低壓靜電場對凡納濱對蝦多酚氧化酶性質影響

李甜，張珊，李孟華，吳夢蘭，段昕辰，林慧敏

（浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江 舟山 316021）

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）是我國經濟價值較高的對蝦品種之一，其肉質鮮美，營養豐富，深受消費者青睞。但捕撈失活后，凡納濱對蝦體表色素易沉著，即黑變，影響其感官品質。盡管凡納濱對蝦輕微的黑變對健康無害，但卻極大地影響了對蝦的銷售質量。對蝦的黑變是由多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）將酚類氧化生成醌類，醌類化合物與蛋白質聚合，進一步生成色素導致的[1]。蝦內源性多酚氧化酶活性變化與黑變的發展密切相關，因此，有效抑制多酚氧化酶的活性會延緩儲藏期間對蝦黑變[1]。冷凍儲藏可以防止蝦黑變，但傳統的冷凍方法可能會改變肉組織中水分的含量和分布[2]，從而導致大冰晶的形成，蝦的品質發生變化，同時解凍產品的脂質和蛋白質也會發生過度氧化[3]。這些變化可能會大大降低蝦制品的質量。因此，人們致力于開發新的冷凍方法以達到“冷凍保鮮”的目的，如高壓[4]、超聲[5]、磁場[6]、等離子體[7]和高壓靜電場[8]，但這些方法往往成本高、不方便、不穩定，短期內難以大規模應用于肉類加工。

近年來，低壓靜電場已被證明是在冷凍過程中保存食品的有效方法，該方法易于實現，適用于多種食品，且價格低廉[9]。Xie等[10]研究發現在牛扒冷凍過程中施加低壓靜電場，可以降低牛扒的汁液損失和質構損失。張珊等[11]研究發現，低壓靜電場通過抑制蝦肉中腐敗微生物的生成，使對蝦pH值與揮發性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）值、蒸煮損失率始終比對照組低，但該研究并未對蝦體內的多酚氧化酶進行研究報道。

本文以凡納濱對蝦為研究對象，通過多酚氧化酶性質，如酶活性、表面疏水性、超微量Ca2+-三磷酸腺苷酶（Ca2+-adenosine triphosphatase，Ca2+-ATPase）活性、聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrohoresis，SDS-PAGE）、圓二色譜在兩種貯藏條件下的差異性，研究微凍條件下低壓靜電場對凡納濱對蝦多酚氧化酶酶活性影響。本研究將為低壓靜電場（low voltage electrostatic field，LVEF）在對蝦冷凍貯藏中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活凡納濱對蝦，購于舟山國際水產城，保溫箱中加冰充氧，30 min內運送到實驗室，立即剔除死亡、不完整的個體后用純凈水沖洗2次，用碎冰將對蝦猝死，挑選個體差異不大、肢體完整、體表有光澤的對蝦作為研究樣品，用冰水（0℃～4℃）清洗后瀝干。

SDS-PAGE試劑盒（包括蛋白上樣緩沖液、凝膠快速配制試劑）：上海碧云天生物技術有限公司；R250考馬斯亮藍染色液：武漢谷歌生物科技有限公司；寬分子量蛋白質Marker：美國Thero Scientific公司；pH8.0的20 mmol/LTris-HCl溶液、固體硫酸銨、pH6.5磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）、左旋多巴（levodopa，L-DOPA）、溴酚藍指示劑（均為分析純）、Ca2+-ATPase活性試劑、巰基試劑盒、總蛋白試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

BX－2000型靜電場裝置：浙江馳力科技股份有限公司；Eppendorf 5425R高速冷凍離心機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PHS-25型酸度計：梅特勒托利多公司；FSH-2型可調高速勻漿機：常州國華電器有限公司；DZF-150真空冷凍干燥箱：鄭州長城科工貿有限公司；UV5900紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；JASCO-J-720CD光譜偏振儀：北京市六一儀器廠。

1.3 低壓靜電場裝置及試驗分組

低壓靜電場裝置：本試驗的靜電場裝置由靜電場發生裝置和放電板組成，其中靜電場發生裝置為AC220 V、50/60 Hz，放電板（140 mm×120 mm）在冰箱（-7℃）內產生低壓靜電場，形成負離子環境，放電板垂直放置，試驗樣品與放電板平行確保物料不與放電板直接接觸，靜電場發生裝置輸出電壓為2 500 V、電流為0.2 mA。靜電場環境模擬圖見圖1。

圖1 對蝦樣品在靜電場環境中的放置模擬圖Fig.1 Simulation of sample placement in LVEF

試驗分組：將瀝干的對蝦樣品先裝入無菌密封袋中再放入保鮮盒內，一組為在低壓靜電場條件下貯藏的處理組，即LVEF組；一組為在冰箱中貯藏的對照組（Con組），兩組樣品儲藏溫度均為-7℃。將購買蝦的當天記做試驗第0天，每4 d對蝦的各項指標取樣檢測，試驗重復兩次、每個重復中各指標分別進行3次檢測。

1.4 多酚氧化酶性質研究

1.4.1 多酚氧化酶的制備

參考López-Caballero等[12]的多酚氧化酶的制備方法并略有改動。將LVEF組和Con組的凡納濱對蝦取出，在無菌密封袋封裝條件下用流水解凍，至半解凍狀態下時，取對蝦頭部并去除頭部外殼，取出完整的腦部組織20 g，用消毒過的剪刀將腦組織剪碎成小塊肉粒，按 1∶4（g/mL）向蝦腦組織中加入80 mLpH8.0、20 mmol/LTris-HCl，充分混合后在4℃下勻漿10min，然后在冰水中靜置3h，冷凍離心25min（4℃，8000r/min），取上清液，上清液中添加固體硫酸銨，（20±2）℃下靜置30 min，當飽和度達到40%時，先進行硫酸銨鹽析24 h再用20 mmol/LTris-HCl（pH8.0）作為透析液透析12 h，透析過程中每4 h需要更換一次透析液，透析完成后冷凍離心 10 min（4℃，4 000 r/min），所得上清液即為多酚氧化酶粗液，酶液冷凍保存于-80℃冰箱中備用。

1.4.2 酶活性測定

參考Xu等[13]多酚氧化酶活性測定方法并稍作修改。在離心管中加入1.0 mL、15 mmol/L的左旋多巴及pH6.5、1.6 mL、0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液，再加入0.4 mL的酶液。充分混合后于37℃的水浴鍋中反應3 min，而后在490 nm處測吸光值。根據多酚氧化酶作用于底物釋放的物質在490 nm有最大吸光值來計算酶活性值，1 min內能轉化1 μmol底物的酶量稱為1酶單位（U），用A/（min·mL）表示。

1.4.3 總巰基含量的測定

參照試劑盒說明書測定多酚氧化酶的總巰基含量。

1.4.4 表面疏水性的測定

參考梁慧等[14]多酚氧化酶表面疏水性的測定方法進行測定，在20 μL、1 mg/mL的溴酚藍溶液中加入2 mL酶液并充分混勻。Con組直接在溴酚藍溶液加入2 mL的pH8.0、20 mmol/LTris-HCl緩沖液。在室溫（20±2）℃下充分振蕩10 min后在595 nm處測定其吸光值。表面疏水性的計算公式如下。

1.4.5 總蛋白含量的測定

參照試劑盒說明書測定總蛋白含量。

1.4.6 Ca2+-ATPase活性的測定

參照試劑盒說明書測定多酚氧化酶Ca2+-ATPase活性。以每小時每毫克蛋白中三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatase，ATPase）分解ATP所釋放的無機磷的量表示（U/mg prot）。

1.4.7 SDS-PAGE測定

多酚氧化酶首先用SDS-PAGE試劑盒中蛋白上樣緩沖液溶解（1∶1體積比混合），然后在95℃水浴下反應20 min。電泳凝膠板厚1 mm，下層膠的質量分數為12%，上層膠的質量分數為5%，每次上樣量10 μL。電泳設置的電流為80 mV，電泳時間為3 h，當樣品由上層膠進入下層膠界面后立刻將電流調至120 mV。電泳結束后，用預先配制好的0.1%考馬斯亮藍染色液在培養皿中對膠片進行染色，水平搖床染色30 min，用超純水沖洗3次后用含7%冰醋酸和5%甲醇的脫色液脫色至蛋白條帶清晰即可。

1.4.8 圓二色譜的測定

根據Zhou等[15]的方法進行圓二色譜（circular dichromatography，CD）分析。在180 nm～260 nm即遠紫外范圍內，以1 nm的帶寬和50 nm/min速度掃描18 CD光譜。每次處理后24 h內掃描0.2 mL 1.0 mg/mL PPO。所有測得的CD光譜用pH6.5、50 mL磷酸鹽緩沖液進行基線校正，PPO二級結構的含量依據Dichroweb網站的SELCON3算法來計算。

1.5 數據分析

所有樣品進行3次平行試驗，數據用Excel 2007進行處理，數據作圖采用Origin 8.5軟件。

2 結果與討論

2.1 LVEF對PPO酶活性的影響

LVEF對PPO酶活性的影響見圖2。

圖2 LVEF對PPO酶活性的影響Fig.2 Effect of LVEF on polyphenol oxidase activity

由圖2可知，兩組PPO的酶活性變化趨勢相同。隨著貯藏時間的延長，都呈先上升后降低再上升的趨勢。貯藏0～4 d時小幅度增高，4 d～12 d時Con組酶活性從92.0 A/（min·mL）降為82.3 A/（min·mL），LVEF組從91.4 A/（min·mL）降到84.7 A/（min·mL）。對蝦死亡后，體內糖原在無氧環境下發生糖酵解而產生大量酸類物質，pH值下降進而影響了PPO的酶活性[16]。12 d后，PPO酶活性逐漸回升，原因是隨貯藏時間的延長而被逐漸激活。在24 d的貯藏試驗中，除12 d外，其余貯藏時間Con組酶活性高于LVEF組，這說明LVEF能夠有效抑制PPO的活性。

2.2 LVEF對PPO總巰基的影響

LVEF對PPO總巰基含量的影響見圖3。

圖3 LVEF對PPO總巰基含量的影響Fig.3 Effect of LVEF on the content of thiol in polyphenol oxidase

巰基一般指蛋白質或多肽鏈上半胱氨酸殘基上的巰基基團，它在維持蛋白質活性和蛋白質結構的穩定上有重要作用。圖3顯示，隨著貯藏時間的延長，兩組樣品的總巰基含量整體呈下降趨勢。其中Con組PPO的總巰基含量從初始0.102 4 mmol/g prot到貯藏結束時下降到0.071 5 mmol/g prot，LVEF組的PPO的總巰基含量從初始0.102 4 mmol/g prot到貯藏結束時下降到0.021 1 mmol/g prot，分別下降了30.18%和79.39%，LVEF組的PPO的巰基含量下降更明顯。

在體內或者人工環境條件下，蛋白質或多肽鏈上巰基和二硫鍵會相互轉化，這種轉化在一定程度上反映了蛋白質高級結構的折疊和去折疊的互相轉化。由圖3可知，LVEF組樣品的巰基含量在整個貯藏過程中下降速度比Con組快，其原因可能是低壓靜電使得原本在PPO內部的活性巰基基團因蛋白酶空間折疊和去折疊構象的轉變而被暴露于表面，激化了化學反應從而導致巰基含量顯著下降[17]。Jia等[18]在用高壓靜電場（high voltage electrostatic field，HVEF）解凍豬肉時發現，HVEF組比對照組豬肉的肌原纖維蛋白的巰基含量明顯減少。這也顯示電場環境下蛋白空間構象發生改變進而使巰基含量改變。

2.3 LVEF對PPO表面疏水性的影響

蛋白表面疏水性是對蛋白質細微結構變化的一個敏感測量指標，被用于進一步評估蛋白質構象的穩定性。在LVEF條件下凡納濱對蝦PPO表面疏水性的變化如圖4所示。

圖4 LVEF對PPO表面疏水性的影響Fig.4 Effect of LVEF on the surface hydrophobicity of PPO

圖4顯示，在冷凍處理條件下，PPO分子被展開和拉伸，空間結構變得松散，因此隨著貯藏時間的延長，兩組樣品的表面疏水性均呈上升趨勢。經過24 d的貯藏，其中Con組對蝦樣品PPO表面疏水性從初始值的28.47 μg升高到 73.90 μg，而LVEF組對蝦樣品PPO表面疏水性則由初始值28.47 μg升高到85.10 μg，LVEF組升高較Con組明顯。在貯藏過程中因腐敗微生物代謝和生化反應使蛋白質變質，構象破壞，蛋白質內部的疏水基團暴露，導致疏水性增加。而LVEF組的表面疏水性上升較Con組高的原因可能是靜電場釋放O3會使得蛋白質的表面疏水性增加。

2.4 LVEF對PPO總蛋白的影響

總蛋白含量是反映蛋白質變性程度的一個重要指標。對蝦在冷凍貯藏期間，腐敗微生物代謝及生物內源酶會使對蝦體內蛋白質被逐漸分解，蛋白質的構象被破壞，因此總體蛋白含量下降。LVEF對PPO總蛋白的影響見圖5。

圖5 LVEF對PPO總蛋白的影響Fig.5 Effect of LVEF on total protein of polyphenol oxidase

圖5顯示，在24d的貯藏期間，兩組的總蛋白含量均呈下降趨勢，但Con組總蛋白含量下降速率較LVEF組更緩慢。LVEF組的總蛋白含量由初始值84.88 gprot/L降為42.48 gprot/L，Con組由84.81gprot/L降為58.87gprot/L。說明LVEF對于PPO的蛋白變性具有促進作用。貯藏20 d后，LVEF處理加速了PPO的變性，蛋白質變性成為總蛋白含量下降的主要原因，導致總蛋白呈“斷崖式”下降。

2.5 LVEF對PPO的Ca2+-ATPase活性的影響

不同貯藏方式下的PPO中Ca2+-ATPase活性差異如圖6所示。

圖6 LVEF對Ca2+-ATPase的影響Fig.6 Effect of LVEF on Ca2+-ATPase

由圖6可知，LVEF組的Ca2+-ATPase活性初始值為 0.064 2 U/mg prot，24 d 后僅為 0.022 7 U/mg prot；Con組的Ca2+-ATPase活性初始值為0.064 2U/mg prot，24 d后為0.042 8 U/mg prot。兩組在前期下降速度緩慢，但貯藏20 d時，Con組的Ca2+-ATPase下降速率較穩定，而LVEF組則下降明顯，說明貯藏后期蛋白質變性程度加劇，這與總蛋白含量的研究結果一致。Ca2+-ATPase活性可作為蛋白質的變性指標，說明了LVEF會加速PPO蛋白變性。Huang等[8]研究發現，電場可以降低酯酶的活性，維持產品的質量。

2.6 SDS-PAGE測定結果

PPO在兩種條件下貯藏的SDS-PAGE電泳結果如圖7所示。

圖7 SDS-PAGE分析結果Fig.7 SDS-PAGE analysis results

由圖7的SDS-PAGE可知，PPO分子質量約為210 kDa，這與 Nirmal等[19]結論相似。在 8、16、24 d 貯藏期間，LVEF組與Con組相比，各條帶色度和寬度均沒有出現明顯變化，即沒有觀察到PPO的降解。各組及各貯藏期間PPO分子質量都在210 kDa，說明LVEF并不是通過降解PPO蛋白分子來影響酶活性。Xie等[17]在用LVEF解凍牛肉試驗研究中也發現，LVEF不會影響蛋白分子質量。

2.7 PPO圓二色譜分析

PPO圓二色譜分析見圖8，多酚氧化酶二級結構比例見表1。

圖8 多酚氧化酶圓二色譜分析Fig.8 Circular dichroism analysis of PPO

表1 多酚氧化酶二級結構比例Table 1 Secondary structure analysis of polyphenol oxidase

圓二色譜中180 nm～260 nm的遠紫外區可以反映蛋白質主鏈構象的光活性基團的肽鍵的分布區。α-螺旋和β-折疊結構反映的是蛋白質分子的有序性，而β轉角和無規則卷曲等則體現了蛋白質分子的無序性[20]。

由圖8可知，α-螺旋、β-折疊和無規則卷曲構象的CD譜的線性疊加，兩組色譜圖均在220 nm處具有負峰，這是α-螺旋結構的特征吸收峰，說明PPO中有多種構象并存，并以α-螺旋結構為主。

由表1可知，LVEF處理后的PPO的α-螺旋及β-折疊含量減少，β-轉角及無規則卷曲含量相對增高，表明LVEF通過改變PPO的二級結構α-螺旋、β-折疊比例改變酶活性。

3 結論

本研究考察了LVEF對凡納濱對蝦PPO性質的影響。除12 d外，其余貯藏時間LVEF組PPO酶活性低于Con組，兩組樣品的總巰基、總蛋白含量和Ca2+-ATPase活性總體呈下降的趨勢，但LVEF組樣品下降更為明顯，這說明LVEF有促進PPO蛋白變性的作用；SDS-PAGE顯示PPO的分子量未發生明顯變化，這說明LVEF并不會斷裂PPO的分子鏈；CD譜和表面疏水性的檢測結果顯示LVEF可能是通過改變PPO的二級結構來影響酶的活性。試驗結果發現，LVEF在凡納濱對蝦的微凍保鮮過程中可以通過抑制PPO酶的活性延長產品貨架期，這對于對蝦的儲運銷售具有指導意義，并為對蝦產品的儲運保鮮提供了新的思路。