三聯益生菌復合發酵枸杞泡騰片的工藝優化及質量檢測

李月嬋，操俊，莊林，王佳麗，張同存，詹永成，羅學剛*

（1.天津科技大學生物工程學院工業發酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業微生物重點實驗室，天津 300457；2.天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心，天津 300457；3.寧夏杞果兄弟生物科技有限公司，寧夏中衛 755000）

枸杞子是茄科枸杞屬植物枸杞（Lycium barbarum L）的干燥果實。枸杞子作為常見的藥食同源食材，在我國已有2 000多年的食用歷史。《本草綱目》記載“枸杞能補腎潤肺，生精益氣，此乃平補之藥，所謂精不足者補之以味也”。研究表明，枸杞含有豐富的枸杞多糖、甜菜堿、抗壞血酸及多種微量元素，具有抗衰老、抗腫瘤、降血脂、降血糖、降血尿酸等功效。但是，目前市面上現代化枸杞深加工產品的種類不夠豐富。

益生菌又稱有益菌，主要定植在人體的口腔、皮膚、陰道和腸道環境中。自第一株益生菌被成功分離以來，其賦予宿主的益生效果引起了科學界的廣泛關注。而且，益生菌發酵在改善果蔬等食材風味、促進營養物質轉化與吸收等方面，同樣有著重要的作用。本課題組前期已對枸杞發酵飲料的工藝進行了優化研究，并建立了枸杞與胡蘿卜、牛乳等的復合發酵飲料等制備工藝。但發酵飲料在運輸、銷售等過程中的冷鏈物流可導致總成本偏高，往往需要通過改善包裝方式或改變飲品形式等手段降低其儲運成本。相對于液體飲料來說，固體飲料由于其體積小、易于運輸與攜帶等特點，發展相當迅速。

泡騰片是國內外日益流行的一種較為新穎的片劑類型，內含酸性和堿性泡騰劑，遇水崩解時即可發生泡騰反應，生成大量二氧化碳氣體，形成澄清透明的溶液。由于泡騰片兼具固體飲料和液體飲料的優點，體積小，便于保存和運輸，適合現代化生活的快節奏，因此深受消費者的青睞。然而，關于益生菌發酵枸杞泡騰片的研究，目前國內外少見報道。為此，本研究在前期工作基礎上，對三聯益生菌發酵后的枸杞原漿進行冷凍干燥處理，結合感官評價優化輔料組分，開發一種風味獨特、口感優良的發酵枸杞泡騰片，為其他藥食同源成分泡騰片的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CGMCC8198、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）LTJ28、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）YR2-2：天津科技大學微生態與分子藥理研究室-80℃保存。

1.1.2 試劑

枸杞原漿（食品級）：寧夏杞果兄弟生物科技有限公司；碳酸氫鈉（分析純）：中英保健食品有限公司；檸檬酸（分析純）：濰坊英軒實業有限公司；乳糖（分析純）：浙江一諾生物科技有限公司；甜菊糖苷（分析純）：曲阜香州甜菊制品有限公司；聚乙二醇6000、木糖醇（均為分析純）：天津泰進科技有限公司；濃縮乳清蛋白（分析純）：天津市江天化工有限公司；殼寡糖（分析純）：廣州優藍海洋生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

4R2204 CN型電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；TG16B型高速臺式離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；LRH-150型生化培養箱：上海齊欣科學儀器有限公司、DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：上海東璽制冷儀器設備有限公司；PSSJ-4V型精密pH計：上海精密科學儀器公司；HCB-900V型垂直層流潔凈工作臺：海爾集團控股有限公司；Alpha 2-4 LD plus快速冷凍干燥機：德國Christ公司；DGG-9070BD型電熱鼓風干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；ZP-9型旋轉式壓片機：廣州大祥電子機械設備有限公司；SY-3D型片劑四用測定儀：上海黃海藥檢儀器有限公司。

1.3 發酵枸杞泡騰片的工藝優化

1.3.1 工藝流程

制備工藝流程見圖1。

圖1 制備工藝流程圖Fig.1 Preparation process flow diagram

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 發酵枸杞凍干粉的制備

按照前期研究的最優發酵工藝和凍干工藝對枸杞原漿進行預處理。發酵工藝條件為枸杞原漿和飲用水的液料比為7.9∶1（mL/mL）、接種量為4%（植物乳桿菌CGMCC8198的接種量為1%、乳酸片球菌LTJ28的接種量為1%、干酪乳桿菌YR2-2的接種量為2%）、發酵時間為7.49 h、發酵溫度為37℃。凍干保護劑由濃縮乳清蛋白粉、殼寡糖和木糖醇組成，其質量分數為15%、6%及1.5%。將發酵后的枸杞原漿加入4%的保護劑，經-20℃預凍24 h，再經真空冷凍干燥機干燥12 h，過80目篩，即可得到發酵枸杞凍干粉。

1.3.2.2 制粒

參照楊梅等的研究并稍做調整，選擇檸檬酸做酸性泡騰劑、碳酸氫鈉做堿性泡騰劑、乳糖做填充劑，甜菊糖苷做矯味劑，飲用水做黏合劑、聚乙二醇6000做潤滑劑。將凍干粉、矯味劑和填充劑分別與酸性泡騰劑和堿性泡騰劑混合制備軟材，軟材需滿足“手握成團，輕壓即散”的標準。將酸性與堿性軟材分別過14目篩制備酸粒和堿粒，并于37℃電熱鼓風干燥箱烘干30 min。

1.3.2.3 壓片

將烘干后的酸粒和堿粒混合均勻，加入適量潤滑劑放置于旋轉壓片機壓片成型。

1.3.3 發酵枸杞泡騰片的感官評定標準

分別取5 g泡騰片樣品，加入25℃飲用水100 mL，待完全溶解后，由食品專業相關人員組成感官評定小組，分別從香氣、口感、狀態3個方面對泡騰片進行評分，總分100分。泡騰片感官評價標準見表1。

表1 泡騰片感官評價標準Table 1 Effervescent tablet sensory evaluation criteria

1.3.4 發酵枸杞泡騰片制備的單因素試驗

以填充劑含量7%、矯味劑含量3%、泡騰劑含量70%、泡騰劑酸堿質量比1.2∶1為基礎條件，以矯味劑含量（1%、2%、3%、4%、5%）、泡騰劑含量（60%、65%、70%、75%、80%）、泡騰劑酸堿質量比（0.8∶1、1.0∶1、1.2 ∶1、1.4 ∶1、1.6 ∶1）為變量進行單因素試驗，考察各個因素對泡騰片感官品質的影響。

1.3.5 發酵枸杞泡騰片制備的響應面設計

選取單因素試驗確定的各因素的較優值，以感官評分為響應值，采用Design-Expert.10響應面設計軟件，根據Box-Behnken Design中心試驗設計原理設計三因素三水平的試驗，具體因素水平見表2。

表2 Box-Behnken Design因素水平Table 2 Box-Behnken Design level of form factors

1.4 發酵枸杞泡騰片的質量檢測

根據《中華人民共和國藥典》2020年版中的檢測方法，對發酵枸杞泡騰片的外觀、崩解時間、pH值、重量差異、硬度和脆碎度6項指標進行檢測。

1.4.1 外觀的測定

取若干泡騰片放置于手心內，在自然光下以肉眼觀察片劑的外觀。

1.4.2 重量差異的測定

隨機選取6片泡騰片，稱量每片重量，再稱量總重量并計算平均值。

1.4.3 崩解時間的測定

對泡騰片崩解時間進行檢測，隨機抽取6片。

1.4.4 pH值的測定

用pH計測定泡騰片溶解后溶液的pH值，隨機抽取6片。

1.4.5 硬度的測定

利用片劑四用測定儀測定泡騰片硬度，隨機測定3片。

1.4.6 脆碎度的測定

利用片劑四用測定儀測定泡騰片脆碎度，隨機測定22片。

1.5 數據分析

采用GraphPad Prism 7軟件、Design-Expert.10響應面分析軟件進行數據的處理和分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 矯味劑含量對發酵枸杞泡騰片的影響

甜菊糖苷是一種以甜菊干葉為原料的食品添加劑，具有甜度高、能量低等特點，因此廣泛應用于飲料、糕點等食品加工行業。不同含量的矯味劑對泡騰片感官評分的影響見圖2。

圖2 不同含量的矯味劑對泡騰片感官評分的影響Fig.2 Effects of different contents of flavoring agents on sensory scores of effervescent tablets

由圖2可知，隨著矯味劑含量的增加，感官評分先升高再降低，這說明一定量的矯味劑可增加飲料的甜味，過多則會造成風味的不協調。當矯味劑含量為3%時，該泡騰片飲料酸甜適中，口感最佳。因此，適宜的矯味劑含量為3%。

2.1.2 泡騰劑含量對發酵枸杞泡騰片的影響

泡騰劑用量決定了泡騰片的泡騰效果、口感、溶解性等性質。當泡騰劑含量過低時，往往達不到崩解時間的要求，且碳酸含量不足可造成整體風味寡淡；泡騰劑過高又會有酸澀感，若pH值偏低也會影響口感。不同含量的泡騰劑對泡騰片感官評分的影響見圖3。

圖3 不同含量的泡騰劑對泡騰片感官評分的影響Fig.3 Effects of different contents of disintegrating agents on sensory scores of effervescent tablets

由圖3可知，隨著泡騰劑含量的增加，枸杞泡騰片的感官評分先升高后降低，在泡騰劑含量為70%時，泡騰片的感官評分最高，因此，適宜泡騰劑含量為70%。

2.1.3 泡騰劑酸堿質量比對發酵枸杞泡騰片的影響

泡騰劑包括一個酸性崩解劑和一個堿性崩解劑。由于檸檬酸成本較低，且酸味爽快可口，碳酸氫鈉溶解性較好，因此是目前應用最廣泛的泡騰劑酸源和堿源。泡騰劑不同的酸堿質量比對感官評分的影響見圖4。

圖4 不同的泡騰劑酸堿質量比對感官評分的影響Fig.4 Effects of acid-base mass ratio of different contents of disintegrating agents on the sensory scores

由圖4可知，當檸檬酸與碳酸氫鈉質量比為1.2∶1時感官評分高達53，隨著檸檬酸的增加感官評分急速下降，這可能是由于泡騰片水溶液過酸所致風味變差。因此，泡騰劑酸堿質量比為1.2∶1較為適宜。

2.2 發酵枸杞泡騰片的響應面優化分析

2.2.1 響應面優化設計

選取矯味劑含量、泡騰劑含量和泡騰劑酸堿質量比為自變量，以感官評分為因變量，設計響應面優化試驗，響應面試驗設計方案及結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Response surface test design and results

2.2.2 發酵枸杞泡騰片的感官評價模型的建立與分析

通過Design-Expert.10對表3的數據進行處理，得到發酵枸杞泡騰片感官評分與3個因素的多元二次回歸方程為Y=-1 843.55+79.575A+37.195B+838.25C+0.35AB-2.5AC-5BC-16.825A-0.233B-201.875C。模型回歸系數顯著性檢驗結果如表4所示。

表4 模型回歸系數顯著性檢驗結果Table 4 Model regression coefficient significance test results

由表4可知，模型P＜0.000 1，差異高度顯著，失擬項P＞0.05，差異不顯著，相關系數R=0.994 8，表明該模型擬合程度較好，可以對該泡騰片工藝進行預測。CV=2.34%，說明模型較可靠，SNR=28.871＞4，R=0.988 1，說明模型置信度較高。3個因素對感官評分影響的順序為B>C>A。交互作用AB對感官評分影響顯著，交互作用BC對感官評分影響高度顯著；一次項B對感官評分的影響極顯著；二次項A、B、C對感官評分的影響高度顯著。

2.2.3 交互作用分析

通過Design-Expert.10軟件對得出的試驗數據進行分析，建立了該工藝條件的模型。在保證矯味劑含量、泡騰劑含量與泡騰劑酸堿質量比這3個因素中一個因素不變的情況下，得到其他因素的三維響應面曲線和等高線。不同因素之間的交互作用的響應面曲線與等高線具體見圖5～圖7。

圖5 矯味劑含量和泡騰劑含量對感官評分影響的響應面與等高線圖Fig.5 Response surface and contour map of the influence of flavoring and effervescent on sensory score

圖6 矯味劑含量和泡騰劑酸堿質量比對感官評分影響的響應面與等高線圖Fig.6 Response surface and contour map of the influence of flavoring and effervescent acid-base mass ratio on sensory score

圖7 泡騰劑含量及其酸堿質量比對感官評分影響的響應面與等高線圖Fig.7 Response surface and contour map of the influence of effervescent and effervescent acid-base mass ratio on sensory score

響應曲面越陡以及等高線越密集，表明因素之間的交互作用越明顯。從圖5～圖7可以看出，交互作用為BC>AB>AC。說明泡騰劑含量和其酸堿質量比的交互作用對泡騰片的感官評分影響最為顯著，而矯味劑含量與泡騰劑酸堿質量比的交互作用對泡騰片的感官品質影響相對較弱。

2.2.4 驗證試驗

通過響應面分析得到最優工藝條件為矯味劑含量為2.9%、泡騰劑含量為69.1%、泡騰劑酸堿質量比為1.2∶1，在此條件下得到的感官評分預測值為66。在此條件下進行3次驗證試驗，得到的感官評分平均值為66.5，與模型預測值接近，證明該模型可靠。由此工藝得到的發酵枸杞泡騰片溶解后酸甜可口，兼具枸杞的清香和乳酸風味，為中試試驗生產應用提供了參考。

2.3 發酵枸杞泡騰片的質量檢測

2.3.1 外觀的測定結果

泡騰片表面呈橙色且色澤均勻，外觀完整光潔，無斷裂、變形現象。

2.3.2 重量差異的測定結果

為了保證食品含量的準確性，重量差異必須控制在制定范圍內，才能確保泡騰片的品質穩定性。隨機檢測發酵枸杞泡騰片，片重均為0.33 g，表明該泡騰片在重量差異這項指標上符合《中華人民共和國藥典》2020年版內的規定。

2.3.3 崩解時間的測定結果

泡騰片的崩解時間等指標檢查結果見表5。

表5 泡騰片的崩解時間、pH值及硬度檢查結果Table 5 Disintegration time，pH value and hardness test results of effervescent tablets

泡騰片的崩解時間是泡騰片品質的一個重要指標，崩解時間過長會影響泡騰片的食用性。如表5所示，枸杞泡騰片的平均崩解時間為180.83 s，符合《中華人民共和國藥典》2020年版對于泡騰片需要在5 min內崩解的標準，且泡騰后水溶液澄清，無明顯顆粒殘留。

2.3.4 pH值的測定結果

取1片泡騰片投入100 mL飲用水中，待完全溶解后用pH計測定溶液的pH值。如表5所示，隨機測定6片枸杞泡騰片，pH值均在6以下，平均pH值為5.71，相對標準偏差為3.32%。表明該泡騰片溶解后是一種弱酸性飲料，不刺激消化道，適合老人和幼兒等腸胃弱的群體。

2.3.5 硬度的測定結果

片劑的硬度指片劑抵抗進入其表面的硬物質的能力，只有具有一定的硬度，才可以確保其在儲運過程中完整無破損。如表5所示，枸杞泡騰片的平均硬度為14.5 N，符合《中華人民共和國藥典》2020年版的規定。

2.3.6 脆碎度的測定結果

泡騰片的脆碎度檢查結果見表6。

表6 泡騰片的脆碎度檢查結果Table 6 Friability test results for effervescent tablets

如表6可知，枸杞泡騰片減失質量比例小于1%，且用于檢測的泡騰片均無斷裂及粉碎情況，符合《中華人民共和國藥典》2020年版對片劑脆碎度的要求。

3 結論

本研究首先通過單因素試驗，基于發酵枸杞泡騰片的矯味劑含量、泡騰劑含量和泡騰劑酸堿質量比這3個因素對其感官品質進行研究，并利用響應面法進行Box-Behnken設計，建立發酵枸杞泡騰片的二次多項式回歸方程。運用該模型進行最優工藝條件預測，得到的最優工藝條件為矯味劑含量為2.9%、泡騰劑含量為69.1%、泡騰劑酸堿質量比為1.2∶1。在此條件下的感官評分預測值為66。對該模型進行驗證試驗，感官評分實際值為66.5，與預測值接近，因此該模型具有較強的科學性。按照《中華人民共和國藥典》2020年版的方法，進一步測定發酵枸杞泡騰片的外觀、崩解時間、pH值、重量差異、硬度和脆碎度，結果表明所制泡騰片均符合《中華人民共和國藥典》2020年版相關規定。按照本工藝生產的發酵枸杞泡騰片既有枸杞滋陰補腎和益生菌對于健康的系統性調理等功效，又具備泡騰片易溶易攜、能保持快速恢復液體產品品質的優點。此外，本品以甜菊糖苷做矯味劑，進一步滿足了消費者對于無糖健康食品的需求，具有廣闊的市場前景。