不同溫度貯藏過程中鮸魚品質及生物胺的變化研究

吳玉婷，謝超，周卓穎，李遠慧，朱亞猛，史恬恬，王益男

（1.浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江 舟山 316022；2.浙江馳力科技股份有限公司，浙江 舟山 316000）

鮸魚屬鱸形目石首魚科，通體銀灰色，常被稱作米魚。這種魚類主要生活在溫暖的水域，是底層洄游性魚類。舟山東海中鮸魚分布較多捕獲量巨大，資源豐富。研究發現，鮸魚有食補效果，具有補血、消炎、潤肺等作用。鮸魚肉是一種高蛋白低脂的肉類，且含有20種以上的不飽和脂肪酸，其中，棕櫚油酸、丁酸、油酸含量較高。除此之外，鮸魚肉中含有幾種對人體有益的微量元素，其中K、Mg、Ca含量較多。因此鮸魚具有極高的營養價值，既適合減脂健身的人群，還有益于缺鐵性貧血和肝臟有炎癥的人群。現階段對鮸魚多采用冷藏、冰塊保鮮的簡單處理，魚肉品質判斷的一個重要指標是生物胺的產生狀況，目前關于鮸魚中生物胺的研究較少。

生物胺由氨基酸脫羧而成，一般分為脂肪族、芳香族和雜環類胺，也可分為單胺和多胺類。常見的組胺和色胺屬于單胺類物質，而尸胺和腐胺為多胺類物質。過量生物胺的攝入會使人中毒，情況較輕的產生頭痛、嘔吐等，情況嚴重的可能引起神經毒性。所以，對魚類貯運過程中生物胺的形成及含量進行研究是有必要的。

該研究以舟山鮸魚作為試驗材料，探究25℃和4℃條件下鮸魚品質及生物胺的變化，包括pH值、菌落總數（total bacterial count，TVC）、滴水損失率、揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）和幾種常見生物胺含量變化趨勢以及生物胺在魚肉中的分布規律，以期為鮸魚等水產品中生物胺形成機理的深入研究及如何控制生物胺從而延長鮸魚保藏期提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鮸魚：舟山市普陀昌津水產有限公司。

丙酮、氧化鎂（均為分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；鹽酸標準溶液（分析純）：以達科技（泉州）有限公司；硼酸（分析純）：吉安市豪邁精細化工實業有限公司；氯化鈉（分析純）：上海博微生物科技有限公司；腐胺、尸胺、酪胺、組胺、丹黃酰氯（均為色譜純）：美國sigma公司；正己烷、乙醚、正丁醇、氯仿、谷氨酸鈉、三氯乙酸、氫氧化鈉（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、丙酮（均為色譜純）：美國Fisher Chomical公司。

從鮸魚背部切取5 cm×3 cm×2 cm的長方塊肉，將所有的方塊肉平均分成對照組和試驗組。對照組：75%酒精涂抹表面來減少魚表面細菌；試驗組：不做特殊處理。魚塊按照在魚身的位置分為3個部分，最外層標記為外；中間層記為中；最里層則記為內。在指標測定試驗中，選取同一區域的魚肉，大小同上述，一組在4℃貯藏12 d，另一組在25℃中貯藏24 h。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（LC-2030）：日本島津公司；高速均質器（FSH-2A）：上海帥登儀器有限公司；針頭微孔濾膜過濾器（0.22 μm）：上海佩歐生物科技有限公司；pH計（PHS-3E）；上海儀電科學儀器股份有限公司；超凈工作臺（SW-CJ-IFD型）：廣東省醫療器械廠；色譜柱（SB-C18，250 mm×4.6 mm，孔徑 100 ?，粒徑 5 μm）：安捷倫儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

參考郭慧等、韓笑的丹黃酰氯衍生法處理樣品。取5.00 g不同部位魚肉泥，加入15 mL10%三氯乙酸溶液，充分振蕩，5 000 r/min離心10 min，取上清液用三氯乙酸稀釋至50 mL。取10 mL上述所得濾液，加入氯化鈉至飽和，再加入5 mL正己烷，振蕩5 min，靜置。取下層溶液用NaOH將pH值調至12.0，吸取5 mL溶液后加入同體積正丁醇、氯仿溶液，取上層溶液滴加0.2mL 1mol/L的HCl，加入2mL 0.1mol/L HCl溶液。然后加入1mL 10 mg/mL丹磺酰氯溶液、1 mL飽和NaHCO溶液和0.1 mL 2 mol/LNaOH溶液，60℃水浴0.5 h后加入0.2 mL 50 g/L谷氨酸鈉溶液，繼續60℃水浴15 min，用氮氣除去丙酮，再加入0.5 g氯化鈉、1 mL水和3 mL乙醚。取下層溶液加入1 mL乙腈，最后用0.22 μm微孔濾膜針頭濾器，注于進樣瓶。生物胺標準溶液測定方法同上。

1.3.2 pH值的測定

取3 g絞碎均勻的魚肉，加入30 mL蒸餾水，均質后過濾，pH計直接測定濾液pH值。

1.3.3 滴水損失率的測定

取35.0 g魚肉，記為第一次魚肉質量。將魚肉置于膨脹的保鮮袋，用塑料線打結后懸空放在4℃冷藏環境下至24 h。取出后瀝干測定第二次魚肉質量。滴水損失率計算公式如下。

式中：w為滴水損失率，%；m為第一次測定魚肉質量，g；m為第二次測定魚肉質量，g。

1.3.4 菌落總數的測定

菌落總數參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準菌落總數測定》中的方法測定。

1.3.5 揮發性鹽基氮含量的測定

揮發性鹽基氮含量參考GB 5009.228—2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》中方法，使用自動凱氏定氮儀測定。

1.3.6 生物胺含量的測定

魚類水產品中得到的生物胺多種多樣，屬尸胺、腐胺、組胺、酪胺較為普遍，這幾種生物胺含量能夠有效體現魚肉新鮮程度且易檢測，所以試驗測定上述4種生物胺含量變化來判斷魚肉在貯藏期間生物胺產生情況。洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

生物胺含量計算公式如下。

式中：X為被測樣品中生物胺的含量，mg/kg；c為進樣液中生物胺的含量，mg/L；n為稀釋倍數；V為被測樣品溶液體積，mL；m為樣品總質量，g。

1.4 數據分析

利用Excel 2010與OriginPro 9.1整合各數據。

2 結果與討論

2.1 鮸魚肉pH值變化

25℃和4℃貯藏的鮸魚肉pH值變化見圖1。

圖1 25℃和4℃貯藏的鮸魚肉pH值變化Fig.1 pH changes in Miichthys miiuy meat stored at 25℃and 4℃

由圖1可知，魚肉初始pH值為6.64，在25℃貯藏條件下，魚肉pH值整體呈上升趨勢，先平緩上升再快速上升，然后又出現了平緩的變化最終達到7.43；在4℃貯藏條件下，魚肉的pH值同樣呈上升趨勢，在貯藏12 d時達7.50。水產品在貯藏過程中會發生一些生化反應。新鮮鮸魚平均pH值在7.10，在死亡后會經歷僵直、自溶、腐敗3個階段，期間會發生各種生化反應，所以魚肉pH值會不斷發生變化。在僵直階段，反應物腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、磷酸肌酸通過生化反應得到的生成物為磷酸，糖酵解得到生成物為乳酸，這些生成物均會使魚肉酸性增加。在魚體自溶階段，在內源性蛋白酶水解蛋白質氨基酸等含氮化合物和外源微生物共同作用下，魚體會產生胺類等堿性物質，使魚肉堿性增強。故在鮸魚死后魚肉的pH值應呈現先下降后上升的變化趨勢，而試驗中pH值沒有下降階段，表明魚肉在測定pH值時已過僵直期，除此之外，25℃下的魚肉可能是因為前期有酸性物質的生成減緩了pH值上升的速度。從pH值變化來看，兩個溫度貯藏過程中魚肉均經歷了自溶到腐敗的過程，其中4℃冷藏可能通過降低微生物活性和酶活來減緩該過程。

2.2 鮸魚肉滴水損失變化

導致魚肉滴水損失變化的原因多種多樣，如環境酸堿度和酶水解等作用。隨著貯藏時間的延長，蛋白質、脂質在自身酶的作用和微生物的共同作用下發生水解反應，使得魚肉組織結構松散，肌間蛋白截留水分能力下降，自由水含量升高，導致魚肉汁液流失，加速魚肉變質。25℃和4℃貯藏的鮸魚肉滴水損失變化見圖2。

圖2 25℃和4℃貯藏的鮸魚肉滴水損失變化Fig.2 Changes in water content of Miichthys miiuy meat stored at 25℃and 4℃

由圖2可知，在貯藏初期，兩個溫度貯藏條件下酶和微生物共同作用導致魚肉肌肉持水性下降，使得鮸魚魚肉滴水損失率產生較大變化。25℃貯藏24 h后鮸魚肉滴水損失達到4.83%，而4℃下的魚肉貯藏12 d后滴水損失率達到4.69%。這說明4℃貯藏能有效延緩魚肉組織結構松散，從而延緩魚肉汁液流失。

2.3 鮸魚肉菌落總數變化

魚肉中微生物含量可以直觀表明魚肉新鮮程度。25℃和4℃貯藏的鮸魚肉TVC變化見圖3。

圖3 25℃和4℃貯藏的鮸魚肉TVC變化Fig.3 TVC changes in Miichthys miiuy meat stored at 25℃ and 4℃

如圖3所示，在25℃和4℃貯藏條件下鮸魚肉的初始 TVC 分別為 4.57 lg（CFU/g）和 4.49 lg（CFU/g），屬于品質狀態較佳的新鮮魚肉，整個試驗周期中，兩者TVC整體均呈現上升趨勢，25℃下的魚肉TVC于貯藏終點達到 7.03lg（CFU/g），而 4℃下的則為 7.11lg（CFU/g）。微生物的生長和繁殖會分解魚肉中的蛋白質，生成氨基酸等小分子物質，同時使得蛋白組織結構松散，試驗過程中pH值、滴水損失率和TVC均呈現不斷上升的趨勢驗證了這一理論。這說明4℃貯藏能有效延緩魚肉中微生物的生長繁殖，延緩微生物對魚肉的分解利用，從而延緩魚肉品質劣變。

2.4 鮸魚肉TVB-N變化

貯藏過程中，細菌不斷代謝增殖，利用含氮化合物產生大量硫化物和三甲胺，產生的這些物質為腐敗氣味的主要來源。25℃和4℃貯藏的鮸魚肉TVB-N變化見圖4。

圖4 25℃和4℃貯藏的鮸魚肉TVB-N變化Fig.4 Changes in TVB-N of Miichthys miiuy meat stored at 25℃and 4℃

由圖4可知，兩個溫度貯藏期間TVB-N初始分別為10.13mg/100g和10.24mg/100g。新鮮魚的揮發性鹽基氮一般在30 mg/100 g內，而試驗對象初始值明顯小于該值，表明魚處于非常新鮮的范圍。在試驗貯藏期末，25℃條件下貯藏24h的TVB-N上升至36.53mg/100g，超過了新鮮魚的TVB-N范圍，而4℃條件下在貯藏9 d時才超過了30 mg/100 g，達到31.74 mg/100 g。從兩者對比結果來看，低溫環境通過抑制酶活抑制了微生物生長速度，從而很大程度上降低了TVB-N上升速率。

2.5 生物胺標準樣品回歸方程

生物胺回歸方程以及適用區域見表2。

表2 標準品線性回歸方程及適用區域Table 2 Linear regression equation and scope of use

2.6 鮸魚肉中生物胺含量變化

影響水產品生物胺形成量的因素有很多，包括水產品種類、微生物種類和貯藏環境條件，所以各類水產品在不同溫度條件下貯藏會產生的生物胺不一。25℃和4℃下鮸魚肉生物胺含量的變化分別見圖5和圖6。

圖5 25℃下鮸魚肉生物胺含量的變化Fig.5 Changes in biogenic amine content in Miichthys miiuy meat at 25℃

圖6 4℃下鮸魚肉生物胺含量的變化Fig.6 Changes in biogenic amine content in Miichthys miiuy meat at 4℃

由圖5可知，在25℃貯藏條件下，4種生物胺均呈現逐漸上升的趨勢，整體趨勢一致，但各增長速率有所不同，尸胺產生速率最快，而腐胺和組胺的產生速率相差不多，酪胺的生成速率最慢。在25℃貯藏條件下，4種生物胺在0～6 h時含量幾乎為0，12 h后4種生物胺含量明顯增加且出現不同程度的上升，其中增長最快的尸胺含量在24 h時達到了35.71 mg/kg，腐胺和組胺最終分別達到了22.54 mg/kg和21.48 mg/kg。酪胺含量最終僅有9.09 mg/kg。

由圖6可知，在4℃條件下，0～3 d內4種生物胺含量少且未出現明顯差別。與25℃貯藏相比，組胺大幅度上升，在12 d時達到了41.78 mg/kg，腐胺和尸胺含量的增長速率相差不多，酪胺仍增長最慢，0～12 d中未超過10 mg/kg，最終達到9.01 mg/kg。魚肉表面微生物生長繁殖過程中利用氨基酸脫羧酶分解魚肉中組氨酸、酪氨酸等氨基酸來產生生物胺，使得魚肉表面生物胺含量大幅上升，隨著貯藏時間的延長，中間層和內層魚肉中的氨基酸也會被脫羧生成生物胺。而不同種類的細菌生長繁殖能力和所含的脫羧酶種類不同，因此各類生物胺產生的多少與快慢均有所區別。從圖5和圖6的趨勢來看，4℃低溫抑制了微生物生長，使生物胺的產生速率下降。與pH值、TVC值、TVBN和水分含量相結合分析，魚肉在貯藏初期為較新鮮魚肉，與生物胺含量所表明結果一致，高水分為微生物提供了合適的生長環境，因此TVC持續上升，含氮化合物產生堿性物質的生化反應隨之增加，所以揮發性鹽基氮含量和pH值也會隨之上升。綜上所述，鮸魚肉中生物胺主要源于魚肉表面微生物作用。

2.7 鮸魚肉中生物胺分布情況

25℃貯藏條件下鮸魚各部分生物胺含量見圖7。

圖7 25℃貯藏條件下鮸魚各部分生物胺含量Fig.7 Biogenic amine content of Miichthys miiuy meat at different positions under storage at 25℃

由圖7可知，魚肉從外到內，兩組的生物胺含量均呈現逐漸降低趨勢。這說明生物胺主要產生于外層，且主要原因并非內源酶作用。除此之外，試驗組生物胺三層肌肉生物胺含量都明顯大于對照組。25℃貯藏條件下，試驗組生物胺含量從外到內依次為90.45、32.20、7.78 mg/kg，而對照組的生物胺含量分別為12.87、7.44、5.01 mg/kg。

4℃貯藏條件下鮸魚各部位生物胺含量見圖8。

圖8 4℃貯藏條件下鮸魚各部位生物胺含量Fig.8 Biogenic amine content of Miichthys miiuy meat at different positions under storage at 4℃

由圖8可知，4℃貯藏條件下，試驗組生物胺含量從外到內依次為 101.59、35.32、18.39 mg/kg，而對照組的生物胺含量分別為26.39、8.10、2.00 mg/kg。對照組經過75%酒精擦拭處理，而試驗組是在無特殊處理情況下測定。

25℃和4℃貯藏條件下的生物胺含量及分布均說明酒精抑制了魚肉表明微生物的生長繁殖，因此可以得出，魚肉中生物胺主要來源于魚表面微生物的生長代謝。楊珊珊等也認為大多數的生物胺是由外源微生物中的氨基酸脫羧酶催化氨基酸等物質發生脫羧等一系列反應而產生的，少數生物胺由內源性的脫羧酶催化產生。

3 結論

研究表明在25℃和4℃貯藏條件下，鮸魚肉pH值、滴水損失率、菌落總數、TVB-N和生物胺含量均呈現不斷上升的趨勢。鮸魚肉的pH值均呈現逐漸上升的趨勢，25℃下貯藏24 h上升至7.43，而4℃冷藏條件下貯藏12 d pH值達到7.50；25℃條件下貯藏終點TVB-N上升至36.53 mg/100 g，超過新鮮魚的TVB-N范圍，而4℃條件下在貯藏9d時才超過了30 mg/100 g，達到31.74 mg/100 g。不同溫度下貯藏末期鮸魚肉外層生物胺含量均顯著高于其他部位，結合酒精擦拭表面試驗表明生物胺的產生絕大部分來自于外源微生物的作用。以上研究結果為水產品中的生物胺產生機制的深入研究和如何控制生物胺延長鮸魚保藏期奠定了一定的基礎。