固本安神方對絕經綜合征模型大鼠的改善作用機制研究Δ

郭珊珊，周曉輝，王淑梅，宗傳杰，刁 麗（滄州市人民醫院藥物臨床試驗機構，河北滄州 061000）

絕經綜合征又稱為“圍絕經期綜合征”或“更年期綜合征”，大多數患者會出現頭暈、出汗、煩躁、易怒、失眠健忘、腰膝酸軟等一系列癥狀。目前，我國約有1.3億女性處于絕經期，其中出現絕經綜合征者占比高于90%，嚴重影響絕經期女性的身心健康和生活質量[1]。

現代醫學認為，絕經綜合征的發生機制與下丘腦-垂體-卵巢軸（hypothalamus-pituitary-ovary，HPO）功能失調有關[2―3]。女子進入絕經期階段后，卵巢功能日漸退化，性激素分泌異常，使HPO功能異常，進而引起生殖、內分泌等系統功能失調，形成多系統、多癥狀的女性絕經期癥候群[4]。針對該病的治療手段，現代醫學多用性激素代替療法，可隨著醫療水平的進步，逐漸發現性激素代替療法療效欠佳，且易引起諸多不良反應，如心腦血管性疾病、子宮內膜癌、乳腺癌、卵巢癌等[5―7]。因此，尋找新的治療絕經綜合征的藥物具有重要意義。

二仙湯出自《中醫方劑臨床手冊》，具有補腎瀉火、調理沖任的作用。固本安神方在二仙湯的基礎上化裁加味而來，主要由葛根、黃芩、遠志、夜交藤等12味藥材組成，臨床上治療腎陰陽俱虛證有較好的療效，滄州市人民醫院（以下簡稱“我院”）擬將其開發為治療絕經綜合征的藥物。有研究表明，促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）既可接受雌二醇（estradiol，E2）的反饋調節，又可調節促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和促卵泡生長激素（follicle stimulating hormone，FSH）的釋放，在HPO軸中發揮重要作用[2]。基于此，本研究基于GnRH分泌信號通路，探討固本安神方對絕經綜合征的改善作用及機制，以期為該方治療絕經綜合征提供實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有TGL16M型臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）、LABOSPECT 008AS型全自動生化分析儀[日立高新技術（上海）國際貿易有限公司]、Rayto RT-6100型酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）、ME155D型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、BX53型顯微鏡（日本Olympus公司）、NANO 2000型紫外分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）、Exicycler 96型熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（韓國Bioneer公司）、WD-9413B型凝膠成像系統（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

固本安神方煎煮液由我院中藥房自制[將葛根、黃芩、五味子、生地、淫羊藿、巴戟天、仙茅、知母、丹皮、夜交藤、酸棗仁、遠志12味中藥按處方比例稱取適量，然后用10倍量（mL/g）水浸泡0.5 h后，回流提取2次，時間分別為90、60 min，合并2次煎液并濃縮成質量濃度為1.8 g/mL的藥液（以生藥量計）]。其他藥品與試劑有更年安片（中藥陽性對照藥，江西南昌桑海制藥有限責任公司，批號190387），戊酸雌二醇片（化學藥陽性對照藥，拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司，批號491A），LH、FSH、E2酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（江蘇酶免實業有限公司，貨號分別為 MM-0624R1、MM-0566R1、MM-0575R1），全蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑盒、ECL發光液（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號分別為WLA019、WLA004、WLA013、WLA003）。本研究所用兔源親吻素 1（kiss‐peptin 1，Kiss-1）、細胞外調節蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）、磷酸化 ERK1/2（phosphorylated，p-ERK1/2）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（二抗）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體均購自沈陽萬類生物科技有限公司（貨號分別為WL02651、WL01864、WLP1512、WLA023、WL01372）；三磷酸肌醇受體1（inositol triphosphate receptor 1，IP3R1）、Kiss-1、GnRH、β-actin的PCR引物均由金斯瑞生物科技有限公司合成（引物序列及擴增產物長度見表1）。

1.3 動物

本研究所用動物為健康SD雌性大鼠，清潔級，體質量220～250 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（遼）2020-0001。大鼠飼養于河北省人民醫院實驗動物中心，環境溫度為22～25℃，相對濕度為50%～55%，光照時間為12 h，明暗交替。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

將80只大鼠適應性喂養7 d后，隨機取70只大鼠參考文獻[8―9]方法復制絕經綜合征模型：大鼠側臥于手術臺上，于肋脊角下方2 cm與脊柱外側2 cm交叉處剪毛、消毒；切開皮膚，鈍性剝離筋膜膜層、肌肉層、腹膜層；結扎輸卵管和周圍脂肪組織，切除卵巢及周圍脂肪組織，撒敷適量青霉素粉，分層縫合組織。同法將大鼠另一側卵巢及周圍脂肪組織切除。術后第5天開始，對每只大鼠進行陰道涂片檢查，每天1次，連續7 d。當鏡下僅見白細胞和少量角化細胞而無成熟上皮細胞時，表明造模成功。本研究共造模成功60只大鼠。

將造模成功的大鼠分為模型組、更年安片組（0.56 g/kg，劑量根據臨床等效劑量換算而得）、戊酸雌二醇片組（0.1 mg/kg，劑量根據臨床等效劑量換算而得）和固本安神方高、中、低劑量組（18.0、9.0、4.5 g/kg，中劑量根據臨床等效劑量換算而得），每組10只。另取10只未造模大鼠作為假手術組（僅切除卵巢周圍適量脂肪組織，其余手術方法同上）。模型組和假手術組大鼠灌胃生理鹽水，各給藥組大鼠灌胃相應藥物，每天1次，連續4周。

2.2 取材

大鼠取材前12 h開始禁食不禁水。于末次給藥30 min后，進行麻醉取材：自大鼠髂主動脈采血，分別置于有抗凝劑的采血管中；剖取大鼠下丘腦組織，濾紙吸干表面水分及少許血液，迅速裝入凍存管中，置于－80℃冰箱保存；剖取大鼠子宮、腎上腺、脾、胸腺，濾紙吸干表面水分及少許血液后稱質量，然后將大鼠子宮固定于10%甲醛溶液中用于病理形態學觀察。

2.3 大鼠血漿中LH、FSH、E2含量的檢測

取“2.2”項下大鼠血漿樣品，以3 000 r/min離心10 min，吸取上清液按試劑盒說明書相關方法操作，檢測大鼠血漿中LH、FSH、E2的含量。

2.4 大鼠臟器指數的測定

取“2.2”項下大鼠子宮、腎上腺、脾、胸腺稱定質量后，計算臟器指數（臟器指數＝臟器質量/體質量）。

2.5 大鼠子宮組織病理形態學觀察

取“2.2”項下各組固定于10%甲醛溶液中的子宮組織適量，經常規包埋、切片、透明、脫蠟、脫水后，以蘇木精染色8 min；水洗后，以伊紅染色2 min，再次水洗、脫水、透明2次；經中性樹膠封片后，置于光鏡下觀察。

2.6 大鼠下丘腦組織中Kiss-1、IP3R1、GnRH mRNA表達水平的檢測

各組取3只大鼠的下丘腦組織樣本5 mg進行總RNA提取，并檢測RNA濃度，然后反轉錄得到cDNA，再以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR。PCR反應體系為cDNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR GREEN mastermix 10 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應條件為94℃預變性5 min，94℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，40個循環。以β-actin作為內參，采用2－ΔΔCt法分析目的基因的表達水平。

2.7 大鼠下丘腦組織中Kiss-1、p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表達水平的檢測

各組取3只大鼠的下丘腦組織樣本5 mg進行總蛋白提取，并采用BCA法檢測蛋白濃度，然后再進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜；以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入Kiss-1（稀釋度為1∶1 000）、ERK1/2（稀釋度為1∶1 000）、p-ERK1/2（稀釋度為1∶500）、β-actin（稀釋度為1∶400）一抗，4 ℃孵育過夜；以TBST洗膜4次，每次5 min，加入二抗（稀釋度為1∶5 000）孵育2 h；以TBST洗膜6次，每次5 min，經ECL顯色后，曝光成像。采用凝膠成像系統進行灰度值分析，以βactin蛋白為內參，以目的蛋白與內參β-actin的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。

2.8 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 固本安神方對模型大鼠血漿中LH、FSH、E2含量的影響

與假手術組比較，模型組大鼠血漿中LH、FSH含量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），E2含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血漿中LH、FSH含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），E2含量（固本安神方低劑量組除外）均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組大鼠血漿中LH、FSH、E2含量的檢測結果（±s，n＝10）

表2 各組大鼠血漿中LH、FSH、E2含量的檢測結果（±s，n＝10）

a：與假手術組比較，P＜0.05；b：與假手術組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.01；d：與模型組比較，P＜0.05

E2/（pmol/L）35.03±4.91 24.03±8.37b 34.41±9.45d 35.33±6.60c 31.45±6.41d 32.48±8.88d 29.30±7.07組別假手術組模型組更年安片組戊酸雌二醇片組固本安神方高劑量組固本安神方中劑量組固本安神方低劑量組LH/（mIU/mL）41.38±3.32 49.25±7.00a 39.19±5.06c 37.54±8.94c 41.17±5.45c 41.51±5.37d 42.43±9.11d FSH/（IU/L）8.20±1.43 10.64±1.21b 9.37±1.28c 8.64±1.63d 9.20±0.69c 9.33±0.71c 9.56±0.96d

3.2 固本安神方對模型大鼠臟器指數的影響

與假手術組比較，模型組大鼠子宮、腎上腺、脾、胸腺臟器指數均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠子宮、腎上腺、脾（戊酸雌二醇片組除外）、胸腺臟器指數均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表3。

表3 各組大鼠子宮、腎上腺、脾、胸腺臟器指數的檢測結果（±s，n＝10）

表3 各組大鼠子宮、腎上腺、脾、胸腺臟器指數的檢測結果（±s，n＝10）

a：與假手術組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01

胸腺2.427±0.459 1.531±0.387a 2.201±0.552c 2.081±0.426c 1.990±0.437b 2.100±0.381c 1.957±0.387b組別假手術組模型組更年安片組戊酸雌二醇片組固本安神方高劑量組固本安神方中劑量組固本安神方低劑量組子宮2.370±0.374 0.529±0.062a 0.625±0.140b 1.056±0.493c 0.584±0.048b 0.613±0.018c 0.588±0.062b腎上腺0.290±0.049 0.229±0.028a 0.277±0.071b 0.261±0.031b 0.261±0.041b 0.262±0.033b 0.255±0.026b脾2.556±0.323 2.212±0.204a 2.592±0.339c 2.221±0.243 2.439±0.260b 2.466±0.273b 2.470±0.317b

3.3 固本安神方對模型大鼠子宮組織病理形態學的影響

假手術組大鼠子宮腺體豐富、單層柱狀上皮細胞排列整齊。模型組大鼠子宮腺體減少，固有層細胞密集。更年安片組和戊酸雌二醇片組大鼠子宮腺體較為豐富，單層柱狀上皮細胞排列較為整齊。固本安神方高、中劑量組大鼠子宮腺體相比模型組增多，單層柱狀上皮細胞排列較為整齊；固本安神方低劑量大鼠子宮腺體增多，固有層細胞略密集。結果見圖1（固本安神方低劑量組圖略）。

圖1 各組大鼠子宮組織病理形態學觀察結果

3.4 固本安神方對絕經綜合征模型大鼠下丘腦組織中Kiss-1、IP3R1、GnRH mRNA表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠下丘腦組織中Kiss-1、IP3R1、GnRH mRNA表達水平均顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠下丘腦組織中Kiss-1、IP3R、GnRH mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表4。

表4 各組大鼠下丘腦組織中Kiss-1、IP3R、GnRH mRNA表達水平的檢測結果（±s，n＝10）

表4 各組大鼠下丘腦組織中Kiss-1、IP3R、GnRH mRNA表達水平的檢測結果（±s，n＝10）

a：與假手術組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05

組別假手術組模型組更年安片組戊酸雌二醇片組固本安神方高劑量組固本安神方中劑量組固本安神方低劑量組Kiss-1mRNA 0.96±0.04 0.60±0.02a 0.90±0.07b 1.46±0.13b 1.79±0.03b 2.07±0.21b 1.96±0.14b IP3R1mRNA 0.96±0.05 0.51±0.04a 0.81±0.06b 0.85±0.08b 0.60±0.05c 0.68±0.04b 0.80±0.06b GnRHmRNA 1.01±0.08 0.41±0.03a 0.59±0.03c 0.83±0.05b 0.86±0.06c 0.80±0.04b 0.81±0.04b

3.5 固本安神方對絕經綜合征模型大鼠下丘腦組織中Kiss-1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠下丘腦組織中Kiss-1、p-ERK1/2蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠下丘腦組織中Kiss-1、p-ERK1/2蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）。結果見圖2、表5。

圖2 各組大鼠下丘腦組織中Kiss-1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達的電泳圖

表5 各組大鼠下丘腦組織中Kiss-1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝10）

表5 各組大鼠下丘腦組織中Kiss-1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達水平的檢測結果（±s，n＝10）

a：與假手術組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01

組別假手術組模型組更年安片組戊酸雌二醇片組固本安神方高劑量組固本安神方中劑量組固本安神方低劑量組p-ERK1/2 1.06±0.11 0.12±0.02a 0.52±0.06b 0.53±0.05b 0.40±0.04b 0.27±0.03b 0.22±0.03b Kiss-1 1.11±0.12 0.53±0.03a 1.17±0.13b 2.20±0.21b 2.79±0.23b 2.83±0.29b 2.75±0.28b ERK1/2 1.03±0.10 0.97±0.07 0.98±0.08 0.96±0.08 1.01±0.09 0.98±0.07 0.98±0.06

4 討論

去勢動物模型是研究絕經綜合征的最佳動物模型，能夠復制出人類絕經綜合征多種臨床表現，如循環系統疾病、代謝紊亂以及骨質疏松等[10]。本研究采用去勢動物模型，術后涂片觀察大鼠動情周期變化，發現假手術組大鼠的動情周期正常，剩余各組均發生明顯改變，且鏡下僅見白細胞和少量角化細胞而無成熟上皮細胞，這表明絕經綜合征模型復制成功。

更年安片是目前臨床上應用較多且臨床療效確切的中成藥，其組成成分、適用范圍與本方十分相近，能有效改善圍絕經期患者血清中性激素分泌水平，緩解絕經綜合征癥狀[11]。戊酸雌二醇片是西醫治療絕經綜合征的常用藥物，其活性成分為E2[5]。據報道，E2能有效改善大鼠絕經綜合征，其作用機制與GnRH受體有關[12]。因此，本研究以這2種藥物作為陽性對照藥，從中藥、化學藥2個角度進行研究，評價固本安神方對絕經綜合征的改善作用及機制。

基于HPO理論，卵巢的分泌活動受下丘腦和垂體的調控，且卵巢分泌的激素可影響子宮內膜發生周期性變化[13]。本研究結果發現，與模型組比較，經固本安神方干預后，大鼠血漿中E2含量和子宮臟器指數均較顯著升高，血漿中LH、FSH含量均顯著降低，子宮腺體增多，單層柱狀上皮細胞排列較為整齊。

下丘腦GnRH神經元是分泌信號形成的重要部位，其信號傳導與Kiss-1及Kiss-1受體關系密切，Kiss-1可通過去極化誘導GnRH神經元持續放電而有效地刺激GnRH的釋放[14]。在GnRH分泌信號通路中，GnRH受體與Gq/11蛋白結合后，可激活磷脂酶C將信號傳遞給IP3，然后刺激細胞內鈣的釋放，從而影響GnRH的合成與釋放（此過程同時也受ERK調節），進而影響FSH和LH的生成[15—16]。本研究檢測了下丘腦和GnRH分泌信號通路中關鍵基因和蛋白的表達，結果發現，經固本安神方干預后，大鼠下丘腦組織中Kiss-1、IP3R、GnRH mRNA以及Kiss-1、p-ERK1/2蛋白的表達水平均顯著升高，這表明固本安神方可能是通過激活GnRH分泌信號通路來改善大鼠絕經期綜合征。

綜上所述，固本安神方可通過升高大鼠下丘腦組織中 Kiss-1、IP3R、GnRH mRNA 和 Kiss-1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達水平，激活GnRH分泌信號通路，從而改善絕經綜合征。