5 000）、Nrf2（稀釋比例1∶1 000）、HO-1（稀釋比例1∶1 500）、NQO1（稀釋比例1∶1 000）、β-actin（稀釋比例1∶2 500）一抗，4 ℃孵育過夜；用1×TBST清洗15 min×3次，加入二抗（稀釋比例均為1∶2 000），室溫孵育1 h。以化學發光凝膠成像系統成像后，采用Image J 1.8.0軟件測定條帶灰度值，以目標蛋白與內參β-actin條帶灰度值的比值表示目標蛋白的表達水平。實驗重復3次。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 新疆鼠尾草酚酸純化物及單體成分對正常細胞毒性作用的考察結果

與對照組比較，10～160 μg/mL新疆鼠尾草酚酸純化物組的細胞存活率差異均無統計學意義（P＞0.05），而320 μg/mL新疆鼠尾草酚酸純化物組的細胞存活率顯著降低（P＜0.01），表明純化物在質量濃度≤160 μg/mL時對正常HK-2細胞的活力沒有抑制作用。25、50 μmol/L丹參素、原兒茶醛、咖啡酸和迷迭香酸組的細胞存活率與對照組相比差異均無統計學意義（P＞0.05），表明這4種化合物在質量濃度≤50 μmol/L時對正常HK-2細胞的活力沒有抑制作用；而400 μmol/L丹參素、原兒茶醛、咖啡酸組以及100、200、400 μmol/L迷迭香酸組細胞存活率均顯著降低（P＜0.01）。結果見表1。

表1 新疆鼠尾草酚酸純化物及4個單體成分對正常細胞存活率的影響（±s，n＝3，%%）

表1 新疆鼠尾草酚酸純化物及4個單體成分對正常細胞存活率的影響（±s，n＝3，%%）

a：與對照組比較，P＜0.01

組別對照組新疆鼠尾草酚酸純化物組濃度 細胞存活率/%100 96.58±2.55 98.11±7.43 96.63±1.72 106.32±12.5 97.85±9.3 4.32±0.51a 102.76±7.83 103.42±8.98 106.89±9.33 91.08±7.53 10.44±1.22a 95.92±10.87 98.46±8.30組別原兒茶醛組咖啡酸組丹參素組迷迭香酸組原兒茶醛組10μg/mL 20μg/mL 40μg/mL 80μg/mL 160μg/mL 320μg/mL 25μmol/L 50μmol/L 100μmol/L 200μmol/L 400μmol/L 25μmol/L 50μmol/L濃度100μmol/L 200μmol/L 400μmol/L 25μmol/L 50μmol/L 100μmol/L 200μmol/L 400μmol/L 25μmol/L 50μmol/L 100μmol/L 200μmol/L 400μmol/L細胞存活率/%105.39±6.15 106.22±11.90 67.30±3.87a 107.82±7.18 100.87±7.70 104.89±9.59 111.28±6.94 44.32±3.01a 103.35±3.26 95.33±4.38 76.56±5.61a 11.96±4.78a 11.41±2.55a

3.2 新疆鼠尾草酚酸純化物對模型細胞存活率的影響結果

與對照組比較，模型組細胞存活率顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，各濃度新疆鼠尾草酚酸純化物組細胞存活率均顯著升高（P＜0.01），其中以10.8 μg/mL組的作用較強。結果見圖1。

圖1 新疆鼠尾草酚酸純化物對模型細胞存活率的影響結果（±s，n＝3）

3.3 新疆鼠尾草酚酸純化物及單體成分對模型細胞凋亡的影響結果

與對照組比較，模型組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組細胞凋亡率均顯著降低（P＜0.01）。其中，新疆鼠尾草純化物抑制細胞凋亡的作用顯著強于各單體化合物（P＜0.01），各單體化合物抑制細胞凋亡的作用強度順序為丹參素＞迷迭香酸＞原兒茶醛＞咖啡酸。結果見圖2、表2。

表2 新疆鼠尾草酚酸純化物及單體成分對模型細胞凋亡率的影響（±s，n＝3，%%）

表2 新疆鼠尾草酚酸純化物及單體成分對模型細胞凋亡率的影響（±s，n＝3，%%）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與新疆鼠尾草酚酸純化物組比較，P＜0.01

細胞凋亡率/%25.65±2.33bc 27.95±1.34bc 34.60±0.85bc 26.05±1.48bc組別對照組模型組卡格列凈片組新疆鼠尾草酚酸純化物組濃度15μmol/L 10.8μg/mL細胞凋亡率/%10.65±2.33 40.15±2.62a 17.10±0.14b 19.35±0.92b組別丹參素組原兒茶醛組咖啡酸組迷迭香酸組濃度50μmol/L 50μmol/L 50μmol/L 50μmol/L

圖2 各組細胞凋亡率測定的流式細胞圖

3.4 新疆鼠尾草酚酸純化物及單體成分對模型細胞中氧化應激指標的影響結果

與對照組比較，模型組細胞中MDA含量顯著升高（P＜0.01），GSH含量及SOD活性顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組細胞中MDA含量均顯著降低（P＜0.01），GSH含量顯著升高（P＜0.01）；卡格列凈片組、新疆鼠尾草酚酸純化物組、原兒茶醛組、迷迭香酸組細胞中SOD活性均顯著升高（P＜0.01）。新疆鼠尾草酚酸純化物降低細胞中MDA含量以及升高GSH含量、SOD活性的作用均強于丹參素、原兒茶醛、咖啡酸（P＜0.01）。在4個單體化合物中，迷迭香酸降低細胞中MDA含量以及升高GSH含量、SOD活性的作用均顯著強于其余3個化合物（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表3。

表3 各組細胞中MDA、GSH含量及SOD活性測定結果（±s，n＝3）

表3 各組細胞中MDA、GSH含量及SOD活性測定結果（±s，n＝3）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與新疆鼠尾草酚酸純化物組比較，P＜0.01；d：與迷迭香酸組比較，P＜0.01；e：與迷迭香酸組比較，P＜0.05

SOD/（U/mgprot）98.09±2.97 60.92±1.88a 115.21±7.01b 98.35±4.93b 65.60±4.42cd 77.70±13.67bce 62.00±5.89cd 90.21±2.96b組別對照組模型組卡格列凈片組新疆鼠尾草酚酸純化物組丹參素組原兒茶醛組咖啡酸組迷迭香酸組MDA/（nmol/mgprot）0.65±0.09 1.46±0.09a 0.30±0.07b 0.43±0.11b 1.14±0.08bcd 0.99±0.20bcd 0.74±0.16bcd 0.44±0.12b GSH/（μmol/L）179.32±6.45 104.54±4.21a 313.40±12.62b 283.43±9.15b 145.79±5.03bcd 201.81±28.24bcd 196.33±7.21bcd 240.78±8.88bc

3.6 新疆鼠尾草酚酸純化物及單體成分對模型細胞中Keap1/Nrf2通路相關蛋白表達水平的影響結果

與對照組比較，模型組細胞中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），Keap1蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，卡格列凈片組、新疆鼠尾草酚酸純化物組細胞中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），Keap1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）；迷迭香酸組細胞中Nrf2蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），Keap1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）。新疆鼠尾草純化物對Keap1、NQO1及HO-1蛋白表達水平的影響明顯強于迷迭香酸（P＜0.05或P＜0.01），提示純化物中各酚酸類成分協同發揮藥效。結果見圖3、表4。

圖3 各組細胞中Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1蛋白表達測定的電泳圖

表4 各組細胞中Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1蛋白表達水平測定結果（±s，n＝3）

表4 各組細胞中Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1蛋白表達水平測定結果（±s，n＝3）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05；d：與新疆鼠尾草酚酸純化物組比較，P＜0.01；e：與新疆鼠尾草酚酸純化物組比較，P＜0.05

NQO1/β-actin 1.43±0.18 0.58±0.03a 1.44±0.22b 1.34±0.20b 0.72±0.17d組別對照組模型組卡格列凈片組新疆鼠尾草酚酸純化物組迷迭香酸組Nrf2/β-actin 2.26±0.23 0.88±0.30a 2.05±0.24b 1.79±0.20b 1.74±0.32b Keap1/β-actin 1.05±0.03 1.42±0.13a 0.97±0.10b 1.20±0.03b 0.99±0.08bd HO-1/β-actin 1.53±0.11 0.91±0.13a 1.42±0.12b 1.34±0.15b 1.04±0.18e

4 討論

卡格列凈片在臨床上可以有效緩解DN患者的臨床癥狀，控制患者血糖水平，改善患者炎癥指標與尿蛋白指標，同時其還可改善患者的腎功能，提高治療的有效率[10―11]。為此，本研究以卡格列凈片作為陽性對照藥物進行研究。

高血糖以及由此誘發的氧化應激被認為是DN發生發展的關鍵因素[12]。同時，在DN病變的高血糖、炎癥和氧化背景下，脂質代謝出現異常，過多的脂質在腎臟中積累也會損害腎臟功能[4]。棕櫚酸是血液中含量最高的游離脂肪酸，棕櫚酸含量的升高可能通過骨骼肌的胰島素抵抗機制，影響2型糖尿病的發生和發展，并且能夠導致細胞脂質沉積、炎癥反應、氧化應激損傷及細胞凋亡，從而導致細胞損傷[13―14]。因此，本研究采用葡萄糖聯合棕櫚酸建立高糖高脂誘導的HK-2細胞損傷模型。在該模型條件下，HK-2細胞活力顯著降低，細胞中MDA含量明顯增多，GSH含量和SOD活性顯著下降，使HK-2細胞發生氧化應激損傷，最終導致細胞凋亡。而給予新疆鼠尾草酚酸純化物及丹參素、原兒茶醛、咖啡酸和迷迭香酸4個單體成分干預后，均可以抑制高糖高脂誘導損傷細胞的凋亡，降低損傷細胞中MDA含量，升高損傷細胞中GSH含量和SOD活性，改善細胞的氧化應激損傷。結合文獻報道的丹參素、原兒茶醛、咖啡酸和迷迭香酸均對腎臟具有保護作用[15―18]，說明上述酚酸類成分可能是新疆鼠尾草防治DN潛在的活性物質。

Keap1/Nrf2通路為機體內源性抗氧化應激的主要通路，該通路激活后可使機體內Nrf2表達增強，同時可通過抗氧化反應元件序列啟動Ⅱ相解毒酶和下游多種保護性因子（如HO-1、NQO1等）的表達[19]，對DN等多種以氧化應激為主要發病機制的疾病都具有保護作用。因此，為進一步探索新疆鼠尾草的抗氧化作用機制，本研究選擇新疆鼠尾草酚酸純化物以及4個單體化合物中抗氧化活性最強的迷迭香酸進行了Keap1/Nrf2通路相關蛋白表達的檢測。結果顯示，新疆鼠尾草酚酸純化物和迷迭香酸均可不同程度上調高糖高脂損傷細胞中Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達，下調細胞中Keap1蛋白表達。雖然迷迭香酸在4個單體成分中抗氧化能力最強，但仍不及酚酸純化物，說明酚酸純化物是通過多種酚酸成分協同作用從而改善HK-2細胞氧化應激損傷的。

綜上所述，新疆鼠尾草酚酸類成分能夠減輕高糖高脂所致腎小管上皮細胞的氧化應激損傷，具有延緩DN發展的潛力；其作用可能與激活Keap1/Nrf2通路、抑制氧化應激反應有關。但是，DN的發病機制復雜，新疆鼠尾草酚酸類成分對DN的防治作用及機制有待進一步探討。