升清膠囊六種單體對肝細胞氧化應激的影響

李 陽，張靜喆，顧宏剛*

（1.鄭州人民醫院/河南中醫藥大學人民醫院消化內科，鄭州 450003；2.上海中醫藥大學附屬龍華醫院普外科，上海 200032）

過氧化氫（H2O2）具有很強的氧化性，不僅可以直接氧化細胞膜上的脂質和蛋白質，還可以通過細胞膜與細胞內的鐵離子發生反應，生成活性更強的自由基（如OH等），引起一系列氧化應激反應[1]。選用H2O2誘導正常人肝細胞LO2氧化應激模型，研究升清膠囊六種單體對正常人肝細胞LO2氧化應激模型的修復作用，進一步闡明升清膠囊抗氧化能力，篩選其有效單體成分，并分析其安全性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞人肝細胞LO2（normal human hepatic cell line） 由中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供。

1.1.2 藥物與試劑 98%純度白藜蘆醇苷、白藜蘆醇、橙皮苷、大黃酚、大黃素、大黃酸、維生素E（南京澤郎醫藥科技有限公司）；30% H2O2（上海阿拉丁公司）；RPMI 1640培養基、胰蛋白酶（美國Gibco 公司）；青霉素、硫酸鏈霉素（華北制藥股份有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀（國藥集團化學試劑有限公司）；噻唑藍（MTT）（上海譜振生物科技有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）（上海生工生物工程有限公司）。

1.1.3 藥物配置 將升清膠囊（上海中醫藥大學附屬龍華醫院院內制劑，滬藥制字Z05170981，由生大黃、虎杖、陳皮三味中藥組成）的六種單體（白藜蘆醇苷、白藜蘆醇、橙皮苷、大黃酚、大黃素、大黃酸）和維生素E分別用DMSO溶解，若不能充分溶解，則借助超聲波溶解。為了減少對試驗的影響，DMSO在含藥培養液中的最終體積比最好低于0.1%。

1.1.4 實驗儀器 超凈工作臺（江蘇蘇凈集團安泰公司）；DHG-9203A 型電熱恒溫干燥箱（上海精密實驗設備有限公司）；立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）；電子分析天平、架盤藥物天平、精密PH計（上海精密科學儀器有限公司）；ThermoMK3酶標儀、細胞培養箱（美國Thermo公司）；細胞培養板，細胞培養瓶（美國Corning公司）；可調式移液器（德國Eppendorf公司）；Olympus IX71倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；J-301高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；純水凈化儀（美國MiliQ公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲有限公司）；液氮生物容器（成都金鳳液氮容器有限公司）；恒溫水浴箱（上海精宏實驗設備有限公司）；-20℃冰箱（美國ScienTemp公司）；-80℃冰箱（日本三洋公司）。

1.2 細胞培養

正常人肝細胞培養于10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的RPMI 1 640培養基中，置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度的恒溫培養箱，根據生長狀況進行傳代培養，待細胞生長至約80%融合狀態可用于實驗。

1.3 實驗方法

MTT還原測定法檢測細胞活性MTT還原測定法又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。噻唑藍（MTT）是一種可接受氫離子的黃色化合物，作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈，在細胞色素C和琥珀酸脫氫酶的作用下四唑（tetrazolium）環開裂，還原生成水不溶性藍紫色的甲臜（formazan）結晶，并沉積在細胞中，死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原，因此甲臜結晶的生成量與活細胞數目成正比。用DMSO溶解還原生成的甲臜結晶，在490 nm波長處，用酶聯免疫檢測儀測定光吸收（OD）值，來反映出活細胞數目。MTT法不能測定細胞絕對數，只能用來檢測細胞相對活力和相對數。為確保實驗結果的線性，采用酶標儀檢測結果時，MTT 吸光度的范圍最好在0～0.7。

1.4 分組及干預

1.4.1 檢測H2O2對肝細胞半數抑制濃度（IC50） 取對數生長期肝細胞，分為正常組和模型組，模型組按 H2O2不同濃度（25 μm、50 μm、100 μm、200 μm、400 μm、600 μm、800 μm、1 000 μm）再分為 8 組，每組設6個平行孔。調整細胞懸液濃度，按每毫升1×105細胞接種于96孔培養板，每孔100 μL，邊緣孔用無菌PBS填充。置于5%CO2、37℃、飽和濕度的恒溫培養箱中培養12 h。培養結束后棄上清并用PBS洗滌細胞2次，模型組加入200 μL含有不同終濃度H2O2的培養液，正常組加入等體積培養液，置于培養箱培養1 h。培養結束后棄上清并用PBS洗滌細胞2次，每孔加入200 μL RPMI-1 640培養液繼續培養24 h。培養結束后棄上清并用PBS洗滌細胞2次，每孔加入200 μL含10% MTT的培養液，培養4 h后終止培養，棄上清并用PBS洗滌細胞2次，每孔加入100 μLDMSO，置搖床上振蕩10 min，充分溶解甲臜，用酶標儀測定490 nm處的光密度（OD）值，計算細胞的生長抑制率。

1.4.2 升清膠囊六種單體及VE對肝細胞的生長抑制情況的影響 取對數生長期肝細胞，分為正常組和實驗組（白藜蘆醇苷組、白藜蘆醇組、橙皮苷組、大黃酚組、大黃素組、大黃酸組、維生素E組），每個實驗組按不同藥物濃度（25 μm、50 μm、100 μm、200 μm、300 μm、400 μm）再行分組，共 43組，每組設6個平行孔。按每毫升1×105細胞接種于96孔培養板，每孔200 μL，置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度的恒溫培養箱中培養12 h。培養結束后棄上清并用PBS洗滌細胞2次，實驗組每組每孔加入200 μL含有不同濃度的白藜蘆醇苷、白藜蘆醇、橙皮苷、大黃酚、大黃素、大黃酸、維生素E的RPMI-1 640培養液，正常組加入等體積的RPMI-1 640培養液，培養24 h。MTT法測定細胞活性。

1.4.3 升清膠囊六種單體對肝細胞氧化應激的影響 取對數生長期肝細胞，分為正常組、模型組、白藜蘆醇苷治療組、白藜蘆醇治療組、橙皮苷治療組、大黃酚治療組、大黃素治療組、大黃酸治療組和維生素E對照組，治療組和對照組按藥物不同濃度（25 μm、50 μm、100 μm、200 μm）再行分組，共 30 組，每組設6個平行孔。按每毫升1×105細胞接種于96孔培養板，每孔200 μL，置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度的恒溫培養箱中培養12 h。培養結束后棄上清并用PBS洗滌細胞2次，模型組、治療組、對照組分別加入200 μL由培養液稀釋成終濃度為300 μm的H2O2，正常組加入等體積的培養液，繼續培養1 h。培養結束后棄上清并用PBS洗滌細胞2次，治療組、對照組每組每孔加入200 μL含有不同濃度的白藜蘆醇苷、白藜蘆醇、橙皮苷、大黃酚、大黃素、大黃酸、維生素E的RPMI-1 640培養液，正常組和模型組加入等體積的RPMI-1 640培養液，培養24 h。MTT法測定細胞活性。

1.5 統計學方法

計量資料用均數±標準差（±s）表示，2組間均數比較采用獨立樣本t檢驗方法，數據經SPSS 16.0進行統計，用levene法進行方差齊性檢驗，行單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較，方差齊用LSD-t法，方差不齊用Tamhane’s T2法，進行顯著性分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義；以P＜0.01為差異具有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 肝細胞氧化應激模型的建立

肝細胞經H2O2作用后，求得IC50值作為建立模型的濃度。結果見表1、圖1。

表1 不同H2O2濃度對肝細胞生長存活情況的影響（±s，n= 70）

表1 不同H2O2濃度對肝細胞生長存活情況的影響（±s，n= 70）

注：與正常組比較，## P＜0.01

組別 濃度/μm 細胞生存率/%正常組 0 100.00±1.88模型組 1 25 94.86±2.12模型組 2 50 89.64±2.45##模型組 3 100 80.09±2.19##模型組4 200 59.20±2.38##模型組 5 400 39.85±2.19##模型組 6 600 24.84±2.07##模型組 7 800 16.64±2.07##模型組 8 1000 5.41±1.08##

圖1 不同H2O2濃度對肝細胞存活率的影響

由表1和圖1可以求得H2O2的半數抑制濃度為300 μm，此時細胞雖遭受一定程度的損傷，但仍具有活力。因此，后續實驗采用H2O2的作用濃度為300 μm、作用時間為1 h的模型條件下展開。

2.2 升清膠囊有效成分及VE的安全性分析

肝細胞經過不同濃度的升清膠囊六種單體及維生素E作用24 h后細胞存活情況如表2、圖2所示。

圖2 不同藥物濃度對肝細胞存活率的影響

表2 不同藥物濃度對肝細胞生長存活情況的影響（±s） μm

表2 不同藥物濃度對肝細胞生長存活情況的影響（±s） μm

組別 例數 25 50 100 200 300 400白藜蘆醇苷組 36 89.56±2.29 85.15±3.01 79.08±3.87 49.96±3.34 41.43±2.98 27.87±2.06白藜蘆醇組 36 96.23±2.19 93.25±3.03 86.47±3.43 72.45±2.87 50.54±2.65 29.13±2.67橙皮苷組 36 95.68±1.94 88.42±2.91 85.56±3.28 83.03±3.62 75.15±3.89 48.36±2.83大黃酚組 36 96.75±2.57 91.26±3.32 80.39±3.86 69.65±3.48 48.53±3.09 28.94±2.61大黃素組 36 95.13±2.91 90.28±3.54 83.61±3.78 60.24±3.05 40.03±2.87 19.85±2.69大黃酸組 36 94.81±2.47 84.81±3.06 59.57±3.79 43.82±3.32 33.64±2.95 17.59±1.83維生素 E 組 36 95.48±1.62 93.12±2.33 87.29±3.06 53.34±3.94 38.36±3.21 23.58±1.88正常組 6 100.00±0.34 100.00±0.34 100.00±0.34 100.00±0.34 100.00±0.34 100.00±0.34

由表2和圖2可以求得升清膠囊六種單體：白藜蘆醇苷、白藜蘆醇、橙皮苷、大黃酚、大黃素、大黃酸及對照品維生素E對肝細胞的IC50分別為200 μm、300 μm、390 μm、290 μm、245 μm、155 μm、220 μm。升清膠囊六種單體的IC50均＞150 μm，表明這六種單體對肝細胞的毒性小，安全性高；并且維生素E的IC50也＞200 μm。后續實驗采用的藥物濃度均在IC50范圍內，以保證藥物對細胞的毒性降至最低。

2.3 升清膠囊有效成分的篩選

肝細胞經300 μm H2O2作用1 h，采用不同濃度的升清膠囊六種單體及維生素E對H2O2氧化應激模型修復24 h后，細胞存活情況見表3、圖3。

表3 不同藥物在不同濃度下對H2O2作用的肝細胞生長存活情況的影響（±s） μm

表3 不同藥物在不同濃度下對H2O2作用的肝細胞生長存活情況的影響（±s） μm

注：與白藜蘆醇治療組（50 μm）內比較，## P＜0.01；與橙皮苷治療組（100 μm）內比較，△△ P＜0.01；與大黃酚治療組（50 μm）內比較，▲▲P＜0.01；與維生素E對照組（50 μm）內比較，□P＜0.05，□□P＜0.01；與大黃酚治療組（50 μm），■P＜0.05，■■P＜0.01；與橙皮苷治療組（100 μm）比較，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01

組別 例數 25 50 100 200白藜蘆醇苷治療組 24 57.73±1.44 60.86±1.27■◇◇ 57.49±1.38 39.04±2.51白藜蘆醇治療組 24 62.25±1.82## 68.13±2.49■■◇ 60.35±1.26## 40.84±2.36##橙皮苷治療組 24 55.18±1.14△△ 0.08±1.91△△■■ 71.22±2.13 61.16±2.39△△大黃酚治療組 24 59.94±1.22▲▲ 63.85±3.46◇ 59.06±1.36▲▲ 41.93±2.53▲▲大黃素治療組 24 59.46±0.88 61.13±1.51■◇ 58.58±1.21 38.60±2.52大黃酸治療組 24 57.80±1.31 9.91±1.29■■◇◇ 56.68±1.63 36.63±1.61維生素E對照組 24 63.24±1.65□ 68.84±4.78■■ 60.75±1.90□ 42.17±2.00□□模型組 6 50.32±2.77 50.32±2.77 50.32±2.77 50.32±2.77正常組 6 100.00±5.44 100.00±5.44 100.00±5.44 100.00±5.44

圖3 不同藥物不同濃度下對H2O2作用的肝細胞存活率影響

由表3和圖3可以發現：在25～100 μm范圍內，升清膠囊六種單體均有一定的修復作用。當藥物濃度為200 μm時，除橙皮苷外，其他藥物表現出一定的細胞毒性，不僅沒有對損傷細胞修復，反而加重細胞的損傷。在六種單體中，橙皮苷、白藜蘆醇和大黃酚對H2O2造成的肝細胞氧化應激有較好的修復作用，以橙皮苷效果最好，白藜蘆醇次之，大黃酚再次，均優于大黃素、大黃酸和白藜蘆醇苷（P＜0.05或P＜0.01）。橙皮苷的最佳修復濃度為100 μm，其他藥物的最佳修復濃度均為50 μm。

3 討論

升清膠囊由生大黃、虎杖和陳皮三味中藥組成。生大黃的主要有效成分為蒽醌衍生物，如大黃酸、大黃酚、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚及其結合物等。大黃附子湯（RAD）含藥血清能改善內毒素誘導的Caco-2細胞氧化應激損傷和炎癥反應[2]。虎杖的主要有效成分為大黃素為主的蒽醌類化合物，包括大黃素甲醚、大黃酚、白藜蘆醇苷、白藜蘆醇、虎杖鞣質、黃酮醇苷類物質和草酸等[3]。現代藥理研究顯示虎杖有擴血管、抗血栓、抗休克、降血脂、抗感染、抗病毒、保肝、抗氧化的多重作用并且與大黃對降低膽道括約肌的緊張性有協同作用[4]。虎杖提取物（PCE）可能通過靶向Keap1/ Nrf2途徑，降低果糖喂養大鼠的氧化應激，防止肝臟脂質積聚[5]。活性氧產生氧化應激并促進結直腸癌的發生，陳皮具有通過誘導Nrf2來抑制細胞氧化應激的能力，從而防止了偶氮甲烷誘導的結腸癌發生[6]。

經研究發現：1）H2O2對肝細胞的半數抑制濃度為300 μm，此時肝細胞受到一定程度的損傷，但仍具有活力。因此，后續實驗采用H2O2的作用濃度為300 μm、作用時間為1 h的模型條件下展開。2）升清膠囊六種單體白藜蘆醇、白藜蘆醇苷、橙皮苷、大黃酚、大黃素、大黃酸的IC50均＞150 μm，表明這六種單體對肝細胞的毒性小，安全性高；維生素E的IC50也＞200 μm；后續實驗使用的藥物濃度均在IC50范圍內，以保證藥物對細胞的毒性最小化。3）在25～100 μm范圍內，六種單體均有一定的修復作用，白藜蘆醇、橙皮苷和大黃酚對H2O2造成的肝細胞氧化應激模型有較好的修復作用，橙皮苷效果最好，白藜蘆醇次之，大黃酚再次，均優于大黃素、大黃酸和白藜蘆醇苷。4）橙皮苷、白藜蘆醇和大黃酚的最佳修復濃度分別為 100 μm、50 μm、50 μm；對照品VE的最佳修復濃度為50 μm。5）當藥物濃度在200 μm時，多數單體非但沒有表現出修復作用，反而表現出一定的細胞毒性，其原因可能是H2O2增大細胞膜的通透性，相同濃度（200 μm）的藥物進入氧化損傷細胞要多于正常細胞，從而造成細胞分裂的減緩和（或）細胞的死亡。6）H2O2對肝細胞半數抑制濃度為300 μm，升清膠囊六種單體對肝細胞的安全性都比較高，對H2O2造成的肝細胞氧化損傷均有一定的修復能力，其中橙皮苷、白藜蘆醇和大黃酚有較好的修復作用，其修復作用分別優于、相當、次于VE。后續試驗將以橙皮苷、白藜蘆醇和大黃酚為三因素進行優化組合，以三者分別最佳修復濃度的2/3、1/3、1/6為高（H）、中（M）、低（L）三個水平，采用正交設計和組分定量技術進行組合，并以VE最佳修復濃度全劑量作為對照展開。