發酵綠茶飲料工藝優化、抗氧化活性及貯藏品質研究

鄧成林，王芙苡，周金萍，相君，朱鄭惠，徐巽，林秋葉

（云南農業大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201）

中國是茶的國度，也是茶文化的起源地[1]。茶憑借其健康、營養、快捷等特點，深受廣大消費者青睞與歡迎，茶是世界上消費量僅次于水的飲料，全球約有2/3人口喝茶[2]。茶是一種具有營養保健功能的沖泡類飲品，含有蛋白質、碳水化合物、氨基酸、脂質、維生素和礦物質等營養成分[3-4]。大量研究表明，長期飲用茶能降低癌癥、心血管疾病、糖尿病和帕金森病等慢性疾病的發病率[5]，且飲茶還具有解渴消食、祛痰、解熱、利尿等功效[6]。茶葉中的茶多酚是一種抗氧化物質，具有良好的抗衰老、抗癌作用，且能夠有效預防糖尿病、心血管疾病和神經性疾病等病癥的發生[3，7]。此外，研究證實茶葉中的多糖、咖啡堿等植物活性成分具有增強免疫力、預防心血管疾病、降血壓、抗血栓等保健功能[8-10]。

隨著人們生活水平的提高，越來越多的消費者追求口感更佳、便捷且具有保健功效的茶飲品[11]。茶飲料的制備對茶葉原料等級要求不高，茶飲料作為茶葉消費的新興渠道，具有成本低、口感豐富及綠色健康等特點，已成食品行業研究熱點之一[12]。目前，國內外市場上銷售的茶飲料，以奶茶、果味茶、氣泡茶等調味茶飲料為主。發酵茶飲料是以茶葉浸提液為主要基質，通過微生物的生理代謝作用改善茶葉品質，使得茶飲料呈現出更多的口味和更高的營養價值[13]。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類能夠利用碳水化合物發酵產生乳酸、乙酸、乳酸菌素、胞外多糖等的無芽孢、革蘭氏陽性細菌的總稱[14]。乳酸菌不僅可以促進酸類、醇類、酯類等風味物質的產生來提高發酵食品品質，而且是主要的益生菌種類，具有調節胃腸道健康、促進免疫等多種生理功效[15-16]。幾項研究結果表明，植物乳桿菌在添加茶提取物的MRS肉湯培養基中生長良好[17-18]，同時植物乳桿菌發酵茶提取物增加了兒茶素的含量和抗氧化生物活性[19]。目前，乳酸菌發酵茶飲料主要集中在風味和穩定性研究[20-21]，益生乳酸菌發酵茶飲料及其生物學功效的研究鮮見報道，研發集益生乳酸菌與茶葉保健功效于一體的新型茶葉制品具有重要意義。

本研究以綠茶浸提液為原料，以自主分離的具有優良益生特性的植物乳桿菌ST為菌種，采用單因素試驗和響應面法對乳酸菌發酵綠茶飲料進行工藝優化，并評價最佳工藝條件下發酵綠茶飲料的體外抗氧化活性以及貯藏過程中品質變化情況，旨在為微生物發酵茶飲料新產品的開發提供一定理論依據，研究結果對于促進茶葉資源的合理應用和拓展茶產業結構具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

綠茶茶葉：市售；植物乳桿菌ST：云南農業大學益生菌課題組從發酵食品中自主分離獲得，保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCC NO.13911。

1.2 主要試劑

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]：美國 Sigma-Aldrich 公司；MRS 肉湯培養基、瓊脂粉、CaCl2、NaHCO3、NaCl、碳酸鈣：美倫生物科技有限公司；液體石蠟、無水乙醇、異丙醇：成都市科隆化學品有限公司；氯仿：重慶川東化工（集團）有限公司；六偏磷酸鈉、羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose，CMC）、β-環狀糊精、黃原膠：佳力士添加劑（海安）有限公司；蔗糖：昆明多悅多工貿有限公司；厭氧產氣袋：日本三菱MGC公司。以上試劑均為分析純。

1.3 儀器與設備

721紫外分光光度計：云南賽恩斯實驗設備有限公司；LDZX-50L立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；SW-CJ-1FD單人單面超凈工作臺：蘇州市華宇凈化設備有限公司；PHS-3C pH計：上海雷磁儀器廠；GRX-9203A微生物恒溫培養箱：上海福瑪實驗設備有限公司；TGL-16G高速低溫離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.4 試驗方法

1.4.1 工藝流程

1.4.2 操作要點

1.4.2.1 茶葉浸提液的制備

稱取5 g綠茶茶葉置于1 000 mL蒸餾水中，于90℃～95℃條件下浸提20 min，用180目篩過濾即得茶葉浸提液。

1.4.2.2 調配均質

將0.05%六偏磷酸鈉、0.3%β-環狀糊精、0.04%黃原膠、0.04%CMC以及6.6%蔗糖添加到茶葉浸提液中并混勻。將上述調配好的茶葉浸提液于20 MPa～30 MPa條件下均質3 min～5 min。

1.4.2.3 灌裝殺菌

將上述調配均質后的茶湯分裝于250 mL玻璃飲料瓶中，每瓶200 mL，于62℃～65℃滅菌30 min，作為綠茶飲料發酵基液。

1.4.2.4 接菌發酵

向上述綠茶發酵基液中接種植物乳桿菌ST 7 lg（CFU/mL），于 38.7 ℃下發酵 17 h，即得發酵綠茶飲料。

1.4.3 乳酸菌發酵綠茶飲料工藝優化

1.4.3.1 乳酸菌發酵綠茶飲料單因素試驗

以接種量7 lg（CFU/mL）、加糖量6%、發酵溫度37℃、發酵時間24 h為綠茶飲料基礎發酵條件，以植物乳桿菌 ST 接種量 4、5 、6、7、8 lg（CFU/mL），加糖量2%、4%、6%、8%、10%，發酵時間 6、9、12、15、18、21、24 h，發酵溫度 31、33、35、37、39、41、43 ℃為變量進行單因素試驗，考察各因素對乳酸菌發酵綠茶飲料感官品質和抗氧化活性的影響。

1.4.3.2 響應面分析優化乳酸菌發酵茶飲料最佳工藝條件

依據單因素試驗確定不同因素的影響程度，選取接種量（A）、加糖量（B）、發酵溫度（C）、發酵時間（D）4個因素為考察對象，以感官評分（E）為評價指標，利用Design-Expert V8.0.6軟件，設計四因素三水平響應面試驗，試驗因素和水平見表1。

表1 發酵綠茶飲料的試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface design forfermentation of green tea beverage

1.4.4 感官評分標準

根據GB/T 21733—2008《茶飲料》的相關規定，由具有一定專業知識及良好口感敏銳性的5男5女組成10人感官評定小組對發酵綠茶飲料進行嚴格打分，感官評分標準見表2[22]。

表2 植物乳桿菌ST發酵綠茶飲料的感官評分標準Table 2 Sensory evaluation criteria of Lactobacillus plantarum ST-fermented green tea beverage

1.4.5 植物乳桿菌ST發酵綠茶飲料抗氧化活性分析

1.4.5.1 DPPH自由基清除能力的測定

參照文獻方法[23-25]進行DPPH自由基清除率的測定。取1 mL發酵綠茶飲料上清液（4 000 r/min，15 min）加入到1 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液中，振蕩搖勻，25℃避光靜置30 min，于517 nm處測吸光度，每個樣品平行測定3次（取平均值記為A樣）。另取2 mL未加樣品液的0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，振蕩搖勻，25℃避光靜置30 min，于517 nm處測其吸光度，記為A0。DPPH自由基清除率計算公式如下。

式中：A樣為1 mL樣品＋1 mL DPPH乙醇溶液的吸光度；A0為加樣品液的0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液的吸光度。

1.4.5.2 ABTS+自由基清除能力的測定

參照文獻方法[26-27]進行ABTS+自由基清除能力測定。在734 nm處將ABTS+儲備液用pH7.4磷酸緩沖溶液調節吸光度至0.70±0.02，即為ABTS+反應試液。取2 mL ABTS+反應試液，加入20 μL發酵綠茶飲料上清液（4 000 r/min，15 min）并混勻，避光靜置6 min后于734 nm處測吸光度，平行測定3次（取平均值記為A樣），同時取2.02 mL ABTS+反應試液，避光靜置6 min后于734 nm處測吸光度（記為A0）。取2 mL溶劑（去離子水），加入20 μL樣品溶液并混勻，避光靜置6 min后于734 nm處測其吸光度（記為A對）。ABTS+自由基清除率計算公式如下。

式中：A樣為 20 μL 樣品+2 mLABTS+反應試液的吸光度；A0為 2.02 mLABTS+反應試液吸光度；A對為 20 μL樣品+2 mL溶劑（去離子水）的吸光度。

1.4.6 植物乳桿菌ST發酵綠茶飲料貯藏期內品質變化

按照1.4.1制備乳酸菌發酵綠茶飲料，測定在4℃條件下貯藏 1、3、5、7、14、21 d 的感官評分、pH 值、乳酸菌總數、茶多酚含量、咖啡堿含量和DPPH自由基清除率以及ABTS+自由基清除率。乳酸菌活菌數參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》進行測定；茶多酚含量參照GB/T 21733—2008《茶飲料》進行測定；咖啡堿含量參照GB/T 5009.139—2014《食品安全國家標準飲料中咖啡因的測定》進行測定；pH值利用pH計測定。

1.5 數據處理

數據用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析，采用Ducan法進行多重比較，響應面試驗數據分析應用Design-Expert8.0.6軟件分析。結果以平均值±標準差表示，顯著水平設置P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗最佳工藝條件的確定

2.1.1 植物乳桿菌ST接種量對發酵綠茶飲料的影響

接種量對發酵綠茶飲料感官評分和自由基清除率的影響見圖1。

圖1 乳酸菌接種量對發酵綠茶飲料的影響Fig.1 Effect of inoculation amount of Lactobacillus plantarum ST on fermented green tea beverage

由圖1可知，隨著植物乳桿菌ST接種量的增加，發酵綠茶飲料的感官評分先緩慢上升后急劇下降，分析可能是由于乳酸菌接種量過低，產酸少、發酵風味不足；而接種量過高，產酸過多，導致產品口感較差、接受度差。接種量為7 lg（CFU/mL）時，發酵綠茶飲料的感官評分和抗氧化活性均最高。因此，選取植物乳桿菌ST的最佳接種量為7 lg（CFU/mL）。

2.1.2 蔗糖添加量對發酵綠茶飲料的影響

加糖量對發酵綠茶飲料感官評分和自由基清除率的影響見圖2。

圖2 蔗糖添加量對發酵綠茶飲料的影響Fig.2 Effect of sucrose addition on fermented green tea beverage

由圖2可知，隨著加糖量的增加，發酵綠茶飲料的感官評分和抗氧化活性均先緩慢上升再緩慢下降。加糖量低于6%時，感官評分隨著加糖量的增加緩慢升高，高于6%時，感官評分有所下降，原因是蔗糖添加過多，口感過于甜膩。加糖量為6%時，綠茶飲料的風味較好，酸甜適中，此時DPPH自由基清除率最高，ABTS+自由基清除率較高。因此選取發酵綠茶飲料的最適加糖量為6%。

2.1.3 發酵時間對發酵綠茶飲料的影響

發酵時間對發酵綠茶飲料感官評分和自由基清除率的影響見圖3。

圖3 發酵時間對發酵綠茶飲料的影響Fig.3 Effect of fermentation time on fermented green tea beverage

由圖3可知，隨著發酵時間的延長，發酵綠茶飲料的感官評分先上升后急劇下降，18 h時感官評分最高，18 h后感官評分急劇下降，這可能是因為發酵時間過長，導致產酸過多而影響產品的口感和風味，且發酵18 h時的DPPH自由基清除率最高，ABTS+自由基清除率接近最大值。綜合分析，選取發酵綠茶飲料的最適發酵時間為18 h。

2.1.4 發酵溫度對發酵綠茶飲料的影響

發酵溫度對發酵綠茶飲料感官評分和自由基清除率的影響見圖4。

圖4 發酵溫度對發酵綠茶飲料的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on fermented green tea beverage

由圖4可知，隨著發酵溫度的升高，發酵綠茶飲料感官評分呈先緩慢上升后緩慢下降的趨勢，發酵溫度為37℃～39℃時，綠茶飲料感官評分最為理想，口感風味最佳，DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除率較高，溫度偏高或偏低可能均不利于菌株的生長，進而影響產品風味和抗氧化活性。綜合分析，選取發酵綠茶飲料的最適發酵溫度為38℃。

2.2 響應面優化乳酸菌發酵綠茶飲料最佳工藝結果分析

響應面試驗結果見表3。

表3 發酵綠茶飲料的響應面設計與結果Table 3 Response surface design and results for the fermentation of green tea beverage

續表3 發酵綠茶飲料的響應面設計與結果Continue table 3 Response surface design and results for the fermentation of green tea beverage

運用Design-Expert 8.0對表3中的感官評分進行回歸擬合，得到二次多項回歸方程：E=74.26-3.04A+3.81B+0.92C-0.90D+0.94AB-2.56AC-3.37AD-0.63BC-1.87BD-1.31CD-7.20A2-3.30B2-2.02C2-0.11D2。

對該響應面模型進行顯著性分析，結果如表4所示。

表4 二次多項模型及各項的方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic multinomial models and items

由表4可知，模型P＜0.000 1，說明該模型極顯著。在模型中，A、B、AC、AD、BD、A2、B2和 C2項差異極顯著（P＜0.01），C 和 D 項差異顯著（P＜0.05）；各發酵因素對感官評分的影響次序是B>A>C>D，即加糖量＞接種量＞發酵溫度＞發酵時間。相關系數R2=0.973 6，表明此模型的擬合度很好，能較好地描述因素與響應值之間的關系，可以解釋97.36%的變化。R2Adj=0.947 2，說明試驗誤差小，可信度較高。因此，可用該模型來確定植物乳桿菌ST發酵綠茶飲料的最優工藝。

各因素之間交互作用的等高線3D響應面圖見圖5。

圖5 各試驗因素交互作用對發酵綠茶飲料感官評分的響應面圖Fig.5 Response surface plots of effect of interaction of experimental factors on sensory quality of fermented green tea beverage

由圖5可知，AC、AD、BD之間交互作用明顯，且AD交互效果最好，三維立體圖響應面的開口朝下，表明響應面具有最大值，在試驗范圍內有最優配方。根據上述二次多項回歸方程可得，當接種量為7.12 lg（CFU/mL）、加糖量為6.66%、發酵溫度為38.72℃、發酵時間為16.83 h時，發酵綠茶飲料的感官評分達75.15。考慮到實際操作將上述工藝條件修正為接種量7 lg（CFU/mL）、加糖量 6.6%、發酵溫度 38.7℃、發酵時間17 h。在此工藝條件下進行3次獨立試驗驗證制備的乳酸菌發酵綠茶飲料，得到的感官評分實際值為76.31，與模型預測值接近，證明此模型可靠。

2.3 乳酸菌發酵對綠茶飲料抗氧化活性的影響

抗氧化活性是茶多酚的主要功能活性之一，乳酸菌發酵對茶飲料抗氧化活性的影響見圖6。

圖6 乳酸菌發酵對綠茶飲料抗氧化活性的影響Fig.6 Antioxidant activity of fermented green tea beverage

由圖6可知，與未發酵相比，乳酸菌發酵綠茶飲料的DPPH自由基和ABTS+自由基清除率顯著提高（P＜0.05），其中，DPPH自由基清除率提高了10.34%，ABTS+自由基清除率提高了23.10%，表明利用乳酸菌發酵綠茶飲料可以提高綠茶飲料的抗氧化活性。

2.4 乳酸菌發酵綠茶飲料貯藏期品質變化

乳酸菌發酵綠茶飲料4℃貯藏21 d的品質變化結果見圖7。

由圖7可知，隨著貯藏時間的延長，感官評分先升高后降低，乳酸菌活菌數及茶多酚、咖啡因含量均逐漸降低，pH值則整體緩慢增加，分析可能是因為酸性環境的緩沖作用[22]，也可能是貯藏過程中發生了某種酯化反應消耗了酸[28]。貯藏21 d時，乳酸菌活菌數為6.30 lg（CFU/mL），pH值為3.42，茶多酚含量為1 002.98 mg/L，咖啡因含量為 193.58 μg/mL。貯藏過程中，發酵茶飲料無異味和分層，組織狀態略有沉淀，可能是由于茶多酚、咖啡因和蛋白質的絡合沉淀作用[29]。上述結果表明乳酸菌發酵綠茶飲料冷藏貨架期可達21 d。

3 結論

本研究以植物乳桿菌ST接種量、加糖量、發酵時間、發酵溫度4個因素進行單因素試驗，對乳酸菌發酵綠茶飲料的感官品質及抗氧化活性進行研究。在單因素試驗的基礎上，采用響應面法對乳酸菌發酵綠茶飲料的工藝進行優化，得到各因素對乳酸菌發酵綠茶飲料影響大小排序為加糖量＞接種量＞發酵溫度＞發酵時間。最佳工藝條件為接種量7 lg（CFU/mL）、加糖量6.6%、發酵溫度38.7℃、發酵時間17 h，該條件下，發酵綠茶飲料感官評分為76.31，植物乳桿菌ST活菌數均值為8.49 lg（CFU/mL），pH值為3.24，茶多酚含量為1 079.93 mg/L，咖啡因含量為 195.94 μg/mL，DPPH自由基、ABTS+自由基清除率分別為69.91%和42.29%，與未發酵相比均顯著增加（P＜0.05）。對乳酸菌發酵綠茶飲料進行4℃、21 d貯藏試驗，結果顯示，乳酸菌活菌數在 6 lg（CFU/mL）以上，pH 值在 3.24～3.42 之間，茶多酚含量為1 002.98 mg/L，咖啡因含量為193.58 μg/mL，在貯藏期內飲料的風味和口感穩定。