5株生防菌定殖能力、促生作用及其對木薯細菌性枯萎病生防潛力的研究

吳金山，王思琦，黃家權，賈迎雪，陳銀華*

5株生防菌定殖能力、促生作用及其對木薯細菌性枯萎病生防潛力的研究

吳金山1,2，王思琦1，黃家權1，賈迎雪2，陳銀華1*

1. 海南大學熱帶作物學院，海南海口 570228；2. 海南大學林學院，海南海口 570228

生物防治是防控木薯病害的有效手段之一。生防菌株的篩選、定殖能力直接關系到菌株抗性的穩定性及防治木薯細菌性枯萎病的效果。本研究在前期大田初步篩選菌株及大棚盆栽防效測定實驗的基礎上，根據綜合賦值結果優選5株生防菌株，對其大田防效潛力進行測定；分析生防菌株對木薯各項生長指標的影響；篩選出防效和促生效果均表現較好的菌株，研究其在木薯不同部位的定殖能力及消長動態變化，旨在為篩選木薯細菌性枯萎病生防菌株提供數據參考，為后期生防菌劑的研發提供理論依據。結果表明：5株生防菌株中HWY-3-1防效最好，平均防效為61.35%，DBS-5最低，為5.02%，其余3株菌株HWS-4-3、HS-4-7、HNR-3-7的防效分別為45.02%、19.09%和24.08%；與對照相比，5株生防菌株對木薯均有不同程度的促生效果，其中HWY-3-1菌株處理的木薯在株高、最大薯塊直徑和單株薯塊重等生理特性上顯著高于其他生防菌處理，HWY-3-1和HWS-4-3菌株處理后木薯的基部莖粗和薯塊數顯著高于其他菌株處理；綜合比較，生防菌株HWY-3-1、HWS-4-3和DBS-5的防效和促生效果較好。3株生防菌株接種在木薯3個部位后均能穩定定殖，HWY-3-1的定殖能力最強；在根表土的定殖量顯著高于葉片，嫩莖中的定殖量最少；3株菌株定殖后活菌數量均呈先上升后下降最后趨于穩定的變化趨勢。

木薯細菌性枯萎病；生防菌；防效；生理特性；定殖特性

木薯（）為大戟科木薯屬多年生木本灌木，原產于南美洲，主要種植在熱帶和亞熱帶地區，具有產淀粉率高，對環境適應性較強、耐高溫、干旱、耐貧瘠等優點[1]，與紅薯、馬鈴薯被列為世界三大薯類作物，在我國華南及中部多個省（區）都有種植[2]，生產的淀粉是重要的食品及生物能源物質，其提供的熱量大約能供地球10億人的日常所需[3]。

木薯細菌性枯萎病（cassava bacterial blight, CBB）是由地毯草黃單胞木薯萎蔫致病變種（pv,）侵染引起的重要病害[4]，發病嚴重時可造成高達90%的產量損失，甚至絕收，在世界各地普遍發生。早在1912年巴西就有木薯細菌性枯萎病的記載。20世紀70年代，此病已蔓延到亞洲和非洲區域[5-6]，最先在巴西大面積爆發，隨后迅速傳播到世界各地，造成了嚴重的經濟損失，并成為國際進出口檢疫主要病害之一[6]。在我國，該病最早在臺灣地區發生流行，隨后在深圳和海南儋州被發現并迅速在各省傳播開來。木薯發生該病后造成產量損失達30%，淀粉出粉率減少約40%[7]。

目前該病害主要采取預防及綜合防治的方法[8-10]來抑制病害的發生。利用化學藥劑防治可以一定程度上防治該病害，但隨著時間的推移，病原菌的耐藥性會逐漸增強，防效隨之降低，且防治過程中對生態環境也造成一定的污染[9]。生物防治因其安全和持效性已成為植物病害防治研究的熱點[10]。目前應用生防菌防治黃瓜枯萎病和霜霉病[11]、棉花黃萎病[12]等一些作物病害的成功案例已有報道，生物防治中以菌防菌已成為一種發展趨勢。生物防治是未來木薯病害防控技術研究的主要方向，或將成為防控木薯細菌性枯萎病的有效手段之一。有研究發現葉片噴施假單胞菌和懸浮液可減輕木薯病害[9]。陳奕鵬等[13]分離出的內生生防菌株類芽孢桿菌屬，在田間防控試驗中對木薯細菌性萎蔫病具有較好的防治效果，但目前對木薯細菌性枯萎病的生防菌株定殖能力和防治效果篩選鑒定的報道較少。本研究在前期大田菌株篩選及盆栽防效測定的基礎上，優選5株生防菌株進行大田防效及促生效果測定，篩選出候選菌株進行定殖能力研究，其結果可為后期生防菌劑的研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 實驗以木薯品種‘SC 9號’為材料（對細菌性枯萎病為中度感病），選擇生長健壯，發育良好，大小一致的莖稈，將其砍成40 cm長，種植于海南大學儋州校區農科木薯基地，于4月中旬種植，翌年1月收獲測值。植株長至10片葉時進行田間接菌。

1.1.2 供試菌株 生防菌株由中國熱帶農業科學院廣州試驗站鄭麗贈送。致病菌木薯細菌枯萎病菌種來自本課題組。

1.1.3 培養基 LA培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，pH 7.0，純凈水定容至1 L。

LB培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，NaCl 5 g，pH 7.0，無菌蒸餾水定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 田間防效測定 在前期平板及盆栽防效實驗的基礎上[7]，優選賦值較好的5個生防菌株進行田間防效實驗。采用隨機區組設計，分3個區組，每區組6個處理，每個處理即每個菌株10個重復（10株苗）。

接菌處理：將生防菌株濃度為108CFU/mL的發酵液菌劑（5個）稀釋10倍，總體積為30 mL，通過噴施的方式進行接菌（菌液噴施至葉片滴漏為止）。每株均加入0.01% Tween-20表面活性劑，搖勻后進行噴施。對照組（CK）為稀釋同等倍數的LB培養液加0.01% Tween-20表面活性劑，以相同的方法進行處理。

生防菌接種5 d后，通過注射器施壓的方式[14]將濃度為107CFU/mL的致病菌株接種到葉片上，每株接種5片葉，進行大田防效測定。在接種病原菌第25、28、30、33、35天時，調查統計病害嚴重度，以病斑面積與葉片總面積的比值作為病情分級指標，0級：無病斑；1級：病斑面積占整葉面積的5%以下；3級：病斑面積占整葉面積的6%～15%；5級：病斑面積占整片葉面積的16%～25%；7級：病斑面積占整片葉面積的26%～50%；9級：病斑面積占整片葉面積的50%以上。

1.2.2 生防菌促生效果測定 將大田防效測定后的植株，在第2年1月（正常收獲時間）利用鋼尺及游標卡尺對其進行株高、基部莖粗、單株薯塊數、單株最大薯塊直徑及單株重進行測量，分析各菌株對木薯植株生理指標的影響。

1.2.3 利福平抗性誘導及遺傳穩定性檢測 按吳藹民等[15]的方法，連續增加利福平濃度至300 μg/mL，對HWY-3-1、DBS-5、HWS-4-3菌株進行抗性誘導，并利用吳勝春等[16]的方法對其進行遺傳穩定性檢測。利用木薯細菌性枯萎病病原菌和抗性穩定的菌株進行平板對峙實驗，重復5次。

1.2.4 生防菌株在木薯根表土、嫩莖及葉片中的定殖特性研究 （1）標記菌株的接種。室內盆栽扦插苗的獲得：盆栽土均用烘箱滅菌（121℃滅菌20 min）。噴施生防菌株，5 d后接種病原菌，噴施量為30 mL/株，菌液濃度為1×107CFU/mL。于接菌后0、1、3、5、7、9、11、15、20、30、60 d，分別取根表土、嫩莖及葉片進行標記菌株定殖量測定，并繪制生長曲線。

（2）標記菌株在各部位中定殖及消長動態變化。在接菌后不同時間段內，選取接菌木薯苗（每個處理3個重復），從根表土、嫩莖段、葉片中采集微生物，涂板檢測標記菌株數量。取幼嫩莖段、葉片消毒處理后，剪碎各取1 g，充分研磨后加入9 mL無菌水，渦旋振蕩10 min，得到母液。將母液進行梯度稀釋，涂布在含有300 μg/mL的利福平平板上進行菌落計數、繪圖。根表土稱重，直接用蒸餾水稀釋。參照上面的步驟涂板觀測菌落數。

1.3 數據處理

病情嚴重度=[∑(每一病害等級的植株數量×病害等級)/(總植株數×最高病害等級數)]×100%；

生防效果=[(對照組病害嚴重度–處理組病害嚴重度)/對照組病害嚴重度]×100%；

所得基礎數據利用Excel 2019軟件進行統計分析，利用SPASS 22軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 木薯細菌性枯萎病生防菌株的大田防效

結合綜合賦值以及大棚盆栽防效實驗結果，優選防效較好的5株生防菌株進行大田防效測定，接種生防菌后25～35 d統計病情指數，并計算生防效果。5株生防菌株中HWY-3-1防效最好，平均防效為61.35%，DBS-5最低，為5.02%，其余3個菌株HWS-4-3、HS-4-7、HNR-3-7的防效分別為45.02%、19.09%和24.08%（表1）。

表1 5株生防菌株的大田防效

注：同列不同小寫字母表示菌株間差異顯著（<0.05）。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference among strains (<0.05).

2.2 生防菌株對木薯的促生作用

由表2可知，利用5株菌株分別處理木薯植株后，各處理植株均表現出一定生理指標差異。在株高方面，HWY-3-1菌株處理后表現最好，植株最高，平均株高為162.42 cm；其次是HWS-4-3，為159.13 cm，其余3個菌株變化不大。在基部莖粗和薯塊數方面，HWY-3-1和HWS-4-3的促生效果基本一致，在5株菌株中均表現較好。在最大薯塊直徑方面，HWY-3-1表現最好，為4.10 cm，但5株菌株個體間相差不大。在單株薯塊重方面，HWY-3-1表現最好，為3.49 kg，其次是HWS-4-3，為3.37 kg，其余3株菌株和對照相比，略有增加，但不明顯。5株菌株在生理特性方面HWY-3-1表現最好，其次是HWS-4-3，其余3株和對照相比，表現不明顯。由此可以推測，HWY-3-1和HWS-4-3菌株對木薯植株具有一定的促生作用。

表2 5株生防菌株對木薯植株生理特性影響

注：同列不同小寫字母表示菌株間差異顯著（<0.05）。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference among strains (<0.05).

2.3 抗性菌株在根表土、嫩莖及葉片中的定殖特性

首先取盆栽土壤樣品中的微生物，通過利福平平板篩選，確定所取土壤中的無抗性菌株。隨后，利用該方法研究3株菌株在根表土中定殖量的變化情況。如圖1A所示，生防菌株HWY-3-1在第1天時活菌數量最大，為4.10×105CFU/g，接種后第7天，活菌數量保持在1.0×105CFU/g以上，9 d后逐漸趨于穩定，60 d后，仍維持在2.43×104CFU/g。生防菌株DBS-5在接種后第1天，根表土活菌數量最大，為3.67×105CFU/g，到第7天，則下降了一個數量級。11 d后，逐漸趨于穩定，第60天的活菌數量則為1.60×103CFU/g。生防菌株HWS-4-3在接種后第1天，根表土活菌量為3.53×105CFU/g，11 d后逐漸趨于穩定，在第60天，活菌量為2.10×103CFU/g。在根表土中，3株候選生防菌株接種后3 d均達到最大值，其中HWY-3-1菌株為4.1×105CFU/g，HWS-4-3最低，為3.53×105CFU/g。隨后活菌數量逐步減少，7～11 d后下降比較緩慢，之后基本穩定在103～104CFU/g（圖1A）。以上結果表明，3株生防菌株在根表土中均能穩定定殖，并且在土壤中的存活時間超過60 d。

3株生防菌株在嫩莖、葉片中的定殖量，由圖1B～圖1D可知，定殖量呈先增長后降低，后又趨于穩定的變化趨勢。在嫩莖中，HWY-3-1和HWS-4-3菌株在第7天時均達最大值，活菌量分別為3.03×103CFU/g和8.73×102CFU/g；但DBS-5菌株在第11天時達最大值，為1.23×103CFU/g；在第60天時，3個菌株的活菌量仍保持在2個數量級，分別為4.10×102CFU/g（HWY-3-1）、2.13×102CFU/g（HWS-4-3）、4.53×102CFU/g（DBS-5）。

在葉片中，HWY-3-1菌株活菌量在第7天時達到最大，為4.20×103CFU/g，HWS-4-3和DBS-5菌株分別在第9天時達到最大值，分別為4.27×103CFU/g和3.40×103CFU/g。但在第60天時，3個菌株活菌量仍保持在3個數量級。分別為2.43×103CFU/g（HWY-3-1）、1.73×103CFU/g（HWS-4-3）、1.80×103CFU/g（DBS-5）。3株菌株在土壤中均能很好地定殖，在第7天基本達到最大值，HWY-3-1定殖效果最好，具有優選菌株的潛力。

3 結論與討論

細菌性枯萎病是目前危害木薯最為嚴重的病害之一，為了有效控制該病害帶來的不利影響，國內外學者在該病害的防控技術上做了大量研究工作。由于化學防治在一定程度上造成了環境污染和生產成本增加，同時也由于社會對綠色生態的要求不斷提高，生物防治的手段越來越受到人們重視[17-18]。因此，尋找與環境相容性好、具有潛在改善或修復生態環境、低毒高效的生防菌株成為生物防治的首要任務。

圖1 3株生防菌株在木薯根表土、嫩莖及葉片中的定殖情況

定殖能力是生防菌能否成功控制病害的決定性因子[19-20]，且受生防菌自身特性以及周圍環境如溫度、濕度、光照、營養狀況、生物等諸多因素的影響[21]。一株優秀的生防菌株應該具備定殖能力強、穩定性好、繁殖速度快、空間競爭能力及抗菌性強等特點，這也是生物防治的關鍵[22]。目前，大部分篩選工作都在離體條件下利用生防菌株對病原菌的頡頏效能開展的。平板頡頏效果良好且具有溫室防效的菌株較少，具有大田防效的不到1%[23]。

本研究基于鄭麗等[7]前期菌株篩選結果，根據綜合賦值、頡頏效能、生長素的分泌以及溫室防效等結果，優選5株生防菌株進行田間實驗，分別為HWY-3-1（頡頏效能及溫室防效較好）、HWS-4-3（頡頏效果好、生長素分泌高、溫室防效好、綜合賦值高）、HS-4-7（生長素分泌高）、HNR-3-7（綜合賦值最高）、DBS-5（大棚防效好）。通過田間接菌檢測，5株菌株平均防效分別為61.35%、45.02%、19.09%、5.02%、24.08%，其中菌株HWY-3-1的田間防效最好。在供試菌株中，HWY-3-1的綜合賦值位于中間水平，但頡頏效能位于第二，溫室盆栽防效為100%，田間防效為61.35%，是所選菌株中最優秀的菌株；HWS-4-3的頡頏效果和生長素分泌均最高，溫室防效第二（85.99%），具有一定的田間生防效能；HNR-3-7的綜合賦值最高，但溫室及田間防效表現均較低，可能與菌株的定殖情況有關；HS-4-7的綜合賦值為10，位于第二位，且生長素含量最高，但大田防效一般；DBS-5的綜合賦值為6，不能分泌生長素且無頡頏活性，大田防效為5.02%，表現相對較差。導致生防菌在溫室及大田防效結果的差異，可能由于大田實驗更接近自然狀態，受溫度、濕度、紫外線照射等多重因素的影響，復雜程度遠遠高于理想的溫室條件。本研究中生防菌株HWY-3-1在大田防效實驗中表現較好，可能與所選菌株的有效定殖或者引入菌株生態位的競爭選擇有關。

一些具有生防潛力的菌株，不僅能夠有效防治植物病害，還可作為植物根際促生菌促進植物生長發育。如芽孢桿菌屬的生防菌能夠顯著增加辣椒、番茄等作物的株高、莖粗、生物量和干重等生理指標[24]。本研究發現，HWY-3-1和HWS-4-3菌株處理后的木薯基部莖粗、薯塊數均顯著高于其他菌株，且HWY-3-1菌株處理后的木薯株高、最大薯塊直徑和單株薯塊重均顯著高于對照。由此可以推測，HWY-3-1和HWS-4-3菌株對木薯植株具有一定的促生作用。有研究指出，用不同濃度的生防菌對植物進行處理發現，濃度不同對植物生長的影響也不相同[25]。其他生防菌雖然表現出生防潛力，且在平板實驗中也檢測到較高濃度的生長素，但對木薯的促生作用差異不顯著，可能是受接種濃度的影響。因此在對生防菌的防效進行深入研究時，還需要對此類生防菌的施用濃度也作進一步的研究，才能夠更好地發揮其生防作用[26]。

本研究優選的3個生防菌株在木薯3個部位的定殖量為：根表土>葉片>嫩莖，且均表現出良好的定殖特性。這一研究結果與前人[27-28]研究報道一致。因此，分離生防菌的優選場所為植物根表土和葉片，且從根表土中分離的生防菌株其防效更持久、更穩定[23]。在本研究中，根表土中的活菌數量均呈先上升后下降，最后趨于穩定的變化趨勢，主要由于土壤自身的抑菌作用[29]導致進入土壤中的生防菌活菌數量急劇下降；隨后菌株在土壤中逐漸擴展、繁殖與土著微生物競爭并存，60 d后其活菌數量穩定在1.60×103～1.00×105CFU/g之間。而在嫩莖和葉片中，各菌株的定殖量、變化趨勢與根表土各不相同。在木薯的嫩莖和葉片中，優選菌株的定殖量在第1～7天基本呈上升趨勢，在第7～15天達到最大值后開始下降，最后又趨于穩定。造成這種差異的主要原因可能是由于植物自身的一些特性引起的，如流動性、特定宿主、特定部位等[30]。

菌株HWY-3-1在木薯體內表現出較好的定殖特性，定殖量均高于其他2個菌株，在溫室[7]及大田防效測定過程中也表現出良好的生防效果。HWS-4-3平板頡頏效果最好，但在溫室、大田防效及定殖特性方面表現一般；DBS-5綜合賦值為6，溫室防效高于70%，但田間防效較差，定殖量在3個菌株中表現最弱。各菌株表現出不同的生防效果和定殖特性，這與菌株的生長特性、環境條件及生態位有很大的關系[31]。在平板檢測表現好的菌株在溫室及大田推廣應用中效果不一定好，這與菌株的生活特性、周圍生態環境等因素有直接的關系，從而直接影響其生防效能[7, 11, 13]。一株優良菌株從篩選到田間推廣應用，期間受到諸多因素的影響，最終能經受自然篩選仍具有抗性的菌株才具有推廣價值，才能更好地應用于農業生產，因此其是否具備大田防效尤為重要。通過對3個芽孢桿菌在木薯不同部位的菌株定殖量及消長動態變化進行研究，對了解這些菌株的殘效、指導田間防治以及研究生防菌株的作用機理具有一定的指導意義。

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Colonization Ability and Growth-Promoting Effects of Five Biocontrol Bacteria, and the Biocontrol Potential Against Cassava Bacterial Blight

WU Jinshan1,2, WANG Siqi1, HUANG Jiaquan1, JIA Yingxue2, CHEN Yinhua1*

1. College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 2. College of Forestry, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China

Biocontrol is effective for cassava disease prevention and control. The screening and colonization ability of biocontrol strains are directly related to the stability of stain resistance and the effects of controlling cassava bacterial blight (CBB). Based on the preliminary screening of strains in the field and the determination experiment of control effects in greenhouse, five biocontrol strains were selected under comprehensive evaluation to probe into the biocontrol potential in the field. Moreover, bacteria’s effects on the growth indexes of cassava were analyzed. The strains with good control and growth-promoting effects were screened. Their colonization ability and dynamic changes in different parts of cassava were studied, thus to provide data reference for screening biocontrol bacteria for CBB control and offer theoretical support for the future R & D of biocontrol agents. The results showed that HWY-3-1 topped the five biocontrol strains for control effect, with an average control effect of 61.35%. DBS-5 was the lowest, with a 5.02% control effect. The control effect of the other three strains HWS-4-3, HS-4-7 and HNR-3-7 was 45.02%, 19.09% and 24.08%, respectively. Compared with the control group, the five strains showed different growth-promoting effects on cassava. Physiological characteristics, such as height, maximum tuber diameter and tuber weight per plant, of cassava treated with HWY-3-1 strain were significantly higher than those treated with other strains. The basal stem diameter and tuber number of cassava treated with HWY-3-1 and HWS-4-3 strains were significantly larger than those treated with other strains. Comprehensive comparison revealed that HWY-3-1, HWS-4-3 and DBS-5 stains had better control and growth-promoting effects. The three strains could colonize stably after inoculation in three parts of cassava, with HWY-3-1 having the strongest colonization ability. The amount of colonized bacteria in root topsoil was significantly higher than that in leaves, and that in young stems was the least. The number of living bacteria after colonization first grew, then fell, and finally plateaued out.

cassava bacterial blight; biocontrol bacteria; anticipatory effect; physiological characteristics; colonization characteristics

S435.33；S476.1

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.09.016

2022-01-28；

2022-05-10

國家現代木薯產業技術體系項目（No. CARS-11-HNCYH）；國家重點研發計劃項目（No. 2018YFD1000500）。

吳金山（1984—）男，博士研究生，副教授，研究方向：植物生態。*通信作者（Corresponding author）：陳銀華（CHEN Yinhua），E-mail：yhchen@hainanu.edu.cn。