萘乙酸在黃瓜中的殘留及膳食攝入風險評估

許海康，臧婭磊，李 萌，李 通，周 娟，安 莉，馬婧瑋，宋 鍵，吳緒金*

(1.河南省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，河南 鄭州 450002；2.鄭州鄭氏化工產品有限公司，河南 鄭州 450002；3.商丘市實驗中學，河南 商丘 476000)

黃瓜最初生長在熱帶雨林地區，是一年生蔓生植物[1]。富含纖維素、維生素以及各種礦物質，深受人們喜愛，已成為我國重要的蔬菜之一。萘乙酸化學名稱為1-萘乙酸，英文通用名為Naphthylacetic acid，化學式是C12H10O2。萘乙酸是一種具有生長素類性質的植物生長調節劑，可以促進細胞分裂和擴大，誘導不定根的形成，促進植物的光合作用和新陳代謝，增加坐果率[2]。

目前，國內外關于萘乙酸的研究主要涉及萘乙酸的合成工藝[3]，對小鼠的毒性效應[4]，對植物扦插生根的影響[5-6]，增強油菜幼苗的抗逆性[7]，提高作物的產量與品質[8-12]，在蘋果、柑橘等瓜果中的殘留檢測方法[13-14]。已報道萘乙酸的檢測方法主要有紫外分光光度法[15]、高效液相色譜法[16]、氣相色譜法[17]和高效液相色譜-串聯質譜法[18-19]等，此外還出現了一些新型檢測方法，如多壁碳納米管增敏的電化學傳感器檢測法[20]、雙水相萃取-流動注射化學發光法[21]等?？椎卵蟮萚22]研究了以二氯甲烷為萃取溶劑，GPC(Gel Permeation Chromatography)凈化，高效液相色譜分離，二極管陣列檢測器測定水稻植株及土壤中萘乙酸的檢測方法。牟艷莉等[23]報道了2%甲酸的乙腈溶液為提取劑，Poly-Sery MAX混合型陰離子交換固相萃取柱凈化后，采用Phenomenex Gemini-NX 5uC18110A柱進行分離，用液相色譜-串聯質譜法檢測萘乙酸在橙中的殘留量。胡曉科等[24]報道了萘乙酸在黃瓜、番茄中經QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)前處理，乙腈-二氯甲烷(1：1)提取，分散固相萃取法凈化，超高效液相色譜法進行檢測。José A.等[25]優化了熒光分光光度法，在測定草莓樹漿果和柑橘類水果中的萘乙酸時，無需事先分離，更加快速、準確。

在黃瓜生長期間施用萘乙酸，有利于植株的生長發育，提高黃瓜產量。但關于萘乙酸在黃瓜中的殘留分析和膳食攝入評估報道卻很少。本試驗采用QuEChERS前處理方法，HPLC-MS /MS對黃瓜中萘乙酸進行檢測，開展萘乙酸在黃瓜中的殘留對國人攝入風險進行評估，為萘乙酸在黃瓜上的科學合理使用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試農藥：10%吲哚丁酸·萘乙酸可溶液劑。

供試作物黃瓜，品種：內蒙古呼和浩特為德爾2012；遼寧遼陽為80-5；山西太原為17-8；天津寶坻為津優35號；山東濟南為津春四號；河南鄭州為黑優301；河北邢臺為馳譽鳳凰；上海松江為瑞新黑亮王；安徽合肥為中農2號；湖南長沙為津研7號；貴州貴陽為環農402；廣西南寧為豐田黃瓜16號。

1.2 田間試驗 試驗時間2019年。按照農業農村部農藥檢定所發布的《農藥登記殘留試驗區域指南》[26]選擇試驗地點，分別為內蒙古呼和浩特市、遼寧省遼陽市、山西省太原市、天津市、山東省濟南市、河南省鄭州市、河北省邢臺市、上海市、安徽省合肥市、湖南省長沙市、貴州省貴陽市和廣西省南寧市。按照《農作物中農藥殘留試驗準則》[27]要求設置處理區和空白對照區，小區面積≥50m2，小區間設置隔離帶。按照有效成分用量為10mg/kg，于黃瓜3～4葉期和初花期各噴霧施藥1次，末次施藥后3和5d采集黃瓜樣品。

樣本采集和制備：按照試驗設計的采樣時間要求，每次在每個小區黃瓜植株的不同部位至少采集12個黃瓜樣品。每個小區均采集2個平行樣品。將切碎后黃瓜樣品充分混和均勻，各取2份150g樣品，用干冰粉碎機把黃瓜樣品粉碎，分別裝入樣品容器中，貼好標簽，-20 ℃保存，待測。

1.3 檢測方法

1.3.1 試劑和儀器設備 純度為96.9%的萘乙酸標準品；色譜純的乙腈和甲醇；色譜純的甲酸和乙酸銨；分析純的氯化鈉和無水硫酸鎂；ODS C18。

SCIEX QTRAP 4 500 高效液相色譜儀三重四級桿串聯質譜儀；SQP電子天平(d=0.01g)、BS 224 S電子天平(d=0.1mg)；微乳劑 204E；Milli-Q Synthesis超純水機；多管渦旋振蕩器VX-Ⅲ；多管渦旋混合器UMV-2；L-550臺式低速離心機；迷你離心機MLX-210；變速攪拌打碎機R10V.V。

1.3.2 溶液配制 精確稱取0.010 2g的萘乙酸標準品，甲醇定容制成1 000mg/L的母液，甲醇作為稀釋溶劑，稀釋配制系列純溶劑標準溶液5、2、1、0.5、0.2、0.1mg/L。按照1.3.4的操作步驟，得到黃瓜空白基質溶液作為稀釋溶劑，配制系列基質標準溶液0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01mg/L。

1.3.3 檢測條件 液相色譜柱：島津 Shim-pack XR-ODSⅢ(2.0mm ×75mm，1.6μm)；柱溫：40 ℃；流速：0.3mL/min；進樣量：2μL；流動相梯度洗脫條件(表1)。電離方式：ESI-；離子源溫度：500℃；霧化電壓：5500V；霧化氣體類型：空氣；霧化氣體壓力：50psi；碰撞氣體類型：氮氣；檢測方式：多反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)模式下萘乙酸保留時間是4.33min，定性離子對是185/141m/z，定量離子對為185/141m/z，碰撞電壓是14eV。

表1 流動相梯度洗脫條件

1.3.4 樣品處理 準確稱取20.00g試驗樣品于50mL離心管中，加入10mL純水，20mL乙腈，5g氯化鈉，渦旋震蕩提取20min，再4 000r/min離心10min，取1.5mL上清液裝入含有0.03g無水硫酸鎂和0.03gC18的2mL離心管中。渦旋1min，1 0000r/min離心5min，取上清液經0.22μm濾膜過濾后，待測。

1.3.5 方法有效性評價 將1.3.2配置好的黃瓜空白基質梯度萘乙酸標準溶液，以溶液質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制工作曲線，評價線性相關性及基質效應。通過在空白黃瓜樣品中分別加入0.01、0.1、1mg/kg萘乙酸標準溶液，每個濃度均設置5個平行，分別計算回收率和相對標準偏差，用于評價正確度以及精密度。以最低添加濃度作為定量限。

1.4 膳食風險評估 以國家衛生行政部門發布的中國居民營養與健康狀況監測調查為依據，結合萘乙酸殘留化學評估推薦的規范殘留試驗中值、已制定的萘乙酸最大殘留限量(maximum residue limits，MRLs)和急性參考劑量(acute reference dose，ARfD)，計算萘乙酸的國家估算每日攝入量(national estimated daily intake，NEDI)、每日允許攝入量(acceptable daily intake，ADI)、國家估計短期攝入量(national estimated short term intake，NESTI)以及占急性參考劑量的百分比(ARfD%)，計算公式見參考文獻[28-33]。

2 結果與分析

2.1 方法有效性評價

2.1.1 線性相關性及定量限 將萘乙酸標準溶液用甲醇逐級稀釋制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.5mg/L的標準溶液，以濃度(mg/L)—峰面積(A)作標準曲線，結果(表2)，決定系數R2=1.000 0，萘乙酸在0.01～0.5mg/L范圍內在基質中呈現良好的線性關系。以添加回收試驗中最小添加濃度為定量限，萘乙酸在黃瓜中的定量限為0.01mg/kg。

表2 萘乙酸的回歸方程、決定系數、基質效應和定量限

2.1.2 基質效應 按照以下公式計算萘乙酸在黃瓜中的基質效應。

公式1

式中，微乳劑為基質效應；X基質為基質標樣斜率；X溶劑為溶劑標樣斜率

基質效應(Matrix Effect)評價標準：對純溶劑與基質配制標準曲線的斜率進行比較，若基質效應的絕對值≥20%，則采用基質配制標準溶液制作標準曲線，絕對值<20%，則采用純溶劑配制標準溶液制作標準曲線。按公式1計算出基質效應微乳劑=3.9%，微乳劑<±20%，表明基質效應較弱，因此本試驗樣品檢測采用純溶劑配制標準曲線。

2.1.3 添加回收試驗 當添加水平為0.01、0.1和1mg/kg時，黃瓜中萘乙酸的平均回收率分別為99%、112%和104%，相對標準偏差分別為5.7%、4.9%和6.5%。方法正確度和精密度均符合《農作物中農藥殘留試驗準則》要求。

2.2 最終殘留試驗 結果表明(表3)，采收間隔期為3d時，黃瓜中萘乙酸的平均殘留量均<0.01mg/kg；采收間隔期為5d時，黃瓜中萘乙酸的平均殘留量均<0.01mg/kg。目前GB 2763-2021規定黃瓜中萘乙酸的最大殘留限量值為0.1mg/kg[34]。本試驗中不同采收間隔的黃瓜樣品中萘乙酸殘留量均低于我國制定的限量標準。

表3 萘乙酸在12個試驗點黃瓜中最終殘留

2.3 膳食風險評估 結合萘乙酸在黃瓜中的最終殘留量，運用膳食攝入風險評估模型進行萘乙酸在黃瓜上的急性膳食攝入和長期膳食攝入風險評估[37]。目前，萘乙酸在我國水稻、小麥等20種作物上已登記。根據中國健康與營養調查總結報告數據，將所有登記作物進行膳食分類[38]。萘乙酸ADI值是0.01mg/(kg·bw)，我國居民的平均體重為63kg。計算結果(表4和表5)，黃瓜中萘乙酸的國家估計短期攝入量是0.012 7mg/(kg·bw)，占急性參考劑量百分比是12.7%，萘乙酸使用后不存在急性膳食風險；普通人群萘乙酸的國家估算每日攝入量是0.053mg，占日允許攝入量的0.6%左右，結果表明對一般人群健康不會產生不可接受的風險。

表4 萘乙酸急性膳食攝入評估計算表

表5 萘乙酸長期膳食攝入評估計算表

3 討論與結論

本研究建立了采用QuEChERS方法進行前處理、高效液相色譜-串聯質譜法測定黃瓜中萘乙酸殘留量的分析方法。該方法打破了傳統的高效液相色譜法檢測器種類少等檢測樣品的局限性，廣泛應用于農藥殘留檢測中，可以同時有效應用在多種植物生長調節劑在不同果蔬中的殘留檢測。前處理方法是檢測農藥在農產品中殘留的關鍵步驟，QuEChERS方法作為一種創新型樣品前處理技術，具有操作簡便，快速，成本低和安全可靠等優點，此外QuEChERS方法也在應用中不斷優化改進應用在不同果蔬中的農藥殘留檢測[35-36]。在添加水平為0.01～1mg/kg時，萘乙酸在黃瓜中的平均添加回收率為99%～112%，相對標準偏差為4.9%～6.5%，具有良好的線性關系，回收率較好，精密度高，可適用于黃瓜中萘乙酸殘留的定量分析。

萘乙酸在12地黃瓜樣品中的殘留量均<0.01mg/kg，對黃瓜中萘乙酸的膳食攝入風險進行評估，結果表明：10%吲哚丁酸·萘乙酸可溶液劑按照本研究的施藥劑量、施藥次數和采收間隔使用，黃瓜中萘乙酸的殘留量對我國一般人群健康不會產生不可接受的風險。