辛伐他汀通過抑制calpain活性減輕ApoE基因敲除小鼠肝功能損傷

楊雅迪，陳錦華，唐富天

(1.錦州醫科大學藥理教研室，遼寧 錦州 121000；2.鐵嶺衛生職業學院，遼寧 鐵嶺 112008；3.蘭州大學第一臨床醫學院，甘肅 蘭州 730000；4.蘭州大學第二醫院心內科、甘肅省消化系腫瘤重點實驗室，甘肅 蘭州 730030)

辛伐他汀(simvastatin，Sim)為羥甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑類降脂藥[13]，通過降血脂作用發揮對心血管疾病的保護作用。然而，研究發現在低于降脂作用的劑量下，Sim仍然對心血管、脂肪肝等疾病具有保護作用[14-15]，然而其作用機制還不十分清楚。本實驗將利用高脂飼料喂養的載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E knockout，ApoE KO)小鼠作為NAFLD模型，研究Sim對小鼠肝功能障礙的保護作用，同時觀察Calpain特異性抑制劑PD150606(PD)對肝功能的影響，并從氧化應激、炎癥反應和calpain活化等方面探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 8周齡健康♂ApoE KO和C57小鼠，體質量(20±2) g，由南京模式動物中心提供。實驗動物在給藥前適應性飼養2周。

1.1.2試劑 高脂飼料購自北京博泰宏達生物技術有限公司。Sim購自上海默克公司。從南京建成生物工程研究所購買如下試劑盒：總膽固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)含量測定試劑盒，天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和谷氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)活性測定試劑盒，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測定試劑盒，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)含量測定試劑盒。PD150606和活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量測定試劑購自Invitrogen公司。

1.1.3儀器 Elx-800型酶標儀購自Bio-tek公司，紫外分光光度計購自購自Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1動物分組及干預 10只C57小鼠作為對照組(C57組)，30只8周齡雄性ApoE KO小鼠隨機分為3組，每組10只即ApoE KO組，ApoE KO+Sim(5 mg·kg-1，p.o.)組，ApoE KO+PD(5 mg·kg-1，i.p.)組。每天1次，給藥干預時間為12周，并且均采用高脂飼料喂養。Sim以0.5%羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)制成混懸液，灌胃劑量為10 mL·kg-1。PD以0.1% DMSO溶解，注射劑量為10 mL·kg-1。Sim和PD的劑量選擇是基于我們之前發表的文章確定的[16-17]。

為保證模擬結果的可靠性，對光滑管從0.5～2.0m/s的入口流速進行模擬，由于研究流體為無相變流體在光滑管管內作強制流動，可將模擬得到的摩擦系數fA與Blasius公式計算理論值對比[9]，從而判定模擬結果的可靠性。結果如表2所示。

1.2.2血清和肝臟中脂質含量測定 將血樣和肝臟勻漿3 000 r·min-1離心10 min，留取上清，使用南京建成生物工程公司試劑盒測定其TC和TG含量。采用酶法生成的反應物在490 nm處測定吸光度。

1.2.3MDA含量和SOD活性測定 肝臟中MDA含量和SOD活性測定采用南京建成生物工程公司試劑盒進行。MDA含量的測定原理和方法為：過氧化脂質降解產物中的MDA可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產物，在532 nm處有最大吸收峰。SOD活性的測定原理和方法為：通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現紫紅色，用可見光分光光度計于550 nm處測其吸光度并計算活性。

1.2.4血清AST和ALT活性測定 應用南京建成生物工程公司試劑盒測定血清AST和ALT活性。AST的測定原理和方法為：AST能使α-酮戊二酸和天門冬氨酸移換氨基和酮基，生成谷氨酸和草酰乙酸。草酰乙酸在反應過程中可自行脫羧成丙酮酸。丙酮酸與2，4二硝基苯肼反應生成2，4二硝基苯腙，在堿性溶液中顯紅棕色。用可見光分光光度計于510 nm處測其吸光度并計算活性。ALT的測定原理和方法為：ALT作用于丙氨酸及α-酮戊二酸組成的底物，生成丙酮酸及谷氨酸，加入2，4-二硝基苯肼鹽酸溶液中止反應后，于505nm處測其吸光度并計算活性。

1.2.5IL-6和TNF-α含量測定 應用南京建成生物工程公司試劑盒測定肝臟中IL-6和TNF-α含量。測定原理和方法為：采用ELISA方法，反應物于450 nm處測其吸光度。

1.2.6DHE染色法測定肝臟組織中ROS含量 肝臟組織用冰凍切片機切片后加入DHE溶液(避光)，恒溫水浴反應30 min后(避光)，用熒光顯微鏡采集圖片，采用紅色熒光的強度來判斷細胞內ROS含量。

1.2.7Calpain活性檢測 肝臟組織進行勻漿后，離心取上清，根據試劑盒說明書檢測calpain活性。激發波長為380 nm，發射波長為460 nm。

2 結果

2.1 Sim和PD對小鼠血清AST和ALT活性的影響與C57小鼠相比，ApoE KO小鼠血清AST(Fig 1A)和ALT(Fig 1B)活性分別增加了87.0%和85.2%。與ApoE KO小鼠相比，給予Sim和PD的小鼠血清AST活性分別降低了37.4%和48.8%，ALT活性分別降低了31.9%和38.7%，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果表明，Sim和PD對肝臟功能損傷具有保護作用。

2.2 Sim和PD對小鼠體質量、血清和肝臟脂質含量的影響各組小鼠體質量在實驗前(Fig 2A)和實驗后(Fig 2B)沒有顯著性差別。與C57小鼠相比，ApoE KO小鼠血清TC(Fig 2C)和TG(Fig 2D)分別增加了2.5倍和1.4倍，表明ApoE KO小鼠形成了明顯的高脂血癥。與ApoE KO小鼠相比，Sim和PD對小鼠血清TC和TG含量沒有明顯影響。另外，與C57小鼠相比，ApoE KO小鼠肝臟TC(Fig 2E)和TG(Fig 2F)含量分別增加了1.2和1.0倍，表明ApoE KO小鼠形成了明顯的脂肪肝。與ApoE KO小鼠相比，給予Sim和PD的小鼠肝臟TC和TG含量沒有明顯的變化。上述結果表明，Sim和PD對肝臟損傷的保護作用與血脂和肝臟脂質含量無關。

Fig 1 Effect of Sim and PD on AST (A) and ALT (B) activity in serum**P<0.01 vs C57 group;##P<0.01 vs ApoE KO group.

Fig 2 Effect of Sim and PD on weight (A and B)，serum TC (C) and TG (D) contents，liver TC (E) and TG (F) content1:C57；2：ApoE KO;3:ApoE KO+Sim;4:ApoE KO+PD.**P<0.01 vs C57 group

Fig 3 Effect of Sim and PD on MDA (A) content and SOD activity (B) and ROS content (C) in liver
1:C57；2：ApoE KO;3:ApoE KO+Sim;4:ApoE KO+PD.**P<0.01vsC57 group;##P<0.01vsApoE KO group.

2.3 Sim和PD對小鼠肝臟MDA含量、SOD活性和ROS的影響與C57小鼠相比，ApoE KO小鼠肝臟MDA(Fig 3A)含量增加了1.5倍，而SOD活性(Fig 3B)降低了63.0%。與ApoE KO小鼠相比，給予Sim和PD的小鼠肝臟MDA含量分別降低了33.5%和43.1%，而SOD活性分別增加了62.1%和112.7%，差異具有統計學意義。另外，與C57小鼠相比，ApoE KO小鼠肝臟ROS(Fig 3C，3D)含量增加了5.4倍。與ApoE KO小鼠相比，給予Sim和PD的小鼠肝臟ROS含量分別降低了50.0%和51.8%，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果表明，Sim和PD降低肝臟氧化水平，增加肝臟抗氧化能力可能是保護肝臟功能的一個重要機制。

2.4 Sim和PD對小鼠肝臟TNF-α和IL-6含量的影響與C57小鼠相比，ApoE KO小鼠肝臟TNF-α(Fig 4A)和IL-6(Fig 4B)含量分別增加了2.0倍和2.2倍。與ApoE KO小鼠相比，給予Sim和PD的小鼠肝臟TNF-α含量分別減少了35.1%和42.8%，IL-6含量分別減少了29.9%和32.7%，差異具有統計學意義。結果表明，抗炎作用是Sim和PD保護肝臟功能的另一個重要機制。

Fig 4 Effect of Sim and PD on TNF-α (A) and IL-6 (B) in liver1:C57；2：ApoE KO;3:ApoE KO+Sim;4:ApoE KO+PD.**P<0.01 vs C57 group;##P<0.01 vs ApoE KO group.

2.5 Sim和PD對小鼠肝臟Calpain活性的影響與C57小鼠相比，ApoE KO小鼠肝臟中calpain活性增加了3.9倍(Fig 5)。與ApoE KO小鼠相比，給予Sim和PD的小鼠肝臟calpain活性分別降低了47.1%和63.1%，差異具有統計學意義。結果表明，Sim和PD降低calpain活性可能是保護肝臟功能的重要機制。

Fig 5 Effect of Sim and PD on calpain activity in liver1:C57；2：ApoE KO;3:ApoE KO+Sim;4:ApoE KO+PD.**P<0.01 vs C57 group;##P<0.01 vs ApoE KO group.

3 討論

本研究結果顯示，Sim能夠減輕脂肪肝所致的肝功能損傷，但對血清和肝臟脂質含量沒有明顯影響。Sim還能夠降低肝臟MDA和ROS含量、提高SOD活性，降低肝臟TNF-α和IL-6水平以及calpain活性。研究還發現，calpain抑制劑PD和Sim有相似的作用。這一發現揭示了Sim保護肝功能損傷的新機制。

血清AST和ALT活性是反映肝臟功能的重要指標。本研究發現，Sim能夠明顯降低ApoE KO小鼠血清AST和ALT活性，表明Sim對脂肪肝誘導的肝臟功能損傷有明顯的保護作用。有研究發現[14-15]，Sim對醋氨酚和膽汁淤積性小鼠肝損傷也有明顯的保護作用。上述研究結果表明，Sim對多種因素造成的肝功能損傷有保護作用，然而其保護作用機制還不十分清楚。

研究發現[18]，20%～80%的NAFLD患者伴有高脂血癥，表明高脂血癥是NAFLD的重要危險因素，而通過調節高脂血癥就能夠有效抑制NAFLD。然而，本研究結果表明，Sim對小鼠血清和肝臟中TC和TG含量沒有明顯的影響，說明Sim對肝臟損傷的保護作用并不是通過降低脂質含量實現的，而是存在其他的作用機制。我們之前研究發現[16]，Sim在對血脂水平沒有影響的劑量下，能夠明顯抑制ApoE KO小鼠動脈粥樣硬化，其機制與調節calpain-1表達、抑制氧化應激和炎癥反應有關。為此，我們進一步探討了這些機制在Sim保護肝功能損傷中的意義。

氧化應激與肝功能損傷關系密切，MDA水平是反映肝臟脂質氧化的重要指標，SOD是重要的抗氧化酶[14]。肝臟SOD活性下降導致ROS增加。本研究發現[7，15]，Sim能夠降低ApoE KO小鼠肝臟MDA和ROS含量，升高SOD活性，表明降低肝臟氧化水平，增加抗氧化能力是Sim保護肝臟功能的重要機制。另外，炎癥反應在肝臟功能紊亂中也具有重要作用，TNF-α和IL-6是重要的炎性因子。本研究發現，Sim能夠減少ApoE KO小鼠肝臟TNF-α和IL-6含量，表明抗炎作用與Sim保護肝臟功能密切相關。有臨床研究報到，TNF-α和IL-6可能參與促進肝臟損傷和NAFLD發展[7]。除了抗氧化應激和炎癥反應的作用外[16-17]，Sim還能夠抑制醋氨酚誘導的小鼠肝損傷的細胞凋亡[14]。

Calpain活化在肝功能損傷中具有重要意義[11-12]。我們前期研究發現，calpain-1基因敲除通過抑制氧化應激和炎癥保護高脂飲食誘導的小鼠肝功能障礙[12]。本研究發現，Sim能夠降低ApoE KO小鼠肝臟中calpain活性，說明抑制calpain活性與Sim降低氧化應激和炎癥水平，進而改善肝功能有關。為了進一步驗證抑制calpain活性和上述作用的關系，本研究還發現，calpain特異性抑制劑PD在抑制ApoE KO小鼠肝臟中calpain活性的同時，還能夠降低氧化應激和炎癥水平，進而改善肝功能。和Sim作用一致，PD對血脂和肝臟脂質水平也沒有明顯的影響，其肝功能保護作用與降低氧化應激反應和炎癥水平有關。

總之，該研究表明Sim和PD都能夠改善ApoE KO小鼠肝功能損傷，其機制可能與抑制calpain活性，進而提高機體抗氧化能力，降低炎癥反應有關。