龍膽環烯醚萜類成分對NAFLD細胞模型脂質積累及炎癥的改善作用及機制Δ

王麗娟，翁麗麗，肖春萍，于 前，寇柏鑫（長春中醫藥大學藥學院，長春 130117）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種臨床病理綜合征。隨著人們生活水平的提高，NAFLD的發病率也大幅增加，據2019年流行病學數據統計，NAFLD的全球患病率高達25%[1]。脂質積累作為NAFLD的主要特征，通常出現在疾病發展的早期，其引起的炎癥反應也是NAFLD的另一個主要特征[2―3]。脂肪在肝臟的過度累積可活化核因子κB抑制蛋白α（nuclear factor-κB inhibitory protein α，IκBα），激活NF-κB信號通路，促進腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6等炎癥因子的釋放，從而產生炎癥[4]。脂質積累及其引起的炎癥反應若在疾病早期及時干預是可以逆轉的，但如果不進行干預，后期可能發展為肝硬化或肝癌，嚴重危及患者生命健康[5]。目前治療NAFLD主要依靠藥物或者機體的自身調節作用，但藥物副作用較大且患者依從性較差[6]。因此，有必要尋找新的治療NAFLD的藥物。

龍膽為龍膽科植物條葉龍膽Gentiana manshuricaKitag.、龍膽G.scabraBge.、三花龍膽G.trifloraPall.或堅龍膽G.rigescensFranch.的干燥根及根莖，具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效，臨床上含有龍膽的方劑主要用于保肝，且療效較好[7―8]。環烯醚萜苷類化合物為龍膽的主要成分，具有多種藥理活性，如保肝、降脂、抗炎和利膽作用[9―10]。但是，龍膽環烯醚萜類成分（gentian iridoids，GI）是否可改善NAFLD尚不明確。基于此，本研究首先以D101大孔樹脂柱分離GI，然后以游離脂肪酸誘導的人肝癌HepG2細胞為NAFLD細胞模型[11]，初步探討GI對NAFLD的改善作用及機制，以期為NAFLD治療藥物的開發提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有TM3型二氧化碳細胞培養箱、Multiscan MK3型酶標儀、QuantStudioTM5型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀、IBright FL1000型智能凝膠成像系統（美國Thermo Fisher Scientific公司），810R型離心機（德國Eppendrof公司），Discovery V20型倒置熒光顯微鏡（德國Zeiss公司），Mini Protean型蛋白電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

龍膽藥材購自吉林省北藥藥材加工有限公司（批號ldzc3-20171017-2），經長春中醫藥大學藥學院翁麗麗教授鑒定為龍膽G.scabraBge.的干燥根及根莖。其他藥品與試劑有胎牛血清（以色列BI公司，批號2120140），DMEM培養基（美國Gibco公司，批號8121342），胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗（美國HyClone公司，批號分別為J210033、J200012），油紅O試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號20210426），三酰甘油（triglyceride，TG）試劑盒（南京建成科技有限公司，批號20210612），丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒、小鼠IL-1β試劑盒、小鼠IL-6試劑盒、小鼠TNF-α試劑盒（江蘇酶免實業有限公司，批號分別為MM-44625M1、MM-44115M1、 MM-0039M1、 MM-0163M1、 MM-0132M1），棕櫚酸、油酸（美國Sigma公司，批號分別為101298301、1011202365），RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、cDNA擴增試劑盒（日本TaKaRa公司，批號分別為AL40413A、AL50948A、AL61810A），兔源IκBα多克隆抗體、兔源NF-κB多克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（武漢三鷹生物技術有限公司，批號分別為00095768、00086772、20000311），兔源磷酸化NF-κB（p-NF-κB）多克隆抗體（美國Cell Signaling公司，批號17）。β-肌動蛋白（βactin）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）、固醇調節元件結合蛋白1c（sterol regulatory element binding protein 1c，SREBP-1c）的PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列與擴增產物長度見表1。

表1 PCR引物序列及擴增產物長度

1.3 細胞

人肝癌HepG2細胞購自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所。

2 方法

2.1 GI的提取

稱取龍膽藥材3.0 kg，加水煎煮2次（2次水和藥材的質量比分別為10∶1、8∶1），每次1.5 h。合并2次濾液，濃縮成質量濃度為1.2 g/mL的溶液（以生藥量計）。將上述濃縮液加水稀釋成質量濃度為0.1 g/mL的樣品溶液，加入D101大孔樹脂柱中，以30%乙醇進行洗脫純化，收集洗脫液；將洗脫液于60℃下減壓蒸餾濃縮，蒸干，即得GI（得率為7%，其中龍膽苦苷的含量為54.6 mg/g）。

2.2 細胞培養

將HepG2細胞接種于含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養基（以下簡稱“培養基”）中，于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養。當細胞融合度達80%時，用0.25%胰蛋白酶消化，再進行傳代培養和后續實驗。

2.3 HepG2細胞活力的檢測

采用CCK-8法進行檢測。取對數生長期HepG2細胞，以1×104個/孔接種于96孔板中，然后分為對照組、模型組和GI不同濃度組（0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/mL，濃度根據預實驗結果設置），每組設3個復孔。參考文獻[12]方法，對照組加入含1%牛血清蛋白的培養基，模型組加入含0.5 mmol/L游離脂肪酸（由油酸和棕櫚酸按2∶1比例配制而成，以復制NAFLD細胞模型，下同）的培養基，給藥組加入含相應濃度藥物和0.5 mmol/L游離脂肪酸的培養基。培養24 h后，采用酶標儀測定各孔吸光度值，吸光度值越大，細胞活力越強。

2.4 HepG2細胞脂滴形成情況觀察

采用油紅O染色法進行觀察。取對數生長期HepG2細胞，以2×105個/孔接種于6孔板中，然后分為對照組、模型組和GI低、中、高濃度組（0.25、0.5、1 mg/mL，濃度根據“2.3”項下結果設置），每組設3個復孔。對照組加入含有1%牛血清蛋白的完全培養基，模型組加入含有0.5 mmol/L游離脂肪酸的培養基，GI低、中、高濃度組加入含相應藥物和0.5 mmol/L游離脂肪酸的培養基。培養24 h后，各組細胞按油紅O染色試劑盒說明書方法操作，然后采用倒置顯微鏡觀察并拍照。

2.5 HepG2細胞內TG含量的檢測

取對數生長期HepG2細胞，按“2.4”項下方法接種、分組、造模與給藥，每組設3個復孔。培養24 h后收集細胞，采用超聲破碎儀進行超聲裂解，然后按照TG試劑盒說明書方法操作，檢測HepG2細胞內TG含量。

2.6 HepG2細胞上清液中肝功能指標和炎癥指標檢測

取對數生長期HepG2細胞，按“2.4”項下方法接種、分組、造模與給藥，每組設3個復孔。培養24 h后收集培養基，以3 000 r/min離心15 min，取上清液，按試劑盒說明書相關方法操作后，檢測AST、ALT、IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

2.7 HepG2細胞中SREBP-1c、FAS mRNA的表達水平檢測

采用實時熒光定量PCR法進行檢測。取對數生長期HepG2細胞，按2×105個/孔接種于6孔板中，按“2.4”項下方法分組、造模與給藥，每組設3個復孔。細胞培養24 h后，提取總RNA，然后根據逆轉錄試劑盒說明書方法，逆轉錄為cDNA，再進行PCR擴增。PCR反應條件為95℃預變性30 s；95℃變性3 s，60℃退火30 s，共40個循環。以β-actin作為內參，采用2－ΔΔCt法計算目的基因的表達水平。

2.8 HepG2細胞中IκBα、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達檢測

采用Western blot法進行檢測。取對數生長期細胞，按2×105個/孔接種于6孔板中，按“2.4”項下方法分組、造模與給藥，每組設3個復孔。細胞培養24 h后，加入適量RIPA裂解液提取總蛋白，并置于冰上充分裂解30 min，于4℃條件下以12 000 r/min離心15 min，取上清液采用BCA法測定蛋白濃度。蛋白經煮沸變性后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜；以5%脫脂奶粉封閉1.5 h，加入IκBα、NF-κB、p-NF-κB、β-actin一抗（稀釋度均為1∶1 000），室溫孵育2.5 h；以TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗（稀釋度為1∶6 000），室溫孵育1 h；以TBST洗膜3次，每次10 min，加入ECL化學發光試劑，采用全自動化學發光成像分析儀成像。采用Image J 6.0軟件進行分析，以IκBα蛋白與內參β-actin的灰度值比值表示IκBα蛋白的表達水平，以p-NF-κB蛋白與NF-κB蛋白的灰度值比值表示NF-κB蛋白的磷酸化水平。

2.9 統計學方法

3 結果

3.1 GI對HepG2細胞活力的影響

與對照組比較，模型組HepG2細胞活力顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，GI不同濃度組HepG2細胞活力均顯著升高（P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組HepG2細胞活力的測定結果（±s，n＝3）

表2 各組HepG2細胞活力的測定結果（±s，n＝3）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01

組別對照組模型組GI0.25mg/mL組GI0.50mg/mL組吸光度1.01±0.02 0.43±0.05a 0.57±0.05b 0.86±0.06b組別GI1mg/mL組GI2mg/mL組GI4mg/mL組吸光度0.90±0.02b 0.88±0.07b 0.89±0.15b

3.2 GI對HepG2細胞脂滴形成的影響

對照組HepG2細胞邊緣清晰，細胞質豐富，細胞內未見紅色脂滴。模型組HepG2細胞內可見大量紅色脂滴，細胞核明顯萎縮、體積變小。GI各濃度組HepG2細胞內紅色脂滴均明顯減少，細胞核萎縮不明顯、體積大小正常。結果見圖1。

圖1 GI對HepG2細胞脂滴形成的影響結果（油紅O染色）

3.3 GI對HepG2細胞內TG含量的影響

與對照組比較，模型組HepG2細胞內TG含量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，GI中、高濃度組HepG2細胞內TG含量均顯著降低（P＜0.01）。結果見表3。

表3 各組HepG2細胞（上清液）中TG含量、肝功能指標和炎癥指標水平的測定結果（±s，n＝3）

表3 各組HepG2細胞（上清液）中TG含量、肝功能指標和炎癥指標水平的測定結果（±s，n＝3）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01

TNF-α/（pg/mL）201.23±9.78 368.62±6.72a 295.43±18.78b 246.16±3.69c 211.38±5.42c組別對照組模型組GI低濃度組GI中濃度組GI高濃度組TG/（mmol/L）1.54±0.35 2.55±0.30a 2.23±0.43 1.82±0.44c 1.64±0.22c AST/（mg/mL）123.34±7.12 159.75±2.30a 136.10±4.60b 129.23±5.89c 126.31±3.35c ALT/（mg/mL）84.00±4.84 135.40±0.01a 121.02±3.58b 93.82±3.71c 90.84±3.87c IL-1β/（ng/L）21.12±0.64 46.82±3.33a 36.23±2.16c 34.75±2.64c 27.71±0.65c IL-6/（mg/L）123.35±1.55 162.04±6.06a 155.52±11.39 133.06±4.21c 130.74±6.31c

3.4 GI對HepG2細胞上清液中肝功能指標和炎癥指標水平的影響

與對照組比較，模型組HepG2細胞上清液中AST、ALT、IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，GI各濃度組HepG2細胞上清液中上述指標水平（低劑量組IL-6除外）均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

3.5 GI對HepG2細胞中SREBP-1c、FAS mRNA表達水平的影響

與對照組比較，模型組HepG2細胞中SREBP-1c、FAS mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，GI各濃度組HepG2細胞中SREBP-1c、FAS mRNA表達水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表4。

表4 各組HepG2細胞中SREBP-1c、FAS mRNA表達水平的檢測結果（±s，n＝3）

表4 各組HepG2細胞中SREBP-1c、FAS mRNA表達水平的檢測結果（±s，n＝3）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01

FASmRNA 0.89±0.20 3.74±0.10a 1.76±0.21c 1.39±0.09c 1.35±0.10c組別對照組模型組GI低濃度組GI中濃度組GI高濃度組SREBP-1cmRNA 1.28±0.25 6.15±0.75a 4.41±0.14b 3.25±0.10c 1.64±0.47c

3.6 GI對HepG2細胞中IκBα、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組HepG2細胞中IκBα蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），NF-κB蛋白磷酸化水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，GI各濃度組HepG2細胞中上述蛋白的表達水平或磷酸化水平均顯著逆轉（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖2、表5。

圖2 各組HepG2細胞中IκBα、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達的電泳圖

表5 各組HepG2細胞中IκBα和NF-κB蛋白表達（磷酸化）水平的檢測結果（±s，n＝3）

表5 各組HepG2細胞中IκBα和NF-κB蛋白表達（磷酸化）水平的檢測結果（±s，n＝3）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01

p-NF-κB/NF-κB 0.94±0.03 1.07±0.02a 0.83±0.02c 0.77±0.04c 0.81±0.04c組別對照組模型組GI低濃度組GI中濃度組GI高濃度組IκBα/β-actin 1.07±0.08 0.83±0.02a 1.09±0.06b 1.15±0.05c 1.18±0.02c

4 討論

環烯醚萜類化合物廣泛存在于植物界，其在龍膽科、玄參科和茜草科等雙子葉植物中均有分布。相關研究發現，龍膽環烯醚萜類成分具有較好的保肝活性[13]，但其是否可以治療NAFLD尚不明確。基于此，筆者以游離脂肪酸誘導的HepG2細胞為NAFLD細胞模型，探討GI對NAFLD的改善作用及機制。本研究結果顯示，GI可顯著升高HepG2細胞的活力，減少脂滴的形成，并降低TG含量及AST、ALT水平，表明GI可減少HepG2細胞中的脂質積累，且該結果與龍膽可減少肝內脂質積累的作用相一致[14]。

NAFLD的過量脂質積累可導致氧化應激和線粒體功能障礙，從而誘導炎癥反應。IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎癥因子在NAFLD進展中具有重要作用，且其受NF-κB信號通路調節[15]。NF-κB信號通路的關鍵環節是IκB激酶（IκB kinase，IKK）的激活，活化后的 IKK 可磷酸化IκBα并介導IκBα的泛素化降解，從而釋放NF-κB進入細胞核，導致上述促炎癥因子水平升高[16]。本研究結果發現，GI可降低HepG2細胞上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，升高細胞中IκBα蛋白表達水平，降低NF-κB蛋白磷酸化水平，這表明GI可能是通過抑制NF-κB信號通路來降低HepG2細胞的炎癥反應。

SREBP-1c是一種轉錄因子，其表達升高可導致TG的過度積累，從而促進NAFLD的發生、發展[17]。FAS是SREBP-1c的下游因子，SREBP-1c激活后可促進FAS基因的轉錄表達，進而促進TG的合成及脂質的積累[18―19]。本研究結果發現，GI可下調SREBP-1c、FAS mRNA的表達，這提示GI可通過下調SREBP-1c/FAS信號通路來減少HepG2細胞的脂質積累。

綜上所述，GI可減少游離脂肪酸誘導的NAFLD細胞模型的脂質積累，減輕炎癥反應，其作用機制可能與抑制SREBP-1c/FAS及NF-κB信號通路有關。