核因子NF-κB抑制劑PDTC對膠質瘤干細胞放療增敏的效用研究

鄧慶芬 劉曉麗 周玉璞

膠質瘤干細胞具有侵襲性、成瘤性強的雙重特點，同時對放療、化療存在較明顯的抵抗性。核因子-κB(NF-κB)為誘導性轉錄因子，是主要的細胞存活通路，在人體多種生理活動中發揮重要作用，還可以抑制腫瘤細胞凋亡[1-2]。有報道顯示[3-4]，放射治療后NF-κB通路可發揮抑制放射治療誘導的細胞凋亡，進而在膠質瘤干細胞中放化療抵抗中起到關鍵性作用。但目前相關研究較少，故本研究觀察核因子-κB(NF-κB)抑制劑四氫化吡咯二硫代氨基甲酸酯(PDTC)對放射治療誘導的膠質瘤干細胞凋亡的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

膠質瘤干細胞3#(購于中國科學院昆明動物研究所)，PDTC購自上海碧云天公司。人小腦膠質細胞HAC(通派(上海)生物科技有限公司)、溶劑DMSO(Sigma，美國)，FBS(Gibco，美國)，雙抗(100 X)P/S(上海碧云天公司)，Trypsin(Abcam，中國)，Phosphate緩沖液(南京森貝伽生物科技有限公司)，MTS比色試劑盒(上海宸功生物技術有限公司)，液體DMEM/F-12(上海澤葉生物科技有限公司)，Triton X-100(上海信裕生物科技有限公司)，Annexin V-FITC(杭州昊鑫生物科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 膠質瘤干細胞的培養 以1∶150 的比例用PBS稀釋后以2.5 mL/6cm皿的比例鋪板，4～8 h后將PBS吸出，將長至3/4 左右密度的膠質瘤干細胞3#細胞消化后用5倍體積的DMEM/F-12停止消化；離心后分離收集膠質瘤干細胞3#，用干細胞培養液重懸細胞后傳入鋪有laminin的6 cm器皿中，待細胞狀態良好時開始實驗(48～72 h 后)[5]。正常人小腦膠質細胞，無需鋪laminin，0.25% Trypsin 消化后，應用常規培養基培養。

1.2.2 總RNA提取、反轉錄和PCR反應 細胞中加入Trizol(上海源葉生物科技有限公司)進行冰上裂解，然后依次進行萃取、沉淀RNA、乙醇清洗等提取細胞總RNA。按照反轉錄試劑盒(美國Thermo Scientific)的說明書進行操作，反轉錄為cDNA。之后加入SYBR Green Realtime PCR Master Mix(日本ToYoBo)和相應的上下游引物，放入Real-time PCR儀中，根據說明書要求設置相應反應條件。反應結束后，參考2-△△Ct方法計算研究數據。

1.2.3 X線照射 將細胞放在Rad Source RS2000pro 生物學X射線輻照儀樣品箱中，常用照射劑量率為1 Gy/min，按照本研究所需要照射劑量(8 Gy)設置照射時間。照射結束后常規換液，將細胞放在培養箱中繼續培養48 h。

1.2.4 分組 將細胞分成C組(加二甲基亞砜30 μmol/L)、PDTC組(30 μmol/L，加PDTC)、放療組(8 Gy，加二甲基亞砜30 μmol/L)和PDTC聯合放療組。每組均加入相應PDTC或二甲基亞砜預處理2 h后進行8 Gy的放射線照射，培養結束后收集細胞進行觀察指標的測定。

1.2.5 Western blot蛋白濃度檢測 采用聚丙烯酰氨凝膠電泳法進行NF-κB蛋白測定，電泳實驗結束后，采用200 mA恒流轉膜，將NF-κB蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，室溫下，采用5%脫脂奶粉對膜封閉60 min，孵育相應一抗(1∶500)4 ℃ 12 h。洗滌后加入對應的二抗(1∶2000)孵育60 min。洗滌后在無光條件下采取增強化學發光法進行顯色[6]。

1.2.6 細胞凋亡檢測 對所有細胞進行2次洗滌。加入200～500 μL的緩沖液重懸細胞，然后避光條件下加入2∶1的LAnnexin與PI充分混勻，開始凋亡染色，室溫條件下，避光孵育15 min，流式細胞儀上機檢測[7]。

1.3 統計學處理

數據采用SPSS 20.0軟件分析，實驗結果用LSD-t檢驗對各組結果進行對比，當P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 放療對膠質瘤干細胞中NF-κB蛋白表達影響

X線照射后，膠質瘤干細胞中NF-κB蛋白表達明顯增加，與C組比較差異有顯著性(P<0.05)；而PDTC可下調NF-κB蛋白表達，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 放療對膠質瘤干細胞中NF-κB蛋白表達影響

2.2 PDTC聯合放療對膠質瘤干細胞凋亡的影響

PDTC組、放療組和聯合組的膠質瘤干細胞凋亡率與C組比較，依次半圓(1.50±0.16)倍、(2.48±0.15)倍、(6.55±0.24)倍，表明PDTC聯合放療時膠質瘤干細胞凋亡明顯增加。各組膠質瘤干細胞凋亡率見圖1。

圖1 PDTC聯合放療對膠質瘤干細胞凋亡的影響

3 討論

膠質瘤干細胞具有兩大特點，一是無限的增殖能力，二是持續的自我更新能力。不僅如此，膠質瘤干細胞還與膠質瘤的復發、轉移及抗藥有關[8-9]，為此，針對膠質瘤干細胞的藥物治療，越來越多的學者認可其可能成為膠質瘤治療新途徑[10-11]。報道顯示[12]，活化的NF-κB是同膠質母細胞瘤相關的重要轉錄因子之一，可通過抑制細胞凋亡、侵襲、免疫和炎癥激活等作用在腫瘤的發生、轉移中起促進作用。以往有報道顯示[13-15]，NF-κB活化與膠質瘤級別和惡性程度存在一定的相關性，并且與膠質瘤患者的預后存在緊密的聯系。

本研究顯示，X線照射后，膠質瘤干細胞中NF-κB蛋白表達明顯增加，與C組差異有顯著性(P<0.05)。表明放療后膠質瘤干細胞中NF-κB通路被活化。同時結果還發現與C組比較，PDTC組NF-κB蛋白表達下降，與PDTC組比較，放療組NF-κB蛋白表達增加，與放療組比較，聯合組NF-κB蛋白表達下降。表明加入NF-κB通路抑制劑后可下調NF-κB蛋白表達。細胞凋亡情況顯示，PDTC組、放療組和聯合組的膠質瘤干細胞凋亡率均較C組增加顯著，且聯合組增加更加顯著。表明膠質瘤干細胞X線照射后細胞凋亡率明顯增加，而聯合PDTC后膠質瘤干細胞凋亡明顯增加，進一步表明PDTC對膠質瘤干細胞放療有增加其敏感性的作用。

綜上所述，NF-κB通路在膠質瘤干細胞的放射治療中具有重要作用，并可以作為對膠質瘤干細胞放療增加敏感性的重要靶點。但本研究尚存在一定不足，如NF-κB通路在機體生理過程中作用廣泛，在多種生理過程中發揮作用，而本研究未對PDTC抑制NF-κB通路的具體機制進行深入研究，故未來應對其具體作用機制進行深入研究。