響應面法優化復合酶解余甘子汁的工藝

孟曉，文靜，金劉翠，張穎，袁昌益，蔣麗施，王娟

（成都中醫藥大學公共衛生學院，四川 成都 611137）

余甘子（Phyllanthus emblica L.）是大戟科葉下珠屬余甘子的果實，又名“滇橄欖”[1-2]，是主產于熱帶、亞熱帶地區的一種富含維生素、微量元素、有機酸、糖類、蛋白質的水果，具有較高的營養價值[3]。研究表明，余甘子果實中含有豐富的超氧化物歧化酶、維生素C、多酚類物質，具有抗衰老、抗癌、抗炎、抗菌、降血壓、降脂減肥等作用[4-6]。

余甘子中含有果膠質、纖維素及半纖維素等物質，導致余甘子的果肉不能在經過一次壓榨后充分破碎，出汁率較低。另外，果膠在貯存期間會生成膠凝沉淀，因此在余甘子汁及飲料的加工和貯藏期間，會存在產生沉淀的問題[7-8]。針對這一問題，已經有多種果蔬汁的澄清方法，例如自然澄清法、明膠-單寧法、酶法等[9]。從劉松濤[9]的研究結果看，自然澄清法用時較長，果蔬汁風味變質；明膠-單寧法澄清所需溫度條件苛刻，運用較少；酶法澄清在瓜果類食品中具有很好的效果，其可在一定程度上使果蔬細胞壁中的果膠、纖維素等物質降解，提高果蔬出汁率[10-11]。王亞男等[12]利用果膠酶-熱浸提法提高野櫻莓的出汁率，對一次榨汁完剩余的果渣進行二次榨汁，提高了出汁率。綜合上述研究，根據不同的研究對象，相對于單一的酶，選用復合酶法能使不同的酶產生協同作用，提高酶解效率，對比超聲等方法在大規模生產上具有一定局限性，使用生物酶法在操作上較為簡單快捷，生產成本較低，且酶本身的反應條件較為溫和、選擇性強。針對余甘子是由果膠質、纖維素等構成的復雜致密結構的特點，通過果膠酶-纖維素酶復合酶酶解，將余甘子細胞壁中的果膠質、纖維素等物質進行降解，使之破壞余甘子細胞壁的致密結構，從而提高余甘子的出汁率，以達到長時間貯藏的效果，減少沉淀的出現。研究表明，通過添加復合酶酶解果蔬等，其可溶性固形物（soluble solid，SS）含量、總酸（total acid，TA）含量提高[13-14]。

本試驗擬以果膠酶-纖維素酶復合酶的酶解技術[15]作為手段，選擇響應曲面設計方法（response surface methodology，RSM）[16-17]中的 Box-Benhnken 設計法[18]，以出汁率為主要指標，可溶性固形物含量及總酸含量作為參考，研究復合酶添加量、復合酶質量比、酶解溫度、酶解時間因素對余甘子二次榨汁出汁率的影響，確定果膠酶和纖維素酶復合酶酶解余甘子汁的最佳工藝條件，為余甘子的精深加工和利用提供理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

余甘子：市售成熟果實；果膠酶（100 000 U/g）、纖維素酶（50 000 U/g）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

手持折光儀（WS-108）：上海測維光電技術有限公司；數顯恒溫水浴鍋（HH-6）：常州澳華儀器有限公司；萬分之一電子天平（ESJ200-4B）：沈陽龍騰電子有限公司；離心機（TDL-BA）：上海菲恰爾分析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

無霉變、無腐爛的新鮮余甘子果實→清洗→破碎→榨汁→粗濾（留濾液）→添加復合酶進行酶解→離心（留上清液作為待測樣品）。

1.3.2 余甘子粗濾液的酶解

將混勻的余甘子粗濾液分裝于錐形瓶中，每個錐形瓶盛裝50 g余甘子粗濾液，加入一定量的復合酶，在一定溫度和時間，完成酶解過程。

1.3.3 單因素試驗設計

以余甘子汁粗濾液為研究對象，以出汁率為主要評價指標，以可溶性固形物和總酸含量為輔助評價指標，研究不同復合酶添加量、復合酶質量比、酶解溫度和酶解時間對余甘子果汁二次榨汁的影響，以確定余甘子果汁二次榨汁的最佳工藝條件。

1.3.3.1 最佳復合酶添加量的確定

取50 g余甘子粗濾液若干份，在添加復合酶質量比為1∶1，酶解溫度為55℃的條件下，改變復合酶添加量分別為 0%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%和 0.05%，酶解3 h后冷卻至室溫（25℃），經5 000 r/min離心10 min后，測定出汁率、可溶性固形物含量及總酸含量，以確定最佳復合酶添加量。

1.3.3.2 最佳復合酶質量比的確定

取50 g余甘子粗濾液若干份，在復合酶添加量為0.01%，酶解溫度為55℃的條件下，改變復合酶質量比（果膠酶 ∶纖維素酶）分別為 3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶1，酶解3 h后冷卻至室溫（25℃），經5 000 r/min離心10 min后，測定出汁率、可溶性固形物含量及總酸含量，以確定混合酶的最佳質量比。

1.3.3.3 最佳酶解時間的確定

取50 g余甘子粗濾液若干份，在復合酶質量比為1∶1，復合酶添加量為0.01%，酶解溫度為55℃的條件下，改變酶解時間分別為1、2、3、4 h和5 h后，冷卻至室溫（25℃），經5 000 r/min離心10 min后，測定出汁率、可溶性固形物含量及總酸含量，確定最佳酶解時間。

1.3.3.4 最佳酶解溫度的確定

取50 g余甘子粗濾液若干份，在復合酶質量比為1∶1，復合酶添加量為0.01%的條件下，改變酶解溫度分別為 40、45、50、55℃和60℃，酶解3 h后冷卻至室溫（25℃），經5 000 r/min離心10 min后，測定出汁率、可溶性固形物含量及總酸含量，以確定最適酶解溫度。

1.3.4 響應面試驗設計

綜合單因素試驗結果，根據Box-Behnken試驗設計方法，以酶解溫度、酶解時間、復合酶添加量、復合酶質量比為變量，以出汁率為響應值設計試驗，因素水平編碼見表1。

表1 試驗因素和編碼水平Table 1 Test factors and coding levels

1.4 指標測定方法

1.4.1 出汁率的測定

參照劉剛等[19]的方法并做一定改進。對酶解前后的余甘子汁進行稱量，出汁率按如下公式計算。

式中：G1為酶解后果汁質量，g；G2為酶解前果漿質量，g。

1.4.2 可溶性固形物含量的測定

先用柔軟絨布擦凈棱鏡表面，滴加2滴～3滴待測樣液，使樣液均勻分布在整個棱鏡表面，對準光源，折射儀讀數P（%）即為該樣液的可溶性固形物含量。

1.4.3 總酸含量的測定

參照GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》方法[20]，使用酸堿指示劑滴定法，根據酸堿中和原理，用堿液滴定試液中的酸，以酚酞為指示劑確定終點，使用試劑均為分析純，對余甘子汁的總酸含量進行測定，按照如下公式計算。

式中：c為標準氫氧化鈉溶液的濃度，mol/L；V1為滴定所消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；V2為空白所消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；m為試樣體積，mL；k為酸的換算系數，以蘋果酸計算，k=0.067；F為試液稀釋的倍數；1 000為換算系數。

1.5 數據處理

所有試驗設3次重復，結果用平均值±標準差表示，應用Microsoft office Excel 2013處理試驗數據，SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析，Design Expert 12.0軟件進行響應面試驗統計與分析。

2 結果與分析

2.1 復合酶添加量對余甘子汁出汁率、可溶性固形物及總酸含量的影響

復合酶添加量對余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及總酸含量的影響見圖1。

圖1 復合酶添加量對余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及總酸含量的影響Fig.1 Effect of enzyme complex addition on juice yield，soluble solids content and total acid content

由圖1可知，當果膠酶和纖維素酶復合酶添加量為0.01%時，余甘子汁的出汁率最高，為91.03%。同時，可溶性固形物含量及總酸含量也上升到最高值，分別為12.00%和28.46 g/L。隨著復合酶添加量繼續增加，余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及總酸含量顯著下降（p＜0.05）。當復合酶添加量升高到0.02%時，繼續增加其添加量，余甘子汁的出汁率顯著下降（p＜0.05），但可溶性固形物和總酸含量的變化無顯著差異（p＞0.05）。綜合上述結果表明，果膠酶和纖維素酶復合酶的最佳添加量為0.01%。

2.2 復合酶質量比對余甘子出汁率、可溶性固形物含量及總酸含量影響

復合酶質量比對余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及總酸含量影響見圖2。

圖2 復合酶質量比對余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及總酸含量的影響Fig.2 Effect of the ratio of complex enzymes on juice yield，soluble solids content and total acid content

由圖2可知，當果膠酶-纖維素酶復合酶質量比為1∶1時，余甘子汁的出汁率最高，為89.39%。同時，其可溶性固形物含量及總酸含量也上升到最高值，分別為12.23%和27.66 g/L。隨著復合酶質量比的減小，余甘子汁的出汁率、可溶性固形物和總酸含量顯著下降（p＜0.05），但當復合酶質量比為1∶2時，繼續減小復合酶質量比，余甘子汁的總酸含量無顯著變化（p＞0.05）。當兩種酶同時作用時，其對余甘子細胞壁及胞間結構的影響更為復雜，果膠酶和纖維素酶在酶解余甘子汁時可能具有協同作用[21]。果膠酶含量較高時，纖維素不能被充分降解，而當纖維素含量較高時，果膠不能被充分降解，這可能是不同酶質量比導致余甘子汁中可溶性固形物含量和總酸含量及余甘子汁出汁率先增后減的原因。綜合上述結果表明，果膠酶-纖維素酶復合酶的最佳質量比為1∶1。

2.3 酶解時間對余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及總酸含量的影響

酶解時間對余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及總酸含量的影響見圖3。

圖3 酶解時間對余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及總酸含量的影響Fig.3 Effect of enzymatic digestion time on juice yield，soluble solids content and total acid content

由圖3可知，當酶解時間為3 h時，余甘子汁的出汁率最高，為91.54%。同時，其可溶性固形物含量及總酸含量也上升到較高值，分別為12.53%和27.18 g/L。隨著酶解時間的繼續延長，對余甘子汁的出汁率、可溶性固形物含量及總酸含量無顯著影響（p＞0.05）。綜合上述結果表明，余甘子汁酶解的最佳時間為3 h。

2.4 酶解溫度對余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及總酸含量的影響

酶解溫度對余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及總酸含量的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及總酸含量的影響Fig.4 Effect of enzymatic digestion temperature on juice yield，soluble solids content and total acid content

由圖4可知，當酶解溫度為55℃時，余甘子汁的出汁率最高，為92.15%。同時，其可溶性固形物含量及總酸含量也上升到最高值，分別為11.90%和26.61 g/L。但隨著酶解溫度的升高，酶活性逐漸降低，使得酶解效率降低，余甘子汁的出汁率、可溶性固形物含量及總酸含量均顯著下降（p＜0.05）。綜合上述結果表明，余甘子汁酶解的最佳溫度為55℃。

2.5 響應面設計及結果

2.5.1 響應面試驗結果與方差分析

應用Design-Expert 12.0對試驗結果進行多元回歸分析，結果如表2所示。

表2 復合酶酶解余甘子汁的響應面試驗設計與結果Table 2 Response surface experimental design and results for the enzymatic digestion of Phyllanthus emblica L.by a complex enzyme

續表2 復合酶酶解余甘子汁的響應面試驗設計與結果Continue table 2 Response surface experimental design and results for the enzymatic digestion of Phyllanthus emblica L.by a complex enzyme

對表2試驗數據進行回歸分析，求得多元二次回歸方程為出汁率/%=88.96-0.38A-0.08B-0.002C-0.88D+0.06AB+0.03AC-0.72AD+0.46BC+0.29BD+0.07CD-0.72A2-0.82B2-0.52C2-5.11D2。

對出汁率回歸模型進行方差分析，結果見表3。

表3 余甘子出汁率回歸模型方差分析Table 3 Juice yield regression model ANOVA

續表3 余甘子出汁率回歸模型方差分析Continue table 3 Juice yield regression model ANOVA

由表3可知，模型p＜0.000 1，表明模型極顯著；失擬 p=0.249 7＞0.05，差異不顯著。模型 R2=0.981 9，R2Adj=0.963 8，說明預測值與實測值間相關性較好，該二次回歸模型適當，具有實際意義。并且由各因素均方值可知，各種因素對出汁率的影響順序為復合酶質量比＞酶解溫度＞酶解時間＞復合酶添加量。

2.5.2 響應面交互作用分析

通過Design-Expert 12.0軟件中響應面優化分析方法得出酶解時間、酶解溫度、復合酶質量比和復合酶添加量各交互因素對出汁率的響應面圖和等高線圖，如圖5所示。根據響應面圖中的曲面坡度可知，各因素對響應值的影響大小，坡面越陡說明因素對響應值的影響越大。而根據等高線形狀可知各因素之間交互作用的強弱，等高線呈橢圓形表明因素間的交互作用顯著。

圖5 酶解溫度和復合酶質量比交互作用對出汁率的影響Fig.5 Effect of the interaction between enzymatic digestion temperature and enzyme complex ratio on juice yield

由圖5可知，酶解溫度和復合酶質量比交互作用的曲面較陡且等高線形狀呈橢圓形，說明酶解溫度和復合酶質量比對余甘子汁出汁率影響較大。同時，結合表3可知，一次項D和交互項B2、D2達到極顯著影響水平，一次項A、交互項AD、A2、C2達到顯著水平。說明復合酶質量比對余甘子汁的出汁率影響極顯著（p＜0.01），酶解溫度、酶解溫度和復合酶質量比交互作用對余甘子汁的出汁率影響顯著（p＜0.05）。

2.5.3 復合酶酶解余甘子汁響應面試驗模型的驗證

根據Design-Expert 12.0軟件分析出的若干解決方案條件及其相應預測值，考慮保證高響應值，結合實際應用需要，對響應面優化結果進行最優分析的驗證，獲得最佳參數組合為酶解溫度55℃、酶解時間2.9 h、復合酶添加量0.01%、復合酶質量比1.1∶1，3次平行試驗得到實測值余甘子汁出汁率（88.81±0.20）%，該值與預測值出汁率88.99%的相對誤差為0.20%，小于1%，同時，測得可溶性固形物含量為（14.57±0.06）%、總酸含量為（29.28±0.15）g/L。說明數值模擬和回歸方程的預測值與試驗值之間具有較好的擬合度，驗證了該模型的正確性。

3 討論與結論

羅蘭等[22]利用纖維素酶輔助超聲提取余甘子多糖工藝的研究，其研究結果表明，在超聲溫度41℃、液料比6∶1、超聲時間75 min、超聲功率300 W的工藝條件下，余甘子多糖提取率達到最佳，為5.76%。本研究與其研究相比較，都運用了生物酶法，但本研究運用果膠酶-纖維素酶復合酶法，不僅能將余甘子細胞壁中的纖維素降解，其果膠質的降解更能減少后續加工中沉淀現象。劉盈盈等[15]利用果膠酶-纖維素酶復合酶法優化澄清余甘子汁，研究結果表明，在復合酶添加量0.01%、酶解溫度55℃、酶解3 h的條件下，得到余甘子汁的褐變度為0.452，透光率為94.0%，和空白組相比，褐變度無明顯增加，透光率相對增加。本研究與其研究結果相比較，結果基本一致，而且本試驗更進一步研究了復合酶質量比對余甘子汁出汁率的影響，得到了最佳復合酶質量比1.1∶1的結果，更好地研究了兩種復合酶的用量比例關系，可為余甘子的實際生產應用提供一定參考。劉東[23]研究的余甘子清汁飲料的酶解工藝條件為果膠酶添加量0.02%、纖維素酶添加量0.04%，并在45℃下酶解3 h，果肉出汁率為77.6%。本研究與其研究相比較，研究材料皆為經過一次榨汁得到的粗濾余甘子汁，并對粗濾的余甘子汁進行二次榨汁，以達到提高出汁率的效果，通過對比發現本研究出汁率為（88.81±0.20）%，相對提高了（11.21±0.20）%；劉東[23]的研究用酶量較高，而本研究通過果膠酶和纖維素酶復配，減少了酶的用量；溫度有差異的原因可能是原料和酶的產地、性質不同。綜合上述，本研究使用復合酶法酶解余甘子汁使其出汁率提高具有一定的效果和優勢，并且試驗過程沒有試劑污染，環境污染小，與低碳經濟的原則相契合，酶解工藝比較簡單、操作便捷，出汁率較高，可以為余甘子加工的規模化和產業化提供一定試驗基礎。

本研究獲得的果膠酶-纖維素復合酶酶解余甘子汁的最佳工藝條件：酶解溫度55℃、酶解時間2.9 h、復合酶添加量0.01%、復合酶質量比1.1∶1，在該工藝條件下余甘子汁出汁率為（88.81±0.20）%，與預測值的相對誤差為0.20%，小于1%，同時其可溶性固形物含量為（14.57±0.06）%、總酸含量為（29.28±0.15）g/L，該模型具有較好的預測性能。