莓茶多酚、黃酮、黃酮醇類組分含量及抑菌分析

馮湘沅，楊琦，謝純良，成莉鳳，鄭科，劉志遠，段盛文，彭源德

（中國農業科學院麻類研究所，湖南 長沙 410205）

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和痢疾桿菌等細菌廣泛存在于自然環境中，是最常見的致病和腐敗微生物，食物一旦被這些細菌污染產生毒素，人類食用后將會引發中毒，所以在食品加工、儲藏過程中經常要用到防腐劑[1-2]，防腐劑是一種用來抑制微生物生長和繁殖的物質。目前，常用的防腐劑有苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸酯等，過量使用也會導致損害人類的身體健康。隨著我國科學技術水平的不斷提高，以安全性、綠色環保的植物提取物作為天然防腐劑得到許多研究與應用[3-4]。據文獻資料顯示，植物存在抑菌活性且促進健康作用的主要成分有多酚、黃酮、黃酮醇類物質[5-7]。因此，尋找高含量抑菌有效成分植物具有重要意義。

莓茶為葡萄科蛇葡萄屬落葉藤本植物，葉片表面分布有零星白色類似“霉”點，口感先苦、回味甘甜，藥理學研究表明其具有抗氧化、抗菌、降血糖、降血壓、護肝等作用[8]。近年來，辛敏等[9]開展了對綠茶、黃茶、白茶、青茶、紅茶、黑茶中多酚含量測定及其抑菌活性的研究，陳然等[10]分析了烏龍茶、普洱生茶、普洱熟茶等不同種類茶葉多酚及生物堿含量特點，張甜甜等[11]進行了對茅巖莓茶中黃酮類化合物提取工藝的分析，但針對莓茶相關化合物及抑菌活性研究鮮見報道。

目前常見的多酚、黃酮、黃酮醇類物質提取工藝有溶劑提取法、超聲輔助萃取法和高效液相色譜法等[12-14]，故本文對莓茶采用加入70%乙醇，超聲波輔助提取，再依次經石油醚、乙酸乙酯萃取制成的醇提萃取液以及醇提剩余后的殘渣水解液進行多酚、黃酮、黃酮醇類組分總含量測定，同時對醇提萃取液開展抑菌活性分析，旨在以莓茶開發為防腐劑及資源利用提供一定的基礎依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

莓茶：湖南省張家界農科所提供；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、痢疾桿菌（Shigella dysenteroae）：北京北納創聯生物技術研究所；沒食子酸：美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Dionex Ultimate 3000液相色譜儀、1510型全波長酶標儀：賽默飛世爾科技公司；FZ102型粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；FE28型pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ-500DB型數控超聲波儀：昆山超聲儀器有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；ZQZY-A8型恒溫振蕩培養器：上海知楚儀器有限公司；3K15型高速冷凍離心機：德國Sigma公司；R1001-VN型旋轉蒸發儀：鄭州長城科工貿有限公司；SPX-250B-Z型生化培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

1.3.1.1 醇提萃取液

莓茶經50℃烘干、粉碎后，過20目篩；準確稱取莓茶粉末5.0 g，加入150 mL 70%乙醇溶液[料液比為1 ∶30（g/mL）]，60℃恒溫超聲90min，冷卻至室溫（25℃）；之后移入離心管于9 000 r/min離心10 min，收集上清液，再經蒸發濃縮，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取、干燥（40℃）后獲得萃取物，準確稱取一定量的萃取物用40%丙酮溶液溶解，用于多酚、黃酮、黃酮醇類組分含量測定；同時將醇提萃取液分別稀釋成質量濃度為2、4、6、8、10、20 mg/mL 溶液，用于抑菌性能測定。

1.3.1.2 殘渣水解液

參照程安瑋等[15]的方法并略作修改，取醇提后剩余的殘渣干燥，精確稱重，按1∶10（g/mL）料液比加入甲醇-硫酸（體積比9∶1）混合溶液，85℃回流水解4 h，3 000 r/min離心10 min，除去沉淀，收集上清液，用于多酚、黃酮、黃酮醇類組分含量測定。

1.3.2 多酚含量的測定

參照謝倩等[16]Folin－Ciocalteu法測定。

標準品的配制：精確稱取沒食子酸2.0 mg，溶解定容于10 mL容量瓶中，配成0.2 mg/mL沒食子酸標準品溶液。并分別稀釋成 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL標準品溶液用于標準曲線測定。

標準品溶液的測定：取2 mL超純水加入0.5 mL福林酚試劑，再加入0.1 mL標準品溶液混勻，靜置3 min后加入0.9 mL 20%Na2CO3溶液，避光2 h，765 nm處測吸光度。

樣品多酚含量測定方法同標準品溶液的測定。

多酚質量濃度ρ1（mg/mL）按沒食子酸標準曲線所得的線性回歸方程進行計算；按公式（1）計算多酚含量（w1），以質量分數（mg/g）計。

式中：ρ1為多酚質量濃度，mg/mL；n為樣品稀釋倍數；v 為總體積，mL；ρ1為粉末質量，g。

1.3.3 黃酮含量的測定

參照Xu等[17]的方法并略作修改。

標準品的配制：精確稱取蘆丁10.0 mg，用甲醇溶液溶解定容于10 mL容量瓶中，配成1mg/mL蘆丁標準品溶液。并分別稀釋成 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 用于標準曲線測定。

標準品溶液的測定：取1 mL標準品溶液加入1 mL 5%NaNO2溶液混勻反應6 min，再加入1 mL 10%Al（NO3）3溶液混勻，反應6min，最后加入3mL4%NaOH溶液混勻，靜置12 min，在510 nm處測吸光度。

樣品黃酮含量測定方法同標準品溶液的測定。

黃酮質量濃度ρ2（mg/mL）按蘆丁標準曲線所得的線性回歸方程進行計算；按公式（2）計算黃酮含量（w2），以質量分數（mg/g）計。

式中：ρ2為黃酮質量濃度，mg/mL；n為樣品稀釋倍數；v為總體積，mL；m表示粉末質量，g。

1.3.4 黃酮醇類組分含量的測定

混合標準液配制：準確稱取異槲皮素2.5 mg、楊梅素 96 mg、槲皮素 1.68 mg、山奈酚 1.4 mg、異鼠李素1.2 mg，混合、甲醇溶液超聲溶解，定容至100 mL，同時將溶液濃度進行梯度稀釋，0.45 μm濾膜過濾，用于高效液相色譜檢測，并繪制標準曲線建立線性回歸方程。

取2 mL樣品用0.45 μm濾膜過濾，用于高效液相色譜檢測。

組分質量濃度ρ3（mg/mL）按組分標準曲線所得的線性回歸方程進行計算；按公式（3）計算組分含量（w3），以質量分數（mg/g）計。

式中：ρ3為組分質量濃度，mg/mL；v 為總體積，mL；m為粉末質量，g。

1.3.5 高效液相色譜法檢測條件

色譜柱為Thermo Hypersil BDS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇 ∶0.4%磷酸=55 ∶45（體積比）；紫外檢測波長為360 nm；流速為0.8 mL/min；柱溫為 25℃；進樣量為20 μL。

1.3.6 抑菌試驗

1.3.6.1 培養基配制

液態培養基：蛋白胨10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、氯化鈉10.0g/L混合，分裝，121℃高壓蒸汽滅菌20min；固態培養基：在液態培養基配方中加入瓊脂20.0 g/L，121℃滅菌20 min后，取適當體積倒入無菌平皿，冷卻，備用。

1.3.6.2 菌種活化

將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、痢疾桿菌分別接入裝有5 mL液體培養基試管中，于37℃恒溫振蕩培養器培養20 h后，再取培養液稀釋涂布于固態培養基平皿，然后將平皿倒置于37℃生化培養箱培養，直至出現菌落。

1.3.6.3 菌液制備

取1個菌落接入盛有5 mL液體培養基的試管中，搖勻，置于37℃、150 r/min恒溫振蕩培養器培養6 h后，全部倒入至盛有100 mL液體培養基的三角瓶中，繼續培養6 h后，再取6 mL接入300 mL液體培養基的三角瓶中培養12 h。采用稀釋分離法，將菌液濃度調節約為107CFU/mL。

1.3.6.4 紙片制備

將普通定性濾紙用打孔機制成直徑為6 mm圓形紙片，經121℃高壓滅菌20 min后，干燥（60℃）備用。

1.3.6.5 紙片擴散法測定抑菌透明圈直徑

在無菌條件下，取0.2 mL菌液，均勻涂布于固態培養基表面，接著用無菌鑷子夾取紙片貼于此固態培養基表面，然后取20 μL樣品放入紙片上，37℃培養18 h，觀察并準確測量透明圈直徑。同時設置CK（40%丙酮溶液）陰性、鏈霉素陽性對照。

透明圈直徑＞7 mm，判定為有抑菌效果；透明圈直徑≤7 mm，判定為無抑菌效果[18]，直徑越大抑菌效果越強。

1.3.6.6 最小抑菌濃度測定

接種培養法測定最小抑菌濃度：取0.1 mL樣品加入到盛有0.8 mL液體培養基的試管中，接入0.1 mL菌懸液，搖勻，37℃培養18 h后，觀察試管中液體培養基菌生長情況，以樣品能抑制細菌生長的最低濃度作為最小抑菌濃度，同時設置空白陰性、鏈霉素陽性對照。

1.3.7 抑菌穩定性檢測

1.3.7.1 紫外線照射時間對醇提萃取液的抑菌穩定性影響

參照羅曉東等[19]的方法進行測定。將醇提萃取液（質量濃度為20 mg/mL）于紫外燈（波長為253.7 nm）下分別照射10、20、30、60 min后，采用紙片擴散法測定其抑菌透明圈直徑。

1.3.7.2 pH值對醇提萃取液的抑菌穩定性影響

參照任先偉等[20]的方法，略作修改。用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl將醇提萃取液（質量濃度為20 mg/mL）的 pH 值分別調節為 3、5、7、9、11，采用紙片擴散法測定其抑菌透明圈直徑。

1.3.7.3 溫度對醇提萃取液的抑菌穩定性影響

參照陳佳佳等[21]的方法，略作修改。將醇提萃取液（質量濃度為 20 mg/mL）分別于 40、60、80、100、120℃條件下處理30 min后，采用紙片擴散法測定其抑菌透明圈直徑。

1.3.7.4 金屬離子對醇提萃取液的抑菌穩定性影響

參照張媛媛[22]的方法，略作修改。以醇提萃取液（質量濃度為20 mg/mL）為溶劑分別配制成0.05 mol/L的 NaCl、KCl、CaCl2、FeCl3、MgSO4溶液，靜置 3 h，采用紙片擴散法測定其抑菌透明圈直徑，并以CK（未經處理的醇提萃取液）作對照。

1.4 數據處理

試驗數據均取平均值±標準差表示，同時采用Excel 2016、Origin 2020b和SPSS 19.0軟件進行數據處理并分析。

2 結果與分析

2.1 多酚含量測定

采用Folin-Ciocalteu法對各濃度沒食子酸標準品溶液測定得到的標準曲線見圖1。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

由圖1可知，沒食子酸標準曲線線性回歸方程為y=2.975 4x+0.050 2（R2=0.999 9），其中：y為吸光度；x為沒食子酸標準品溶液濃度（mg/mL）。根據沒食子酸線性回歸方程和公式（1）計算得出表1莓茶中多酚含量。

表1 莓茶中多酚含量測定Table 1 Content of polyphenols in Mei-tea（Ampelopsis grossedentata）

由表1可知，莓茶醇提萃取液、殘渣水解液中多酚含量分別為293.38、174.84 mg/g，多酚總含量達到468.22 mg/g。

2.2 黃酮含量測定

利用Al（NO3）3顯色法對各濃度蘆丁標準品溶液測定得到的標準曲線見圖2。

圖2 蘆丁標準曲線Fig.2 Standard curve of rutin

由圖2可知，蘆丁標準曲線線性回歸方程為y=1.186 2x+0.091 1（R2=0.999 1），其中：y為吸光度；x為蘆丁標準品溶液濃度（mg/mL）。根據蘆丁線性回歸方程和公式（2）計算得出表2莓茶中黃酮含量。

表2 莓茶中黃酮含量測定Table 2 Content of flavonoids in Mei-tea（Ampelopsis grossedentata）

由表2可知，莓茶醇提萃取液、殘渣水解液中黃酮含量分別為154.13、112.05 mg/g，黃酮總含量達到266.18 mg/g。

2.3 黃酮醇類組分及含量測定

采用高效液相色譜檢測分析標準品溶液，以濃度（x，mg/mL）與檢測得到的峰面積（y）所制作的線性回歸方程分別為異槲皮素y=691.28x+0.711，R2=0.998 3；楊梅素 y=651.99x+14.635，R2=0.999 3；槲皮素 y=1 221.7x-4.216 8，R2=0.997 0；山奈酚 y=1 155.5x-3.037 9，R2=0.996 3。

通過高效液相色譜儀檢測得出的莓茶中黃酮醇類組分色譜圖見圖3，含量測定見表3。

圖3 莓茶中黃酮醇類組分色譜圖Fig.3 Chromatograms of flavonols in residue hydrolysates of Meitea（Ampelopsis grossedentata）

根據各組分線性回歸方程及公式（3）計算，對照黃酮醇類組分標準品色譜圖（圖3）分析可知，莓茶醇提萃取液、殘渣水解液中均含有異槲皮素、楊梅素、槲皮素、山奈酚等黃酮醇類組分，各組分總含量分別為異槲皮素 0.34 mg/g、楊梅素 45.14 mg/g、槲皮素 1.86 mg/g、山奈酚0.21 mg/g，兩者提取液組分含量均以楊梅素最高，其次為槲皮素，結果表明，莓茶均含有黃酮醇類物質，且各組分的含量差異明顯。

2.4 抑菌測定

通過紙片擴散法測得抑菌透明圈直徑統計結果見表4。

表4 莓茶醇提萃取液抑菌活性測定Table 4 Antibacterial effect of alcohol extract of Mei-tea（Ampelopsis grossedentata）

由表4可知，隨著莓茶醇提萃取液質量濃度的升高，對3個菌株的抑菌透明圈直徑逐漸變大。當莓茶醇提萃取液質量濃度為20 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、痢疾桿菌的抑菌透明圈直徑分別達到20.30、14.10、11.10 mm，與對照相比，莓茶醇提萃取液對3個菌株能發揮抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌的抑制能力最強。

2.5 最小抑菌濃度測定

由接種培養法觀察得到莓茶醇提萃取液能抑制細菌生長，統計結果見表5。

表5 莓茶醇提萃取液最小抑菌濃度測定Table 5 Minimum inhibitory concentration of alcohol extract of Mei-tea（Ampelopsis grossedentata）

由表5可知，莓茶醇提萃取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、痢疾桿菌的最小抑制濃度分別為6、8、10 mg/mL。

2.6 抑菌穩定性檢測

2.6.1 紫外線照射時間對醇提萃取液的抑菌穩定性影響

經不同時間紫外線照射的抑菌透明圈直徑統計結果見圖4。

圖4 紫外線對莓茶醇提萃取液抑菌穩定性影響Fig.4 Influence of UV on antibacterial stability of alcohol extract of Mei-tea（Ampelopsis grossedentata）

由圖4可知，莓茶醇提萃取液（質量濃度為20mg/mL）紫外線照射0～60 min，對金黃色葡萄球菌的抑菌透明圈直徑由20.30 mm下降到18 mm；對大腸桿菌的抑菌透明圈直徑由14.10 mm下降到8.80 mm；對痢疾桿菌的抑菌透明圈直徑由11.10 mm下降到10 mm。結果表明，莓茶醇提萃取液隨著紫外線照射時間的延長，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌透明圈直徑呈現持續減小的趨勢，而對痢疾桿菌抑菌透明圈直徑影響不明顯。說明莓茶醇提萃取液經紫外線照射下對3個菌株均有抑制作用，特別對痢疾桿菌的抑制穩定性較強。

2.6.2 pH值對醇提萃取液的抑菌穩定性影響

不同pH值處理對醇提萃取液的抑菌透明圈直徑統計結果見圖5。

圖5 pH值對莓茶醇提萃取液抑菌穩定性影響Fig.5 Influence of pH on antibacterial stability of alcohol extract of Mei-tea（Ampelopsis grossedentata）

由圖5可知，莓茶醇提萃取液（質量濃度為20 mg/mL）對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、痢疾桿菌抑制效果較強的pH值分別為5、9、7，抑菌透明圈直徑分別為19.9、13.1、10.7 mm。當pH值為11時，其對3個菌株的抑制效果均已出現減弱現象，但抑菌透明圈直徑均保持在7 mm以上。表明pH值處理對莓茶醇提萃取液有一定的影響，但不會使抑菌活性消失。

2.6.3 溫度對醇提萃取液的抑菌穩定性影響

不同溫度處理對醇提萃取液的抑菌透明圈直徑統計結果見圖6。

圖6 溫度對莓茶醇提萃取液抑菌穩定性影響Fig.6 Influence of temperature on antibacterial stability of alcohol extract of Mei-tea（Ampelopsis grossedentata）

由圖6可知，莓茶醇提萃取液（質量濃度為20 mg/mL）對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、痢疾桿菌的抑制效果變化規律均為處于40℃～80℃時抑菌效果平穩，之后隨著溫度的升高，抑制效果持續減弱。當經溫度40、120℃分別處理后，莓茶醇提萃取液分別對金黃色葡萄球菌抑菌透明圈直徑由19.0 mm（40℃）減小到15.0 mm（120℃）；對大腸桿菌抑菌透明圈直徑由11.1mm（40℃）下降到8.0 mm（120℃）；而對痢疾桿菌抑菌透明圈直徑由10.7 mm（40℃）減小到 9.5 mm（120℃），變化幅度較小。通過結果發現，在溫度低于80℃時，莓茶醇提萃取液對3個菌株的抑制效果均較強，之后隨著溫度的升高，抑菌透明圈直徑逐漸變小，但直徑均大于7 mm，表示莓茶醇提萃取液在高溫處理下仍能保持一定的抑菌效果。

2.6.4 金屬離子對醇提萃取液的抑菌穩定性影響

不同金屬離子處理對醇提萃取液的抑菌透明圈直徑統計結果見圖7。

圖7 金屬離子對莓茶醇提萃取液抑菌穩定性影響Fig.7 Influence of metal ions on antibacterial stability of alcohol extract of Mei-tea（Ampelopsis grossedentata）

由圖7可知，莓茶醇提萃取液（質量濃度為20 mg/mL）在一定濃度金屬離子處理下，對金黃色葡萄球菌抑菌透明圈直徑大小表現為 Ca2+＞Mg2+＞K+＞Na+＞Fe3+，對大腸桿菌抑菌透明圈直徑大小表現為 Ca2+＞K+＞Mg2+＞Na+＞Fe3+，對痢疾桿菌抑菌透明圈直徑大小表現為Ca2+＞K+＞Mg2+＞Na+＞Fe3+。通過對金屬離子處理與 CK（未作處理樣品）的抑菌透明圈直徑相比，發現經金屬離子處理的莓茶醇提萃取液抑菌活性均有所下降，其中受Fe3+影響最為明顯，但抑菌透明圈直徑均在7 mm以上。結果表明，在 Na+、Ca2+、K+、Fe3+、Mg2+金屬離子處理下莓茶醇提萃取液均能對此3個菌株發揮不同程度抑制作用。

3 討論與結論

本研究是對莓茶采用加入70%乙醇溶液、60℃恒溫超聲90 min條件下收集上清液，再經旋轉蒸發濃縮，然后依次經石油醚、乙酸乙酯萃取制成的醇提萃取液以及殘渣干燥的水解液通過Folin-Ciocalteu法、Al（NO3）3顯色法測得莓茶中多酚、黃酮總含量分別為468.22、266.18 mg/g；高效液相色譜檢測出黃酮醇類組分——異槲皮素、楊梅素、槲皮素、山奈酚，相應總含量分別為 0.34、45.14、1.86、0.21 mg/g。

據文獻報道，多酚、黃酮、黃酮醇類物質具有廣譜的抑菌活性，如辛敏等[9]研究了黃茶、綠茶、青茶、紅茶、黑茶、白茶6種茶葉提取物多酚對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌的抑制效果，當粗提物濃度為25 mg/mL時，6種茶葉提取物多酚對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制效果最優的均為綠茶，其對相應菌種抑制透明圈直徑分別為16.7、13.3mm。而本研究結果顯示，莓茶醇提萃取液質量濃度20 mg/mL時對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、痢疾桿菌的抑制透明圈直徑分別能達到20.30、14.10、11.10 mm，與辛敏等[9]的研究相比，莓茶醇提萃取液多酚對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制效果要強于6種茶葉多酚；張子龍等[23]、范三紅等[3]分別研究指出了茉莉花茶、藜麥糠黃酮具有抑菌性；張楊等[24]、Sharma等[25]分別評價了黃酮醇類組分——楊梅素、槲皮素存在體內抗菌、抗炎作用。

莓茶含有較豐富的抑菌有效成分——多酚、黃酮和黃酮醇類物質，其中黃酮醇類是以楊梅素為主要組分；抑菌活性大小排序為抑制金黃色葡萄球菌效果＞抑制大腸桿菌效果＞抑制痢疾桿菌效果；對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、痢疾桿菌的最小抑菌濃度分別為6、8、10 mg/mL；經不同的溫度、紫外線照射時間、pH 值和金屬離子處理下對3個菌株所產生的抑制透明圈直徑均大于7 mm，仍表現出較好的抑菌活性和穩定性。這一結論與上述文獻研究中的多酚、黃酮和黃酮醇類物質具有一定的抑菌作用相吻合。因此，莓茶是天然防腐劑開發利用的潛在資源。