響應面法優化糯玉米淀粉酶解工藝制備抗消化淀粉

孫琳琳 ，李克文 ，孫桂蓮 ， 龔魁杰 ，， 劉開昌 ，

（1. 山東省農業科學院作物研究所，山東 濟南 250100；2. 保齡寶生物股份有限公司，山東 禹城 251200）

糯玉米，也稱蠟質玉米，在我國廣泛種植[1]。糯玉米中淀粉含量為65%～75%，糯玉米淀粉基本上是由支鏈淀粉組成[2]，與普通玉米淀粉相比，易糊化、膨脹力高、黏滯性大和透明度高，經常在釀酒、制藥、食品添加劑及飼料等方面有很好的應用[3-5]。糯玉米淀粉經改性后，其開發利用前景更為廣泛。

根據淀粉消化特點將淀粉分為快速消化淀粉、慢消化淀粉和抗性淀粉[6]。快速消化淀粉是指在小腸內被迅速消化吸收的淀粉；慢消化淀粉指小腸內被完全消化吸收，但吸收速度較慢的淀粉[7]；抗性淀粉指不能被小腸的淀粉酶消化吸收的淀粉[8]，其主要在大腸中發酵，產生短鏈脂肪酸，RS3 是膳食中抗性淀粉的重要成分[9-10]。抗性淀粉和慢消化淀粉均具備營養與功能的雙特性，對糖尿病和肥胖癥等慢性疾病有一定的預防和控制作用[11-13]。

采用酶法制備慢消化淀粉和抗性淀粉，無化學殘留、安全，符合食品發展的趨勢。糯玉米淀粉高度分支，用于制備慢消化淀粉和抗性淀粉具有比普通玉米淀粉更高的制備效率。淀粉酶是一種脫支酶，對α-1,6- 糖苷鍵水解具有很強的專一性[14]。試驗采用單因素試驗考查不同因素對SDS 和RS 含量的影響，通過響應面試驗進一步優化制備工藝，為異淀粉酶對糯玉米淀粉SDS 和RS 的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糯玉米淀粉，市售；豬胰α - 淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶，Sigma 公司提供；醋酸鈉、DNS、無水乙醇等，均為分析純試劑。

KjeitecTM 8400 型凱式定氮儀，丹麥FOSS 公司產品；GL124-1SCN 型分析天平，德國賽多利斯有限公司產品；PKDD-5 型大容量離心機，湖南平科儀器有限公司產品；GZX-9240MBE 型電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠產品；UV-2600型紫外- 可見分光光度計，日本島津公司產品；FE28-bio pH 計，瑞士梅特勒- 托利多有限公司產品；JYL-Y92 型粉碎機，山東九陽電器有限公司產品；DK-98-ⅡA 型數顯電子恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 體外消化性測定方法

參考文獻[15-16]中的方法稍作修改，稱取1 g 淀粉樣品（干基），將其溶于0.1 mol/L 的醋酸鈉緩沖液（pH 值5.2） 20 mL 中，在漩渦混勻器上劇烈混勻，加7 粒玻璃珠振蕩水浴5 min，加入5 mL 混酶液（豬胰α - 淀粉酶活性為290 U/mL，淀粉葡萄糖苷酶15 U/mL）。將此混合溶液在37 ℃下以轉速180 r/min振蕩水浴。在20，120 min 時取樣0.5 mL，加入20 mL的無水乙醇離心管中滅酶，以轉速4 000 r/min 離心10 min。采用DNS 法測定葡萄糖含量。

20 min 測定獲得葡萄糖含量為快速消化淀粉（RDS），20～120 min 測定獲得葡萄糖含量為慢消化淀粉（SDS），120 min 時仍未消化的淀粉為抗性淀粉（RS）。

1.2.2 糯玉米淀粉酶解工藝

參考文獻[17-18]方法稍作修改，取適量糯玉米淀粉配制成20%淀粉乳，微波使淀粉完全糊化，然后冷卻至酶解溫度，添加適量異淀粉酶在最適pH 值5.8 條件下酶解脫支處理一定時間，酶解結束后，馬上將溶液加熱到100 ℃保持15 min 滅酶。之后用冰浴迅速冷卻至室溫，調節pH 值至中性，離心取上清，最后在4 ℃條件下冷藏老化一定時間，然后置于鼓風干燥箱中45 ℃下烘干，粉碎，測定SDS+RS的含量。

1.2.3 單因素試驗設計

以酶解時間（15，30，60，90，120 min）、酶添加量 （1，3，5，7，9 U/g）、酶解溫度 （40，45，50，55，60 ℃）、老化時間 （12，24，48，72，96 h） 為影響因素，分別考查各因素對SDS+RS 含量的影響。

1.2.4 響應面優化試驗設計

運用Design Expert 8.0.6.1 軟件，采用響應曲面法，以SDS+RS 含量為指標對酶解條件進行優化，根據試驗數據進行回歸擬合建立回歸模型。

因素與水平設計見表1。

表1 因素與水平設計

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶解時間對SDS+RS 含量的影響

酶解時間對SDS+RS 含量的影響見圖1。

圖1 酶解時間對SDS+RS 含量的影響

由圖1 可看出，隨著酶解時間的增加，SDS+RS含量呈現先上升后降低的趨勢，在酶解時間為60 min時，SDS+RS 含量達到最高為29.373%±0.141%。酶解時間在15～60 min 時，SDS+RS 含量增加較快，酶解時間超過60 min 時，SDS+RS 含量呈現緩慢下降的趨勢，可能是由于隨著酶解時間的延長，異淀粉酶會把糯玉米淀粉分解為小分子糖類，使直鏈淀粉含量下降，不利于老化，使得SDS+RS 含量下降。因此，酶解時間選擇60 min 為最佳。

2.1.2 酶添加量對SDS+RS 含量的影響

酶添加量對SDS+RS 含量的影響見圖2。

圖2 酶添加量對SDS+RS 含量的影響

由圖2 可看出，隨著酶添加量的增加，SDS+RS含量呈現先上升后下降的趨勢，酶添加量由1 U/g 增加到3 U/g，SDS+RS 含量急速上升為27.267%±0.316%，而隨著酶量的繼續增加，SDS+RS 含量卻出現了下降趨勢，這可能是過多的異淀粉酶進一步酶解直鏈淀粉為麥芽糖和麥芽二糖[19]，過短直鏈淀粉對SDS+RS 的形成重組有消極影響。因此酶添加量選擇3 U/g 為最佳。

2.1.3 酶解溫度對SDS+RS 含量的影響

酶解溫度對SDS+RS 含量的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對SDS+RS 含量的影響

由圖3 可看出，糯玉米SDS+RS 制備過程中SDS+RS 含量隨酶解溫度的增加呈先上升后下降的趨勢，酶解溫度為50 ℃時，SDS+RS 含量最高為28.330%±0.353%。這可能是與異淀粉酶活性受溫度影響有關，溫度太高會抑制異淀粉酶活性[20]。因此，酶解溫度選擇50 ℃為最佳。

2.1.4 老化時間對SDS+RS 含量的影響

老化時間對SDS+RS 含量的影響見圖4。

圖4 老化時間對SDS+RS 含量的影響

由圖4 可看出，SDS+RS 含量的變化隨著老化時間的延長呈現先上升后下降的趨勢，老化時間48～96 h下降趨勢較為平緩，由27.267%±0.316%下降到26.175%±0.200%，因此老化時間選擇24 h 為最佳。

2.2 響應面試驗酶解工藝優化

2.2.1 模型建立與分析

為確定糯玉米淀粉酶解的最優工藝條件，在單因素試驗基礎上，以SDS+RS 含量為響應值進行響應面回歸分析。

Box-behnken 設計方案及試驗結果見表2。

表2 Box-behnken 設計方案及試驗結果

利用Design Expert 軟件，通過表2 中試驗數據進行多元回歸擬合，得到回歸模型為：

回歸模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析

對SDS+RS 方差分析結果表明，所建立的二次回歸模型是極顯著的（p＜0.01），失擬項差異不顯著，p=0.146 2＞0.05，說明試驗的二次多項式回歸無失擬性因素存在，回歸模型與試驗值結果擬合較好，具有代表性。回歸方程中一次項A、B 表現極為顯著，一次項C 表現為顯著，而二次項BD 表現為顯著，二次項CD、A2、B2、C2、D2表現為極顯著，說明這些因素對響應值的影響較大，且各因素之間非簡單的線性關系。同時，回歸方程的復相關系數R2=0.968 9 和R2Adj=0.937 9，說明可以利用該回歸方程對酶解工藝進行分析和預測。根據回歸模型方程中各因素回歸系數絕對值大小，可知各因素影響SDS+RS 含量的順序為酶添加量（B） ＞酶解時間（A） ＞老化時間（C） ＞ 酶解溫度 （D）。

2.2.2 響應面分析及優化

各因素交互作用對SDS+RS 含量影響的響應曲面圖見圖5。

圖5 各因素交互作用對SDS+RS 含量影響的響應曲面圖

根據回歸方程，作出響應面，考查擬合響應曲面的形狀，分析4 個因素對SDS+RS 含量的影響。通過Design Expert 軟件分析，得出糯玉米淀粉酶解最佳工藝條件為酶解時間48.88 min，酶添加量2.69 U/g，老化時間23.78 h，酶解溫度49.62 ℃，此時SDS+RS含量預測值為34.200 6%。考慮到實際操作情況，將條件修正為酶解時間49 min，酶添加量2.7 U/g，老化時間23.8 h，酶解溫度49 ℃，在此條件下做驗證試驗，得到SDS+RS 含量為34.103%，與模型預測值較為接近。采用響應面法優化得到的酶解工藝條件比較可靠，具有一定的實用價值。

3 結論

通過研究酶解時間、酶添加量、老化時間、酶解溫度對糯玉米淀粉酶解提高SDS 和RS 含量的影響，采用異淀粉酶對糯玉米淀粉進行酶解，通過單因素試驗和響應面法對酶解糯玉米淀粉工藝進行優化。最佳工藝條件為酶解時間49 min，酶添加量2.7 U/g，老化時間23.8 h，酶解溫度49 ℃，在此優化條件下酶解糯玉米淀粉得到SDS+RS 含量為34.103%。在后續研究中可對酶解液進行純化以提高SDS 和RS含量。