傷科靈噴霧劑特征圖譜及4個成分含量測定方法的建立Δ

支苑，肖婷，何旭洪，朱志軍，曾麗，陶玲，沈祥春，茅向軍，3#（.貴州醫科大學貴州省天然藥物資源高效利用工程中心/貴州省普通高等學校天然藥物藥理與成藥性評價特色重點實驗室/貴州醫科大學-貴陽市聯合重點實驗室/天然藥物資源優效利用重點實驗室/貴州醫科大學藥學院，貴陽 55005；.貴州恒霸藥業有限責任公司，貴陽 550008；3.貴州省藥品審評查驗中心，貴陽 55008）

傷科靈噴霧劑為貴州省苗藥特色產品，由抓地虎、見血飛、仙鶴草、鐵筷子、草烏、山豆根等10味藥材組成。方中抓地虎、鐵筷子、山豆根具有清熱、消腫的功效[1―3]，見血飛、馬鞭草具有活血化瘀的作用[4―5]，草烏抗炎鎮痛效果顯著[6]，白及、仙鶴草可收斂止血[3]，莪術、三棱為行氣破血之要藥[7]。成方后的制劑具有清熱涼血、活血化瘀、消腫止痛的主治功效，且噴霧劑給藥方便，可直接作用于損傷部位，在軟組織損傷、Ⅱ度燒燙傷、骨傷、濕疹、皰疹等方面臨床療效確切。有效可靠的藥品質量控制是保證藥物臨床療效的關鍵，傷科靈噴霧劑現行法定質量標準收載于《國家藥品監督管理局國家藥品標準》[WS-10226（ZD-0226）-2002-2012Z-20180][8]，該標準中薄層鑒別項僅對見血飛和來源于山豆根的苦參堿進行了鑒別，含量測定項僅對苦參堿和氧化苦參堿進行了含量測定研究。現行標準過于簡單，專屬性不強，難以全面控制制劑的內在質量，確保其用藥安全和有效性。中藥特征圖譜具有整體性和模糊性的特點，是一種綜合的、可量化的質量分析方法，能將中藥制劑的內在質量綜合地體現出來，在中藥質量控制中應用廣泛[9]。為了更全面地控制傷科靈噴霧劑的質量，本研究擬采用高效液相色譜（HPLC）法建立傷科靈噴霧劑的特征圖譜，并建立同步測定山豆根中苦參堿、氧化苦參堿和鐵筷子中東莨菪內酯、異嗪皮啶4個成分含量的HPLC法，旨在為傷科靈噴霧劑的質量綜合評價提供研究基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有UltiMate 3000型HPLC儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），ME104/02型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，KQ-300DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

11批傷科靈噴霧劑均由貴州恒霸藥業有限責任公司提供，批號分別為 19030103、19050102、19060101、19080202、19080402、20120101、20120102、20120103、21110101、21110102、21110103，編號S1～S11，規格分別為 50 mL/瓶（S1）、70 mL/瓶（S2、S4）、100 mL/瓶（S3、S5～S11）；氧化苦參堿對照品（批號GR-133-151-19，含量≥98%）購自南京廣潤生物制品有限公司；苦參堿對照品（批號wkq21030302，含量≥98%）購自成都彼樣生物科技有限公司；東莨菪內酯對照品（批號CHB201202，含量≥95%）、異嗪皮啶對照品（批號CHB210112，含量≥95%）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品貯備液的制備 分別精密稱取苦參堿、氧化苦參堿對照品各5 mg以及東莨菪內酯、異嗪皮啶對照品各2.5 mg于不同5 mL容量瓶中，加適量甲醇超聲（功率210 W，頻率40 kHz，下同）5 min使溶解，加甲醇定容，搖勻，制得質量濃度為1 mg/mL的苦參堿、氧化苦參堿對照品貯備液和質量濃度為0.5 mg/mL的東莨菪內酯、異嗪皮啶對照品貯備液。分別精密量取苦參堿、氧化苦參堿對照品貯備液各1 mL和東莨菪內酯、異嗪皮啶對照品貯備液各0.5 mL于同一5 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得苦參堿、氧化苦參堿、東莨菪內酯、異嗪皮啶質量濃度分別為200、200、50、50μg/mL的混合對照品貯備液，4℃冰箱保存，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取傷科靈噴霧劑5 mL，水浴蒸發除去溶劑，加濃氨水1 mL潤濕，然后加入三氯甲烷70 mL，混勻，稱質量，超聲30 min，冷卻至室溫，再次稱質量，加三氯甲烷補足減失的質量。取三氯甲烷層，旋轉蒸發儀濃縮除去溶劑，殘渣加甲醇適量使溶解；用甲醇潤洗3次，將溶液及潤洗液均轉移至5 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻；用0.22μm的微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.3 陰性制劑供試溶液的制備 缺山豆根陰性制劑及缺鐵筷子陰性制劑根據處方量及工藝自制，并按“2.1.2”項下方法制成各陰性制劑供試溶液。

2.2 色譜條件與系統適用性試驗

采用 Ultimate?XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈（B）-0.1%磷酸水溶液（A）為流動相進行梯度洗脫（0～10 min，5%B；10～30 min，5%B→25%B；30～33 min，25%B→33%B；33～45 min，33%B；45～60 min，33%B→90%B）；檢測波長為210 nm；柱溫為35℃；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL。分別精密吸取“2.1”項下混合對照品貯備液、供試品溶液、缺山豆根陰性制劑供試溶液、缺鐵筷子陰性制劑供試溶液，按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，混合對照品貯備液及供試品溶液中4個成分的理論板數均大于10 000，分離度均大于1.5，供試品溶液中各色譜峰與混合對照品貯備液中各對應色譜峰的保留時間基本相同，且陰性樣品色譜圖在對照品色譜圖對應位置上無干擾峰，表明本方法的系統適用性較好。結果見圖1。

2.3 HPLC特征圖譜的建立

2.3.1 精密度試驗 精密量取傷科靈噴霧劑（編號S5）5 mL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續進樣6次，記錄各共有峰的保留時間及峰面積。以東莨菪內酯峰（峰6）為參照峰，計算得到各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.44%（n＝6），相對峰面積的RSD均小于4.21%（n＝6），表明方法精密度良好。

圖1 系統適用性考察的HPLC圖

2.3.2 重復性試驗 精密量取6份傷科靈噴霧劑（編號S5）各5 mL，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄各共有峰的保留時間及峰面積。以東莨菪內酯峰（峰6）為參照峰，計算得到各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.47%（n＝6），相對峰面積的RSD均小于4.03%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 精密量取傷科靈噴霧劑（編號S5）5 mL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件分別在室溫放置0、2、5、12、24 h時進樣測定，記錄各共有峰的保留時間及峰面積。以東莨菪內酯峰（峰6）為參照峰，計算得到各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.71%（n＝5），相對峰面積的RSD均小于4.97%（n＝5），表明供試品溶液在室溫24 h內較穩定。

2.3.4 特征圖譜的建立及共有峰的指認 精密量取11批樣品（編號S1～S11）各5 mL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色圖譜。將11批樣品的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2012版）》，以樣品S2的色譜圖為參照圖譜，設置時間窗寬度為0.1 min，采用多點校正法生成11批樣品的疊加特征圖譜，并采用中位數法生成傷科靈噴霧劑的對照特征圖譜R，見圖2。結果，11批樣品共確認了18個共有特征峰。將供試品圖譜與混合對照品圖譜比對，指認出了4個共有特征峰，分別為峰2（苦參堿）、峰3（氧化苦參堿）、峰6（東莨菪內酯）、峰7（異嗪皮啶），見圖3。

圖2 11批傷科靈噴霧劑的HPLC疊加特征圖譜與對照特征圖譜R

圖3 混合對照品與供試品的色譜圖

2.3.5 相似度分析 以對照特征圖譜R為參照，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2012版）》計算11批樣品的特征圖譜與對照特征圖譜R的相似度。結果，樣品S1～S11的色譜圖與對照特征圖譜R的相似度分別為 0.971、0.990、0.992、0.978、0.992、0.992、0.991、0.990、0.992、0.991、0.996，均≥0.990，表明11批樣品之間的相似度較高。

2.4 苦參堿等4個成分的含量測定

2.4.1 線性關系考察 精密量取“2.1.1”項下混合對照品貯備液50、100、200、400、600、800 μL，用甲醇定容至1 mL，得到系列線性工作液。取上述線性工作液，分別按“2.2”項下色譜條件進樣測定，以對照品質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行回歸分析，得苦參堿、氧化苦參堿、東莨菪內酯、異嗪皮啶的回歸方程分別為Y＝0.120 4X+0.917 8（R2＝0.999 0）、Y＝0.133 5X+0.900 6（R2＝0.999 1）、Y＝1.344 3X－0.212 6（R2＝0.999 9）、Y＝1.655 5X－0.147 7（R2＝0.999 6）。結果表明，苦參堿、氧化苦參堿、東莨菪內酯、異嗪皮啶分別在10～160、10～160、2.5～40、2.5～40 μg/mL質量濃度范圍內線性關系良好。

2.4.2 精密度試驗 取“2.1.1”項下混合對照品貯備液600 μL，以甲醇定容至1 mL，按“2.2”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果，苦參堿、氧化苦參堿、東莨菪內酯、異嗪皮啶峰面積的RSD分別為1.31%、1.57%、0.54%、0.66%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取傷科靈噴霧劑（編號S5）5 mL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在室溫下放置0、2、7、12、24 h時，分別按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，苦參堿、氧化苦參堿、東莨菪內酯、異嗪皮啶峰面積的RSD分別為1.46%、1.70%、0.95%、1.80%（n＝5），表明供試品溶液在室溫24 h內穩定。

2.4.4 重復性試驗 精密量取傷科靈噴霧劑樣品6份（編號S5），每份5 mL，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，通過外標法計算含量。結果，苦參堿、氧化苦參堿、東莨菪內酯、異嗪皮啶的含量分別為30.40、47.66、13.60、12.39μg/mL，RSD分別為1.79%、1.27%、1.36%、1.59%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 取已知含量的傷科靈噴霧劑6份（編號S5），每份2.5 mL，分別加入混合對照品貯備液（含90.00μg/mL苦參堿、125.00μg/mL氧化苦參堿、36.00μg/mL東莨菪內酯、32.00μg/mL異嗪皮啶）1 mL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，分別計算4個成分的平均加樣回收率。結果，苦參堿、氧化苦參堿、東莨菪內酯、異嗪皮啶的平均加樣回收率分別為102.36%、97.84%、103.02%、99.52%，RSD分別為1.49%、1.85%、1.41%、1.42%（n＝6），表明本方法準確度良好。

2.4.6 樣品含量測定 分別精密量取11批傷科靈噴霧劑樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，采用外標法計算4個成分的含量。重復測定3次，取平均值。結果，4個成分的含量范圍分別為 14.48～44.86、32.53～69.76、11.28～20.96、10.36～22.49 μg/mL。結果見表1。

表1 11批傷科靈噴霧劑中4個成分的含量測定結果（n＝3，μg/mL）

3 討論

3.1 定量分析指標的選擇

傷科靈噴霧劑由10味藥材組成，成分較復雜，原質量標準中測定了苦參堿和氧化苦參堿的含量，這2個成分均來源于本制劑中的山豆根藥材[10]。本品為貴州苗藥特色藥，而鐵筷子為苗藥習用藥材，東莨菪內酯、異嗪皮啶為鐵筷子的主要活性成分[2，11]，具有抗菌抗炎、清熱解毒、活血散瘀等功效[12―14]。因東莨菪內酯與異嗪皮啶的作用與本品的功能主治相似，故本研究在苦參堿、氧化苦參堿的基礎上增加了東莨菪內酯、異嗪皮啶的含量測定，以更全面地控該制劑的質量。

3.2 供試品溶液制備方法及色譜條件的篩選

本研究比較了不同提取溶劑種類（乙醇、三氯甲烷、甲醇）、不同提取溶劑用量（三氯甲烷30、40、50、70 mL）、不同氨水用量（1、2、3 mL）下的供試品溶液色譜圖結果，最終選擇1 mL氨水浸潤后以70 mL三氯甲烷超聲提取的方法進行供試品溶液的制備。據2020年版《中國藥典》（一部）及相關文獻報道[3，15―16]，再結合二極管陣列檢測器全波長（190～400 nm）掃描發現，苦參堿、氧化苦參堿的最大吸收峰分別在200.68、201.17 nm處，東莨菪內酯和異嗪皮啶的最大吸收峰在203.81、207.48 nm處，但4個成分在210 nm處左右均有吸收。為減少在梯度洗脫過程中變換波長引起基線漂移，本研究選擇210 nm作為檢測波長。此外，筆者分別考察了以甲醇、乙腈作有機相和磷酸水、三乙胺水作水相組合的流動相洗脫效果，結果以乙腈-0.1%磷酸水系統洗脫可使傷科靈噴霧劑樣品得到較好地分離。最后，筆者分別對不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同柱溫（25、30、35 ℃）進行了考察，結果樣品在柱溫35℃時以1.0 mL/min的流速進行分析可得到較好的分離效果。

3.3 HPLC特征圖譜和含量測定結果的分析

11批傷科靈噴霧劑的HPLC特征圖譜研究結果顯示，不同批次制劑共確認出18個共有峰，且各批次樣品的相似度均≥0.990，表明制劑的質量較穩定。通過與混合對照品圖譜比對，指認出了苦參堿、氧化苦參堿、東莨菪內酯、異嗪皮啶4個共有特征峰。本研究采用HPLC法測定11批傷科靈噴霧劑中上述4個成分的含量發現，每1 mL樣品中苦參堿與氧化苦參堿的總含量最低為0.061 mg，滿足質量標準中要求的每1 mL含苦參堿與氧化苦參堿的總量不得低于0.035 mg的要求[8]。而東莨菪內酯與異嗪皮啶兩者的含量具有一定的相關性，即在東莨菪內酯含量較高的樣品中異嗪皮啶的含量也相對較高；但不同批次樣品間上述2個成分的含量存在差異，這可能與制劑原藥材批次不同有關。

綜上所述，本研究采用HPLC法，在同一色譜條件下建立了傷科靈噴霧劑的特征圖譜和同時測定苦參堿、氧化苦參堿、東莨菪內酯、異嗪皮啶含量的方法，經方法學驗證，該方法穩定、可行；結合特征圖譜和含量測定可為傷科靈噴霧劑的整體質量控制提供參考。