固相萃取-氣質聯用測定黃瓜中62種農藥殘留

張 瑤， 馬桂娟， 高 琳， 王紫昕， 吳龍國

(1. 寧夏食品檢測研究院（國家市場監管重點實驗室（枸杞和葡萄酒質量安全）），寧夏 銀川 750021;2. 寧夏大學，寧夏 銀川 750021)

0 引 言

黃瓜種植過程中易多發生病菌感染及病蟲害[1]，目前主要通過噴灑農藥進行防治。由于部分病蟲害抗藥性增強，為提高黃瓜產量，大量使用多種農藥進行防治，造成黃瓜農藥殘留嚴重，影響其質量安全。且部分農戶在噴灑農藥后安全間隔期不足即采摘上市，致使黃瓜中農藥殘留風險升高[2]。因此建立黃瓜中農藥殘留檢測方法對于保障黃瓜產品質量安全，降低飲食的潛在風險具有現實意義。

目前，常規的農藥殘留常通過高效液相色譜法[3]、氣相色譜法[4]、高效液相色譜串聯質譜法[5-9]、氣相色譜串聯質譜法[10]進行檢測分析。氣相色譜法和液相色譜法因其靈敏度低且在對多物質進行檢測時難以達到完全分離，定性能力弱，易存在假陽性。由于色譜法存在上述不足，故而色譜與質譜聯用技術逐漸廣泛應用于多農殘檢測。液相色譜質譜法法雖具有高通量、高靈敏度的特點，但是由于部分農殘（如菊酯類）不能檢測，因此常與氣質聯用法互為補充。氣相色譜-質譜聯用技術具有高靈敏度、寬分離度、廣泛的分析范圍等優點，使得其在農藥殘留檢測方面應用頗多[10-14]。目前，對于黃瓜中農藥殘留的氣質法所測的種類均比較單一且農藥數量較少[15-16]，黎宙等[17]利用液液微萃取及氣質聯用技術對黃瓜中9種有機磷進行檢測；張志龍等[18]、白國濤等[19]均采用QUECHERS結合氣質法對黃瓜種15種有機磷及菊酯類物質或10種殺菌劑進行檢測。

本研究以設施黃瓜為研究對象，經調研確定了黃瓜生產中使用的62種農藥，涵蓋有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯、醇類、醚類、酰胺類等多種殺蟲劑、殺菌劑。采用氣質聯用結合固相萃取凈化技術，同時優化程序升溫條件，使得62種農藥待測物在色譜柱中可達到完全分離。鑒于此點，對于氣相色譜法檢測多農殘時難以完全分離從而產生的假陽性問題得到了解決，此方法亦可推廣用于氣相色譜檢測。此外，實驗前處理采用多種固相萃取小柱串接，更適合于成分復雜或顏色較深樣本的檢測，可減少雜質及基質影響，減少干擾，有利于待測物進行準確的定性定量，具有更強可操作性和較好的凈化效果。該方法簡便、快速、穩定性好，可推廣用于基層檢測機構中其他果蔬類多農藥殘留的檢測與分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

GC/MS（7890B-7000C，安捷倫科技有限公司）；數顯型分散機（IKAT25，德國IKA公司）；氮吹儀（HGC-24，北京恒奧德儀器儀表有限公司）； Envi-18柱（2 g/12 mL）, Envi-Carb（0.5 mg/6 mL）柱:美國色譜科；Sep-Pak (0.5 g/6 mL)：沃特世科技(上海)有限公司；旋轉蒸發儀（ BUCHI V-850，瑞士步琦實驗室實驗室公司）；電子天平（BS 224，賽多利斯科學儀器公司）；高速離心機（K3-15，德國 Sigma 公司）。

1.1.2 試劑

丙酮（色譜純）；乙腈（色譜純）；無水硫酸鈉（分析純）；正己烷（色譜純）；62種農藥中英文對照名稱見表1。均購于農業農村部環境保護科研監測所。

1.2 氣相色譜-質譜條件

1.2.1 氣相色譜條件

彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）DB-1 701 ，載氣為高純氦氣，初始體積流量 1.2 mL/min；不分流進樣；升溫程序：初始溫度 40 ℃，保持 1 min，以 30 ℃/min 升至 130 ℃，以5 ℃/min 升至 250 ℃，以 10 ℃/min 升至 300 ℃，保持 6 min。

1.2.2 質譜條件

GC-MS接口280 ℃，離子源溫度230 ℃，四級桿質量分析溫度150 ℃，進樣量1 μL。

1.3 樣品處理

稱取20.00 g(精確至0.01 g)黃瓜于100 mL離心管中，加入乙腈40 mL，置于離心機中10 000 r/min勻漿1 min，然后加入5 g氯化鈉于離心管中，再10 000 r/min勻漿提取1 min，離心4 000 r/min離心5 min，取20 mL上清液待凈化。將Envi-18柱經活化后，加入提取液并用15 mL乙腈洗滌柱，收集所有流出液于40 ℃旋轉蒸發至1 mL，過經5 mL乙腈+甲苯（3+1）溶液活化的Envi-Carb與Sep-Pak的串接柱，并分3次用2 mL乙腈+甲苯（3+1）洗滌雞心瓶，用25 mL乙腈+甲苯（3+1）淋洗，收集所有洗脫液，于40 ℃旋轉蒸發至1 mL，于 35 ℃下氮氣吹干，2 mL正己烷溶解殘渣，經微孔濾膜（0.2 μm）過濾，用氣相色譜質譜聯用儀測定。

1.4 標準曲線

將配制的標準品用正己烷配置成10 μg/mL的混合標準儲備液，儲存在–4℃冰箱中備用。根據實驗需要稀釋成不同濃度的標準工作溶液，上機測定。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

一般而言，未能有效分離的化學物，即使色譜峰重疊，但由于定性、定量離子的差異性，最終也可以獲得質譜分離，從而進行準確定量。但是合理的程序升溫條件，可使多種化合物得以分離，亦能推廣應用于氣相色譜法。本文優化了程序升溫條件，使用了4種不同的程序升溫條件。程序1：設置初始溫度為60 ℃，保持1 min，以40 ℃/min升至120 ℃，以5 ℃/min升至300 ℃，保持5 min。程序2：初始溫度60 ℃，保持1 min，以40 ℃/min升至170 ℃，再以10 ℃/min的速率升至300 ℃，保持5 min。程序3：初始溫度 40 ℃，保持 1 min，以 30 ℃/min 升至 120 ℃，以5 ℃/min 升至 300 ℃，保持 6 min。程序4：初始溫度 40 ℃，保持 1 min，以 30 ℃/min 升至 130 ℃，以5 ℃/min 升至 250 ℃，以 10 ℃/min 升至 300 ℃，保持 6 min。經多種升溫方式比較，程序4最為合適此62種農藥的分離。程序1和程序2不能很好地將待測化合物進行分離，程序3分離時間較長，在大批量做樣時，不利于節省時間，故選擇程序4作為程序升溫條件。結果如圖1所示。

圖1 62種農藥混合標準溶液總離子流圖

由圖1可知，62種農藥混合標準溶液可以在33 min之前全部出峰，且均可以得到較好的分離，以各物質響應最高且無基質干擾的離子做定量離子，以響應較高的離子作為定性離子，可對物質進行定性、定量檢測。

2.2 優化前處理條件

2.2.1 溶劑的篩選

根據相似相溶的原理，大部分農藥為有機農藥，所以其易溶于乙酸乙酯、乙腈、丙酮。因試驗對比發現，經丙酮提取，有機相顏色較深，可能是丙酮將試樣本身攜帶的色素提取較多，對測定產生的干擾較強，并且分層效果不明顯，鹽析效果不如乙腈。使用乙酸乙酯進行提取，雖然大部分回收率符合回收要求，但提取液中的雜質較多，對后續分析干擾較大。以乙腈作為提取溶劑，可以減少黃瓜中色素的提取量，并且絕大多數農藥的回收率處于合理范圍。另外加入氯化鈉，經勻漿和高速離心后，一方面使有機相與水相更好地分離，另一方面可使黃瓜中的糖分、有機酸等雜質溶于水，降低雜質的干擾，從而提高各待測化合物回收率，因此本文選擇乙腈作為提取溶劑。用含有石墨化碳黑的小柱處理農殘樣品時，有些分子結構是平面的農藥會被石墨化碳黑吸附，很難洗脫，導致回收率低[20]。在洗脫SPE小柱過程中，甲苯可以將其從SPE柱中洗脫下來，以提高平面分子結構農藥的回收率。故經實驗發現采用乙腈+甲苯（3+1）作為洗脫液，要優于用乙腈、正己烷+乙酸乙酯（1+1），可提高樣本回收率。

2.2.2 固相萃取柱的選擇

固相萃取柱主要的作用是選擇性吸附與洗脫，去除雜質。C18柱具有強疏水性，主要用于去除脂類，對非極性的組分有極強的吸附作用。GCB柱適用于去除色素、甾醇類等干擾。Sep-Pak固相萃取柱能與部分官能團的分子形成氫鍵，可有效去除磺酸根離子等陰離子，同時能夠吸附目標待測物，提高目標化合物回收率。以此，本實驗選擇了C18、GCB、Sep-Pak作為凈化用固相萃取柱。

2.2.3 基質效應

由于樣品基質中存在部分共提取物組分，這些組分對待測化合物的測定精確度存在一定的影響，從而形成了基質增強或減弱的效應。主要表現為基質標液與同濃度的純溶劑標液相比，具有更高或更低的響應值。

式中：ME——基質效應；

Km——基質標準曲線的斜率；

Ks——溶劑標準曲線的斜率。

當 ME＜0時，表現為基質抑制效應，當 ME＞0，表現為基質增強效應。當ME＜20%時，表現為弱基質效應，可忽略不計；20%＜ME＜50%時，表現為中等基質效應；ME＞50%時表示基質效應增強。在氣質常常表現為基質增強效應，為了避免基質效應對定量的影響，本實驗采用基質標準曲線進行定量。

2.2.4 標準曲線、線性范圍及檢出限

由于基質中的雜質會對目標化合物離子的定量測定產生干擾，因此提取空白基質作為對照。使用正己烷分別將配制的62種農藥標準儲備液稀釋成10.0 μg/mL混合標準溶液，然后用空白基質將混合標 準 溶 液 配 置 成20，50，100，200，500，750，1 000 ng/mL的標準工作液，經氣相色譜質譜聯用儀測定。采用空白樣品添加方式考察62種農藥的檢出限（S/N=3），根據不同農藥測定的峰面積和對應的濃度分別制作標準曲線，采用外標法進行定量，結果見表1。

表1 62種農藥的質譜分析參數、線性回歸方程及檢出限

續表1 62種農藥的質譜分析參數、線性回歸方程及檢出限

由表1可知：62種農藥的保留時間范圍為7～33 min之間，r2在0.966 0～0.999 2之間，可能是基質影響了樣品的離子化，且對不同濃度樣品影響不同，因此各物質的線性相關系數存在一定的差異性。檢出限為0.03～20 μg/kg，可滿足日常檢測所需。

2.3 回收率和精密度

方法的準確度和精密度分別用添加回收率和添加回收率的標準偏差（RSD）進行評價。在空白黃瓜基質樣品中進行0.02，0.08，0.15 mg/kg 3個水平的添加回收試驗，每個水平6次重復，按建立的方法和色譜條件進行樣品處理和測定，計算不同添加水平下的回收率和相對標準偏差（RSD），結果如表2所示。

由表2可知，不同添加水平下，同種農藥的回收率存在一定差異。農藥化合物的加樣回收率范圍主要集中在60.0%～120.0%之間，RSD為1.3%～15.3%；在低水平的加標回收中存在回收率大于130.0%或小于60.0%的現象，這主要是由于樣品在質譜離子化過程和離子傳輸過程中的復雜環境，容易受到樣本本底及雜質干擾、自身極性、穩定性等理化性質的影響存在一定的定量偏差。

表2 62種農藥不同添加水平的回收率和精密度

續表2 62種農藥不同添加水平的回收率和精密度

2.4 實際樣品的檢測

本文通過優化的方法對21批次的黃瓜中62種農藥進行檢測，如表3所示。其中己唑醇檢出率最高為14.3%，檢出量最高為0.036 mg/kg，溴螨酯檢出率為9.5%，最高檢出量為0.041 mg/kg，甲氰菊酯、速滅磷等檢出率均低于5%，且檢出量都不高，參照GB 2763—2021《食品安全國家標準》，均低于標準中規定的最大殘留量。經研究以上幾種農藥分別為廣譜殺菌劑，殺蟲劑，可用于治療黃瓜白粉病、茶黃螨、跗線螨、紅蜘蛛等。

表3 黃瓜中農藥的檢出結果

3 結束語

本文利用氣相色譜串聯質譜法結合固相萃取技術，優化前處理、確定了最佳的質譜條件及程序升溫方式，對黃瓜中62種農藥殘留進行檢測。同時考察了方法的線性、不同水平的回收率、檢出限與精密度等參數，并以實際樣品進行檢測進行驗證。根據前期實驗基礎發現，此方法凈化效果好，特別適合顏色較深、基質相對復雜的樣品，且操作簡便、靈敏度較高，具有良好的準確度和精密度，可用于大批量樣品的快速檢測。對其他蔬菜、水果、糧谷類等農產品中農藥殘留檢測提供一定的參考價值。