火絨草黃芪混煎液對系膜增生性腎小球腎炎模型大鼠的改善作用及機制Δ

侯俠，趙玥，張穎，賈冬，仲坤，房小楠，董笑博，齊越（1.江蘇省徐州醫藥高等職業學校藥學技術系，江蘇徐州 1116；.遼寧中醫藥大學附屬第二醫院藥理室，沈陽 11004；.遼寧中醫藥大學中醫研究生學院，沈陽 110847）

系膜增生性腎小球腎炎（mesangial proliferative glo‐merulonephritis，MsPGN）是以腎小球系膜細胞增殖和細胞外基質沉積為特征的腎小球疾病[1]。盡管MsPGN是終末期腎病的主要原因，但其機制尚未完全闡明[2]。相關研究發現，免疫復合物清除障礙、免疫調節功能障礙和細胞凋亡均可導致MsPGN[3]。目前，臨床上常聯合糖皮質激素、免疫抑制劑、抗血小板藥物和抗血脂藥物等來治療MsPGN，但療效較差[4]。因此，開發新的治療MsPGN的藥物具有重要意義。

火絨草為菊科火絨草屬植物火絨草Leontopodium leontopodioides（Willd.）Beauv.的全草，具有清熱涼血、益腎利水、消炎利尿的功效[5]，常用于抑制炎癥及消除水腫[6]。黃芪為膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，具有益氣固表、健脾溫中、利水消腫的功效，臨床上常用于腎炎的治療[7]。研究發現，尿蛋白是反映腎臟病變嚴重程度的重要標志，尿蛋白的增加可加速MsPGN疾病的進程[8]。本課題組前期研究發現，火絨草黃芪混煎液（HRCHQ）可降低MsPGN模型大鼠尿蛋白含量，改善腎組織的病理學變化[9]。相關研究發現，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/糖原合酶激酶3β（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B/glycogen synthase kinase 3β，PI3K/Akt/GSK3β）信 號 通 路 在MsPGN的病理過程中具有重要作用，激活該信號通路可促進系膜細胞增殖及細胞外基質增生[10]。另外，抑制腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、轉移生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）、補體C3、纖連蛋白（fibronectin，FN）的表達，對改善腎功能具有重要作用[11]?；诖?，筆者建立MsPGN大鼠模型，探討HRCHQ對該模型大鼠TNF-α、TGF-β1、補體C3、FN表達的影響及其對PI3K/Akt/GSK3β信號通路的調控作用，以期為HRCHQ治療MsPGN提供實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有BX-53型顯微鏡（日本Olympus公司）、Neofuge 13R型酶標儀（美國Bio Rad公司）、Tanon 5200型全自動化學分光圖像分析系統（上海天能科技有限公司）、Revolve型熒光顯微鏡（美國Echo公司）。

1.2 主要藥品與試劑

火絨草和黃芪均購自遼寧中醫藥大學附屬第二醫院藥劑科，經遼寧中醫藥大學第二臨床學院藥物分析室尤獻民教授鑒定為火絨草L.leontopodioides（Willd.）Beauv.和膜莢黃芪A.membranaceus（Fisch.）Bge.。鹽酸貝那普利片（陽性對照藥，批號X2657，規格10 mg）購自北京諾華制藥有限公司；牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑（批號分別為WXBC7359V、SLBV6895、SLBT5128）均 購 自 美 國Sigma公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（批號1116L031）購自北京索萊寶科技有限公司；尿素氮試劑盒（批號20180920）和白蛋白試劑盒（批號20180820）購自南京建成生物工程研究所；兔抗補體C3、β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體（批號分別為AH10106155、bs-10966R）購自北京博奧森生物技術有限公司；FITC標記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號BST13H30C 05）購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗TNF-α、TGF-β1、PI3K、Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、磷酸化 PI3K（p-PI3K）、FN多克隆抗體（批號分別為EPR21753-109、EPR21143、EPR18702、EPR16798、EPR18853、EPR-18702、EPR2311025）均購自美國 Abcam 公司；兔抗GSK3β、磷酸化GSK3β（p-GSK3β）多克隆抗體（批號分別為12456T、9323T）均購自美國Cell Signaling Technol‐ogy公司；其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級健康SD大鼠，雄性，共70只，體質量180～220 g，購自遼寧長生生物技術有限公司，動物生產許可證號為SCXY（遼）2018-0001。所有受試動物于遼寧中醫藥大學實驗動物中心飼養。飼養室溫度為20～23℃，濕度為50%～60%。

2 方法

2.1 HRCHQ的制備

取火絨草150 g、黃芪300 g，加4 500 mL水，浸泡30 min后，煎煮2 h，濾過，收集濾液；殘渣加3 000 mL水，煎煮1 h，濾過，收集濾液；殘渣再次加1 500 mL水，煎煮0.5 h，濾過，收集濾液。合并3次濾液，濃縮成質量濃度為0.27 g/mL的HRCHQ（以生藥量計），置于4℃下保存，待用。

2.2 分組、造模與給藥

將70只大鼠按體質量分為假手術組（n＝10）和造模組（n＝60）。造模組大鼠參考文獻[12―13]的免疫學方法復制MsPGN模型，具體如下：大鼠經戊巴比妥鈉腹腔注射（50 mg/kg）麻醉后，剃毛，切除大鼠左側腎臟；腎臟切除術后第2周末，大鼠皮下注射0.1 mLA液（即弗氏完全佐劑0.1 mL+3.0 mg BSA）；第3周末和第4周末大鼠皮下注射0.1 mL B液（即弗氏不完全佐劑0.1 mL+3.0 mg BSA）；第5周起大鼠腹腔注射BSA0.5 mg，每天增加0.5 mg直至10.0 mg；第6周末大鼠尾靜脈注射LPS 100 μg。假手術組大鼠麻醉后僅暴露左側腎臟，不做切除，其余步驟同造模組，皮下、腹腔均注射生理鹽水。造模結束后，檢測大鼠末次注射后24 h的尿蛋白，當造模大鼠的尿蛋白水平為假手術組大鼠的3倍時，表明造模成功[14]。本研究造模成功的大鼠共50只。

將造模成功的50只大鼠按體質量分為模型組和HRCHQ 高、中、低劑量組（4.05、2.03、1.02 g/kg）以及鹽酸貝那普利片組（陽性對照組，20 mg/kg），每組各10只。各給藥組劑量參考文獻[9]設置。假手術組、模型組大鼠灌胃蒸餾水，其余各組大鼠灌胃相應藥液，灌胃體積均為15 mL/kg，每天1次，連續5周。

2.3 大鼠血清中總蛋白、白蛋白、尿素氮含量的測定

各組大鼠于末次給藥后1 h麻醉，暴露腹主動脈后采血，靜置15 min后，以2 500 r/min離心15 min，取上清液，按試劑盒說明書相關方法檢測大鼠血清中總蛋白、白蛋白、尿素氮含量。

2.4 大鼠腎臟組織中TGF-β1、TNF-α蛋白表達水平的檢測

采用免疫組織化學染色法進行檢測。各組大鼠腹主動脈采血后，摘取右側腎臟，將腎臟的一半置于－80℃下冷凍保存，另一半固定于4%多聚甲醛中。取固定于4%多聚甲醛中的腎臟（每組取6只），常規制備厚度為5μm的石蠟切片，經脫蠟、脫水后，以3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶10 min；將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽溶液（pH 6.0）中加熱至沸騰，冷卻至室溫后，以5%BSA封閉25 min；加入TGF-β1、TNF-α一抗（稀釋度均為1∶100），4℃孵育過夜；滴加二抗（稀釋度為1∶2 000），37℃孵育35 min；經二氨基聯苯胺顯色后，以蘇木素復染，再脫水、透明、封片。每組大鼠各取10張連續切片，每張切片隨機選取5個不同的視野，于光學顯微鏡下觀察TGF-β1、TNF-α蛋白的表達情況。以細胞內表達棕黃色顆粒為陽性染色。采用JEOA 801D形態學圖像分析系統計算陽性染色的光密度值，用來表示蛋白的表達水平。

2.5 大鼠腎臟組織中補體C3的表達水平檢測

采用免疫熒光法進行檢測。取“2.4”項下經0.01 mol/L枸櫞酸鹽溶液（pH 6.0）煮沸并冷卻至室溫的切片，以5%BSA封閉30 min，加入補體C3一抗（稀釋度為1∶500），4 ℃孵育過夜；滴加二抗（稀釋度為1∶1 000），37℃避光孵育30 min；棄去抗體，避光，于顯微鏡下觀察，拍照，并用Image J軟件檢測熒光強度，用來表示蛋白表達水平。

2.6 大鼠腎臟組織中PI3K/Akt/GSK3β信號通路相關蛋白磷酸化水平和FN表達水平的檢測

采用Western blot法進行檢測。每組選取“2.4”項下冷凍保存的5個腎臟組織，以RIPA裂解提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白經變性后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，室溫封閉2 h，加入PI3K（稀釋度為1∶500）、p-PI3K（稀釋度為1∶300）、Akt（稀釋度為1∶400）、p-Akt（稀釋度為1∶200）、p-GSK3β（稀釋度為1∶200）、GSK3β（稀釋度為1∶400）、FN（稀釋度為1∶1 000）、β-actin（稀釋度為1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜；加入二抗（稀釋度為1∶5 000），室溫孵育2 h；加入發光液進行曝光，經凝膠成像系統成像后，采用Image J軟件分析目的蛋白的灰度值，以p-PI3K與PI3K、p-Akt與Akt、p-GSK3β與GSK3β的灰度值比值分別表示PI3K、Akt、GSK3β蛋白的磷酸化水平，以FN蛋白與內參βactin蛋白的灰度值比值表示FN蛋白的表達水平。

2.7 統計學方法

采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 HRCHQ對模型大鼠血清中總蛋白、白蛋白、尿素氮含量的影響

與假手術組相比，模型組大鼠血清中總蛋白、白蛋白含量均顯著降低，尿素氮含量顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，鹽酸貝那普利片組、HRCHQ高劑量組大鼠血清中總蛋白、白蛋白含量均顯著升高，尿素氮含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），HRCHQ中劑量組大鼠血清中白蛋白含量顯著升高（P＜0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠血清中總蛋白、白蛋白、尿素氮含量的測定結果（±s，n＝10）

表1 各組大鼠血清中總蛋白、白蛋白、尿素氮含量的測定結果（±s，n＝10）

a：與假手術組相比，P＜0.01；b：與模型組相比，P＜0.05；c：與模型組相比，P＜0.01

組別假手術組模型組HRCHQ高劑量組HRCHQ中劑量組HRCHQ低劑量組鹽酸貝那普利片組總蛋白/（μg/mL）54.43±4.87 32.38±9.10a 46.97±8.05b 40.83±13.89 38.68±14.85 48.03±4.181c白蛋白/（g/L）32.40±1.40 24.25±0.86a 31.74±5.55c 30.13±5.20b 27.71±6.30 31.11±3.18c尿素氮/（mmol/L）5.87±0.93 10.82±2.11a 7.17±1.51b 9.66±3.32 9.91±3.63 6.37±3.67c

3.2 HRCHQ對模型大鼠腎臟組織中TGF-β1、TNF-α蛋白表達的影響

與假手術組相比，模型組大鼠腎臟組織中有大量TGF-β1、TNF-α蛋白表達，其光密度值均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，HRCHQ高劑量組、鹽酸貝那普利片組大鼠腎臟組織中有少量TGF-β1、TNF-α蛋白表達，其光密度值均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖1、表2。

圖1 各組大鼠腎臟組織中TGF-β1、TNF-α蛋白表達的免疫組化圖

3.3 HRCHQ對模型大鼠腎臟組織中補體C3表達的影響

與假手術組相比，模型組大鼠腎小球系膜區補體C3沉積顯著增加，其熒光強度值顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，HRCHQ高劑量組、鹽酸貝那普利片組大鼠腎小球系膜區補體C3沉積顯著減少，其熒光強度值均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖2、表2。

圖2 各組大鼠腎臟組織中補體C3表達的免疫熒光圖

表2 各組大鼠腎臟組織中TGF-β1、TNF-α光密度及補體C3熒光強度的檢測結果（±s，n＝6）

表2 各組大鼠腎臟組織中TGF-β1、TNF-α光密度及補體C3熒光強度的檢測結果（±s，n＝6）

a：與假手術組相比，P＜0.05；b：與模型組相比，P＜0.05

組別假手術組模型組HRCHQ高劑量組HRCHQ中劑量組HRCHQ低劑量組鹽酸貝那普利片組TGF-β1 0.10±0.02 0.23±0.03a 0.12±0.03b 0.18±0.03 0.21±0.04 0.14±0.02b TNF-α 0.08±0.01 0.22±0.02a 0.10±0.02b 0.19±0.03 0.20±0.02 0.13±0.02b補體C3 42.11±4.02 85.31±6.78a 54.12±5.08b 78.19±5.43 80.21±6.14 48.14±3.19b

3.4 HRCHQ對MsPGN模型大鼠腎臟組織中PI3K/Akt/GSK3β信號通路相關蛋白及FN表達的影響

與假手術組相比，模型組大鼠腎臟組織中PI3K、Akt、GSK3β蛋白的磷酸化水平和FN蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，HRCHQ高劑量組、鹽酸貝那普利片組大鼠腎臟組織中上述指標水平均顯著逆轉（P＜0.05或P＜0.01），HRCHQ中劑量組大鼠腎臟組織中FN蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。結果見圖3、表3。

圖3 各組大鼠腎臟組織中PI3K/Akt/GSK3β信號通路相關蛋白及FN蛋白表達的電泳圖

表3 各組大鼠腎臟組織中PI3K/Akt/GSK3β信號通路相關蛋白磷酸化水平及FN蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝5）

表3 各組大鼠腎臟組織中PI3K/Akt/GSK3β信號通路相關蛋白磷酸化水平及FN蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝5）

a：與假手術組相比，P＜0.05；b：與假手術組相比，P＜0.01；c：與模型組相比，P＜0.05；d：與模型組相比，P＜0.01

組別假手術組模型組HRCHQ高劑量組HRCHQ中劑量組HRCHQ低劑量組鹽酸貝那普利片組p-PI3K/PI3K 0.42±0.03 0.91±0.02a 0.58±0.02c 0.71±0.04 0.83±0.02 0.53±0.04c p-Akt/Akt 0.40±0.03 0.83±0.01a 0.62±0.03c 0.75±0.02 0.77±0.03 0.58±0.02c p-GSK3β/GSK3β 0.21±0.01 0.58±0.02a 0.25±0.02c 0.53±0.02 0.55±0.03 0.41±0.02c FN/β-actin 0.28±0.02 0.69±0.03b 0.34±0.02d 0.41±0.03c 0.64±0.02 0.31±0.01d

4 討論

MsPGN是一種以腎小球病變為主的慢性腎臟疾病，臨床上主要表現為尿蛋白、血尿、水腫、高血壓及腎功能障礙。血清中尿素氮含量的升高以及白蛋白、總蛋白含量的降低可誘導TGF-β1及TNF-α的表達，加重腎衰竭[15]。系膜細胞增殖和細胞外基質沉積是MsPGN的主要病理特征，TGF-β1及TNF-α表達增加，不僅參與腎臟纖維化過程中的細胞外基質聚集，還可參與系膜細胞增殖、炎癥浸潤等多個途徑，如MAPK及PI3K/Akt/GSK3β信號途徑，促進腎組織纖維化[16―18]。補體C3可沉積于腎臟，當其表達增加時，可促進系膜細胞增殖，從而釋放多種炎癥因子，進而加重腎損傷[19]。FN是細胞外基質的主要成分，具有較強的細胞黏附活性，當腎臟細胞受損而發生炎癥反應時，可使FN合成增多而形成積聚，進而參與MsPGN的進程[20]。本研究結果發現，HRCHQ可降低MsPGN模型大鼠血清中尿素氮含量，增加血清中白蛋白及總蛋白含量，減少腎小球系膜區補體C3的沉積，下調腎臟組織中TGF-β1、TNF-α、FN蛋白的表達，表明HRCHQ可能通過減少系膜細胞增殖來改善MsPGN模型大鼠的腎功能。

PI3K是由2種亞單位構成的二聚體，包括具有催化作用的p110和發揮調節作用的p85[21]。Akt是PI3K/Akt信號轉導通路中與MsPGN疾病相關的重要下游靶標分子，作為GSK3β的上游因子，Akt可以從多個環節促進GSK3β的轉錄活性[22]，激活PI3K/Akt/GSK3β信號通路，可加重系膜細胞增殖及細胞外基質的增生[23]。本研究結果發現，HRCHQ可降低MsPGN模型大鼠腎臟組織中PI3K、Akt、GSK3β蛋白的磷酸化水平，表明HRCHQ可能是通過抑制PI3K/Akt/GSK-3β信號通路活性來改善MsPGN模型大鼠的腎功能。

綜上所述，HRCHQ可通過減少系膜細胞增殖以及抑制PI3K/Akt/GSK3β信號通路活性來改善MsPGN。