外源誘導物對叢毛紅曲霉固態發酵產莫納可林K的影響

溫欽友，葉燕芳，鄭政淮，張亞如，陳麗晨，黃志偉*

（1.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2.福建農林大學福建省特種淀粉品質科學與加工技術重點實驗室，福建 福州 350002）

紅曲米是將紅曲霉（Monascus）接種到大米中發酵制備而成的，含有多種活性物質，是一種藥食兩用的傳統中藥，也可作為食品的染色劑和防腐劑、治療消化不良等。紅曲米的生理功能主要來源于紅曲霉的活性代謝產物[1]，如莫納可林K[2]（monacolin K，MK）、γ氨基丁酸和色素等[3]。其中MK具有降低膽固醇、抗癌防癌、神經保護、抗炎抑菌等功效[4-6]。MK又稱洛伐他汀（lovastatin），最早由日本學者遠藤章于1979年從紅色紅曲霉（M.ruber）的發酵產物中首次分離獲得[7]，MK可通過競爭性抑制膽固醇合成限制酶——3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGR）的活性而抑制膽固醇的合成，從而降低人體和動物血液中的膽固醇水平[8]。研究表明，在紅曲米中至少含有14種具有降血脂功能的物質，包括莫納可林K、莫納可林J、莫納可林L、莫納可林M、莫納可林X及它們的酸式結構、脫氫莫納可林K、二氫莫納可林L、康伐他汀等[9]。除了產生具有降血脂作用的活性物質，多數紅曲霉菌株還會產生具有肝腎毒性的桔霉素，這種毒素的存在限制了紅曲霉產業的發展[10]。但不同紅曲霉菌株產桔霉素的能力差異很大，Dai等[11]從商業紅曲產品中分離出4株叢毛紅曲霉菌株 MS-1、YDJ-1、YDJ-2 和 K104061，且發現這4株叢毛紅曲霉在高產MK的同時不產桔霉素，這對叢毛紅曲霉的進一步開發利用具有深遠意義。

他汀類藥物已成為降血脂治療的主流藥物[12-13]，因此如何提高發酵產物中的MK產量是紅曲霉領域近年來的研究熱點。一般紅曲霉產MK的常見發酵模式有固態發酵（solid state fermentation，SSF）和液態發酵（submerged fermentation，SmF）[2]。相比 SmF，SSF 法有許多優勢，如真菌在SSF中能夠產生更高活性的酶，因而代謝產物的產量也更高，甚至能夠產生SmF下無法生成的酶類[14]，還有研究發現，SSF下紅曲霉的MK合成速率、甘油消耗率、生物量的積累速率、細胞膜的流動性與滲透性以及甘油耐受濃度都明顯高于SmF下的紅曲霉[15-16]，SSF發酵的MK產量高出SmF下的數倍甚至數十倍[17-18]。

向紅曲霉的固態發酵基質中添加碳源（甘油、葡萄糖、乳糖等）、氮源（谷氨酸、大豆粉、蛋白胨等）、無機鹽等營養物質，也是提高其MK產量的有效方法之一。甘油常作為碳源，用于紅曲霉的MK發酵[15]。Shi等[19]通過生理學和轉錄組分析發現，在紅曲霉發酵過程中甘油加速了其糖酵解和碳代謝。也有研究指出甘油不僅被紅曲霉用作碳源，而且直接參與其代謝[20]。這些研究表明，甘油作為碳源在紅曲霉發酵中起到了很好的促進作用。氮源是真菌菌絲生長必需的營養物質，也能促進 MK 合成，如 NaNO3[21]、大豆粉[22]等，張占軍等[23]利用響應面法研究發現，當接種量為17.50%、裝料量為32.95 g/250 mL、玉米粉添加量為3.80%和蛋白胨添加量為2.37%時，煙色紅曲霉（Monasucs fuliginosus Sato）固態發酵的MK產量最高。此外，將一些氨基酸作為氮源或前體物質添加到培養基中，能顯著提高紅曲霉的MK產量[24]，如谷氨酸[25]、蛋氨酸[26]。對于紅曲霉等許多絲狀真菌，某些單價和二價陽離子對其細胞的生長和代謝產物的合成都具有重要的促進作用，Panda等[27]研究發現MgSO4、NH4Cl和NaCl均能大幅度提高紫色紅曲霉菌株MTCC 369的MK產量，MnSO4和CaCl2也有促進效果。Dikshit等[28]對紫色紅曲霉（M.purpureus）與血紅紅曲霉（M.sanguineus）兩種菌株的SSF培養基進行優化，結果發現MgSO4·7H2O和MnSO4·7H2O對兩種菌株的MK產量都有顯著的促進作用。

目前，紫色紅曲霉、紅色紅曲霉和叢毛紅曲霉為紅曲發酵生產中3種主要紅曲霉，國內外學者關于提高紅曲霉MK產量的研究報道，多以紅色紅曲霉和紫色紅曲霉的研究為主，關于叢毛紅曲霉的文獻報道較少。因此，根據前期研究結果，選擇11種對紅曲霉MK產量具有顯著提高效果的外源誘導物，研究其對叢毛紅曲霉固態發酵產MK的影響，從而為叢毛紅曲霉更好地應用于高MK紅曲發酵產物的工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株與試劑

叢毛紅曲霉（Monascus pilous）菌株 CICC 5045：中國工業微生物菌種保藏管理中心。葡萄糖、瓊脂粉、蛋白胨、磷酸二氫鉀、無水乙醇、氫氧化鈉、磷酸、蛋氨酸、谷氨酸、三水合乙酸鈉、二水合檸檬酸鈉、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、Na2MoO4·2H2O、CaCl2、CoCl2·6H2O（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（色譜純）：格雷斯（中國）有限公司；MK標準品（洛伐他汀≥98%）：中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2 儀器與設備

中藥粉碎機（50 g，LG-01）：瑞安市百信藥機有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋（MJ-54A）：施都凱儀器設備有限公司；超低溫保存箱（MDF-382E）：日本三洋電機貿易會社；電子天平（BSA2202S-CW）、電子天平（BSA-124S-CW）：賽多利斯科學儀器有限公司；水浴鍋（HH-2）：江蘇金壇精達儀器制造廠；潔凈工作臺（VS-1300LU）：蘇州安泰空氣技術有限公司；恒溫搖床（ZHWY-200D）：上海智城分析儀器制造有限公司；霉菌培養箱（MJX-50）：寧波江南儀器廠；電熱鼓風干燥箱（DHG-9005）：上海一恒科學儀器有限公司；高效液相色譜儀（e2695）：美國沃特斯公司。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：200 g新鮮土豆，削皮、切塊，于沸水中煮20 min至煮爛成汁，經4層紗布過濾后，加入葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，加水溶解后定容至1 000 mL，121℃下高壓滅菌20 min。

種子液培養基：葡萄糖60g、蛋白胨20g、NaNO32g、KH2PO41 g、MgSO41 g，于250 mL三角瓶中裝入100 mL種子液培養基，121℃下高壓滅菌20 min。

固態發酵基礎培養基：取30 g大米，加入6 g甘油與20 mL水，封口后于121℃下高壓滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 叢毛紅曲霉固態發酵的培養方法

叢毛紅曲霉固態發酵的培養方法參照Zhang等[15]與陳慎等[29]的研究方法：用無菌水沖洗PDA斜面培養基上培養7 d～14 d的紅曲霉孢子并輕輕刮下，倒入種子液培養基中。將種子液培養基置于28℃恒溫搖床內，160 r/min振蕩培養2 d后，取8 mL種子培養液，加入到裝有固態發酵基質的塑料發酵瓶內，并置于28℃培養箱內培養3 d，待米粒長滿菌絲后，加入20 mL無菌水，隨后每日加水5 mL并將米粒搖勻打散，培養至第15天，發酵完成。

1.2.2 叢毛紅曲霉固態發酵產MK的單因素試驗設計

在固態發酵基礎培養基中，分別加入蛋氨酸（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/g）、谷氨酸（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/g）、三水合乙酸鈉（0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 mg/g）、二水合檸檬酸鈉（1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mg/g）、FeSO4·7H2O（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mg/g）、MgSO4·7H2O（1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mg/g）、ZnSO4·7H2O（1.00、1.50、2.00、2.50、3.00mg/g）、MnSO4·H2O（1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 mg/g）、Na2MoO4·2H2O（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/g）、CaCl2（1.00、1.50、2.00、2.50、3.00mg/g）、CoCl2·6H2O（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/g），培養基的其他成分及培養條件均保持一致，同時以不添加外源誘導物的固態發酵基礎培養基作為對照，按照1.2.1中的方法進行叢毛紅曲霉的固態發酵培養后，檢測發酵產物的MK含量，每個處理設4個重復。

1.2.3 叢毛紅曲霉固態發酵外源誘導物最優組合的響應面優化設計

根據固態發酵的單因素試驗結果，選取MK產量提高效果最顯著的3種外源誘導物，進行外源誘導物最優組合的響應面試驗設計，因素水平見表1。

表1 響應面試驗的因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.4 固態發酵產物中MK含量的高效液相色譜檢測

待測樣品的前處理：將發酵培養后的紅曲米樣品置于60℃的鼓風干燥箱中烘干至恒重，隨后將紅曲米研磨粉碎并過80目篩，取1 g粉末置于10 mL離心管中，加入75%乙醇定容至10 mL，超聲處理30 min，期間搖勻1次，待超聲完成后再搖勻1次，并靜置5 min，隨后取上清液，經0.45 μm濾膜過濾后，用于高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）進樣檢測。

酸型MK標準溶液的配制：稱取1.50 mg MK標準品，置于10 mL棕色容量瓶中，加入2 mL 0.2 moL/L NaOH溶液，用75%乙醇溶解后定容至10 mL，50℃水浴30 min，期間振搖2次，使內酯型MK轉化為酸型MK，配制成150 μg/mL的標準溶液，置于4℃冰箱中保存備用。

內酯型MK標準溶液的配制：稱取1.50 mg MK標準品，置于10 mL棕色容量瓶中，用75%乙醇溶解后定容至10 mL，配制成150 μg/mL標準溶液，置于4℃下冰箱中存備用。

HPLC檢測的色譜條件：Waters高效液相色譜儀（e2695），色譜柱為 SunfireC18（5μm，250mm×4.6mm）；流動相為乙腈∶0.1%磷酸水溶液=55∶45（體積比）；流速為1 mL/min；紫外檢測器的波長為238 nm；柱溫為30℃；進樣量為 20 μL。

待測樣品中MK含量（mg/kg）的計算公式如下。

式中：W（MK）為樣品中 MK 含量，mg/kg；C（MK）為MK標準品濃度和待測樣品目標物質峰面積（A）的比值，μg/mL；m為待測樣品的質量，g。

1.2.5 數據處理與統計

采用SPSS數據處理系統，對所有試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同誘導物對叢毛紅曲霉固態發酵產MK的影響

2.1.1 蛋氨酸對叢毛紅曲霉固態發酵MK產量的影響

蛋氨酸添加量對叢毛紅曲霉固態發酵MK產量的影響見圖1。

圖1 蛋氨酸添加量對叢毛紅曲霉固態發酵MK產量的影響Fig.1 Effect of methionine concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖1可知，不同添加量的蛋氨酸，叢毛紅曲霉固態發酵的MK產量均與對照組沒有顯著差異。氨基酸是一種有機氮源，在叢毛紅曲霉的固態發酵中添加蛋氨酸相當于添加有機氮源，其對叢毛紅曲霉的生長發育具有重要意義[30]。但本研究中不同添加量的蛋氨酸，對叢毛紅曲霉的MK產量沒有顯著促進作用，因此，可

不添加蛋氨酸。

2.1.2 谷氨酸對叢毛紅曲霉固態發酵MK產量的影響谷氨酸添加量對叢毛紅曲霉固態發酵產MK的影響見圖2。

圖2 谷氨酸添加量對叢毛紅曲霉固態發酵產MK的影響Fig.2 Effect of glutamic acid concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖2可知，添加谷氨酸可顯著提高叢毛紅曲霉固態發酵的MK產量（P＜0.05）。當谷氨酸添加量為0.50 mg/g時，MK產量可達227.29 mg/kg，比對照組的MK產量提高了57.9%，因此，叢毛紅曲霉固態發酵產MK時，谷氨酸的最適添加量為0.50 mg/g。添加谷氨酸能夠顯著提高紅曲霉的MK產量，其原因可能是谷氨酸能夠改變紅曲霉的細胞形態，從而增加MK的分泌[25]。此外，Zhang等[31]的研究結果表明，谷氨酸能提高紅曲霉MK合成相關基因的表達，從而促進MK的合成。

2.1.3 三水合乙酸鈉對叢毛紅曲霉固態發酵MK產量的影響

三水合乙酸鈉添加量對叢毛紅曲霉固態發酵產MK的影響見圖3。

圖3 三水合乙酸鈉添加量對叢毛紅曲霉固態發酵產MK的影響Fig.3 Effect of sodium acetate concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖3可知，不同添加量的三水合乙酸鈉，叢毛紅曲霉固態發酵的MK產量均與對照組沒有顯著差異。因此，叢毛紅曲霉固態發酵產MK時，可不添加三水合乙酸鈉。三水合乙酸鈉對紅曲霉發酵的MK合成有一定的促進作用，但三水合乙酸鈉添加量過高會使培養基的pH值升高，從而不利于菌體的生長，進而抑制MK的合成[32]。

2.1.4 二水合檸檬酸鈉對叢毛紅曲霉固態發酵MK產量的影響

二水合檸檬酸鈉添加量對叢毛紅曲霉固態發酵產MK的影響見圖4。

圖4 二水合檸檬酸鈉添加量對叢毛紅曲霉固態發酵產MK的影響Fig.4 Effect of citric acid concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖4可知，不同添加量的二水合檸檬酸鈉，叢毛紅曲霉固態發酵的MK產量均與對照組沒有顯著差異。二水合檸檬酸鈉對紅曲霉發酵的MK合成有一定的促進作用，可能是由于二水合檸檬酸鈉在水解時會釋放堿性離子，使紅曲霉發酵環境的pH值穩定在一定范圍內，起到了緩沖作用，從而調節菌體細胞的滲透壓[33]。但本研究中不同添加量的二水合檸檬酸鈉，均未顯著提高叢毛紅曲霉的MK產量。因此，叢毛紅曲霉固態發酵產MK時，可不添加二水合檸檬酸鈉。

2.1.5 FeSO4·7H2O對叢毛紅曲霉固態發酵MK產量的影響

FeSO4·7H2O添加量對叢毛紅曲霉固態發酵產MK的影響見圖5。

圖5 FeSO4·7H2O添加量對叢毛紅曲霉固態發酵產MK的影響Fig.5 Effect of FeSO4·7H2O concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖5可知，不同添加量的FeSO4·7H2O，叢毛紅曲霉固態發酵的MK產量均與對照組沒有顯著差異。楊東成等[34]研究了3種金屬離子對紅曲霉發酵產生色素的影響，發現低濃度Fe2+能提高紅色素的產量。馮光志等[35]的研究表明，Fe2+會促進某些真菌的菌絲生長，但其添加量超過279.3 mg/kg時反而抑制菌絲的生長。所以，推測適當添加量的Fe2+會促進叢毛紅曲霉的菌絲生長，進而促進MK合成。但本研究中不同添加量的FeSO4·7H2O，均未明顯提高叢毛紅曲霉的MK產量。因此，叢毛紅曲霉固態發酵產MK時，可不添加FeSO4·7H2O。

2.1.6 MgSO4·7H2O對叢毛紅曲霉固態發酵MK產量的影響

MgSO4·7H2O添加量對叢毛紅曲霉固態發酵產MK的影響見圖6。

圖6 MgSO4·7H2O添加量對叢毛紅曲霉固態發酵產MK的影響Fig.6 Effect of MgSO4·7H2O concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖6可知，不同添加量的MgSO4·7H2O，對提高叢毛紅曲霉固態發酵的MK產量有顯著效果。當MgSO4·7H2O添加量為1.50 mg/g時，MK產量達到最大（212.03 mg/kg），與對照組的差異達到極顯著水平（P＜0.01），比對照組的MK產量提高了46.5%；當MgSO4·7H2O添加量為0～1.50 mg/g時，叢毛紅曲霉的MK產量隨MgSO4·7H2O添加量的增加而增加。分析其原因，可能是Mg2+為真菌生長所需的微量元素[36]。Mg2+還能夠促進土曲霉洛伐他汀合成前體物質的積累和菌體發育，從而提高洛伐他汀產量[37]。當MgSO4·7H2O添加量大于1.50 mg/g時，叢毛紅曲霉MK產量的提高效果隨MgSO4·7H2O添加量的增加而下降。分析其原因，可能是叢毛紅曲霉生物量的快速積累，導致培養基中的營養物質消耗過快，進而造成MK產量的下降[38]。因此，叢毛紅曲霉固態發酵產MK時，MgSO4·7H2O的最適添加量為1.50 mg/g。

2.1.7 ZnSO4·7H2O對叢毛紅曲霉固態發酵MK產量的影響

ZnSO4·7H2O添加量對叢毛紅曲霉固態發酵產MK的影響見圖7。

圖7 ZnSO4·7H2O添加量對叢毛紅曲霉固態發酵產MK的影響Fig.7 Effect of ZnSO4·7H2O concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖7可知，不同添加量的ZnSO4·7H2O，對提高叢毛紅曲霉固態發酵的MK產量有顯著效果。當ZnSO4·7H2O添加量為2.50 mg/g時，MK產量達到最大（237.86 mg/kg），與對照組的差異達到極顯著水平（P＜0.01），比對照組的MK產量提高了136.2%；隨著ZnSO4·7H2O添加量的增加，叢毛紅曲霉的MK產量也逐漸增加。分析其原因，可能是Zn2+能夠提高叢毛紅曲霉的色素產量[39]，而色素與MK同為聚酮化合物，因此添加Zn2+對叢毛紅曲霉的MK合成也有一定的促進作用，從而提高MK產量。當ZnSO4·7H2O的添加量大于2.50 mg/g時，叢毛紅曲霉產MK的增長速率隨著ZnSO4·7H2O添加量的增加而下降，可能是較高添加量的ZnSO4·7H2O促進叢毛紅曲霉生物量的快速積累，導致營養物質過快消耗，從而影響其代謝產物的合成。因此，叢毛紅曲霉固態發酵產MK時，ZnSO4·7H2O的最適添加量為2.50 mg/g。

2.1.8 MnSO4·H2O對叢毛紅曲霉固態發酵MK產量的影響

MnSO4·H2O添加量對叢毛紅曲霉固態發酵產MK的影響見圖8。

圖8 MnSO4·H2O添加量對叢毛紅曲霉固態發酵產MK的影響Fig.8 Effect of MnSO4·H2O concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖8可知，不同添加量的MnSO4·H2O，對提高叢毛紅曲霉固態發酵的MK產量有顯著效果。當MnSO4·H2O添加量為1.50 mg/g時，MK產量達到最大（219.29 mg/kg），與對照組的差異達到極顯著水平（P＜0.01），比對照組的MK產量提高了107.6%；當MnSO4·H2O的添加量為0～1.50mg/g時，隨著MnSO4·H2O添加量的升高，叢毛紅曲霉的MK產量也逐漸增加。這與Lin等[38]的研究結果一致，推測Mn2+可以通過促進MK生物合成途徑中莫納可林J和2-甲基丁酸前體的積累來促進MK的生成。因此，叢毛紅曲霉固態發酵產MK的MnSO4·H2O最佳添加量為1.50 mg/g。

2.1.9 Na2MoO4·2H2O對叢毛紅曲霉固態發酵MK產量的影響

Na2MoO4·2H2O添加量對叢毛紅曲霉固態發酵產MK的影響見圖9。

圖9 Na2MoO4·2H2O添加量對叢毛紅曲霉固態發酵產MK的影響Fig.9 Effect of Na2MoO4·2H2O concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖9可知，不同添加量的Na2MoO4·2H2O，對提高叢毛紅曲霉固態發酵的MK產量有顯著效果。當Na2MoO4·2H2O的添加量為1.00 mg/g時，MK產量達到最大（326.91 mg/kg），與對照組的差異達到極顯著水平（P＜0.01），比對照組的MK產量提高了133.3%；當Na2MoO4·2H2O添加量小于1.00 mg/g時，隨著Na2MoO4·2H2O添加量的增加，叢毛紅曲霉的MK產量也逐漸增加。分析其原因，可能是Mo6+具有與Zn2+相似的功能，能夠促進聚酮化合物合成反應的進行，進而提高紅曲霉的MK產量[39]，此外，添加Na2MoO4·2H2O能夠減少叢毛紅曲霉在發酵過程出現的結塊現象，也有助于叢毛紅曲霉MK產量的提高。因此，叢毛紅曲霉固態發酵產MK時，Na2MoO4·2H2O的最適添加量為1.00 mg/g。

2.1.10 CaCl2對叢毛紅曲霉固態發酵MK產量的影響

CaCl2添加量對叢毛紅曲霉固態發酵產MK的影響見圖10。

圖10 CaCl2添加量對叢毛紅曲霉固態發酵產MK的影響Fig.10 Effect of CaCl2concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖10可知，添加1.50 mg/g的CaCl2，能顯著提高叢毛紅曲霉固態發酵的MK產量，比對照組的MK產量提高了53.1%；當CaCl2添加量小于1.50 mg/g時，隨著CaCl2添加量的升高，叢毛紅曲霉的MK產量也逐漸增加；當添加量高于1.50 mg/g時，MK產量隨著CaCl2添加量的增大而減小，且與對照組的MK產量無顯著差異（P＞0.05）。分析原因可能是較高的CaCl2添加量不利于叢毛紅曲霉的生長，進而導致其MK產量下降[28]。因此，叢毛紅曲霉固態發酵產MK時，CaCl2的最適添加量為1.50 mg/g。

2.1.11 CoCl2·6H2O對叢毛紅曲霉固態發酵MK產量的影響

CoCl2·6H2O添加量對叢毛紅曲霉固態產MK的影響見圖11。

圖11 CoCl2·6H2O添加量對叢毛紅曲霉固態產MK的影響Fig.11 Effect of CoCl2·6H2O concentration on the production of MK of M.pilosus in SSF

由圖11可知，CoCl2·6H2O添加量為0.05 mg/g時，可顯著提高叢毛紅曲霉固態發酵的MK產量，MK產量可達152.41 mg/kg，比對照組的MK產量提高了39.3%；當CoCl2·6H2O添加量大于0.05 mg/g時，MK產量隨CoCl2·6H2O添加量的增加而逐漸減少。分析其原因，適當添加Co2+，對叢毛紅曲霉的發酵培養起到了促進作用，會顯著促進其菌絲生長和次生代謝產物的合成[35]；但CoCl2·6H2O添加量過高時，反而抑制叢毛紅曲霉的菌絲生長。因此，叢毛紅曲霉固態發酵產MK時，CoCl2·6H2O添加量不宜超過0.05 mg/g。

2.2 固態發酵外源誘導物最優組合的響應面優化結果

2.2.1 響應面優化設計及結果分析

以ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O和Na2MoO4·2H2O 3種誘導物為試驗因素，基于Box-Behnken試驗設計，以MK產量為響應值，進行二次多項回歸方程擬合及分析，試驗設計及結果如表2所示。

表2 外源誘導物最優組合的響應面優化結果Table 2 The results of response surface optimization for the optimal combination of inducers

對數據進行多項式擬合回歸，得出二次多元回歸方程：Y=560.13-27.5A-22.22B+2.44C-36.96AB-20.29AC+30.87BC+28.92A2-95.43B2-23.92C2。同時，對回歸模型進行方差分析，結果如表3所示。

表3 響應面回歸模型的方差分析結果Table 3 The variance analysis results of regression model of response surface

由表3可知，擬合方程的P＜0.000 1，表明響應面的回歸模型達到了極顯著水平；失擬項P=0.244 8＞0.05，失擬不顯著，表明方程的擬合程度較好。因此，上述回歸方程可以用于準確分析和預測各因素與MK產量之間的關系。回歸模型的確定系數R2=0.980 4，說明該模型能解釋98.04%響應值的變化。因此，該模型擬合程度較好，能很好地反映響應值的變化，可以利用此模型對叢毛紅曲霉固態發酵的MK產量進行分析和預測。

此外，由回歸模型的方差分析結果（表3）可知，方程一次項中的A項、B項，交互項AB、BC項和二次項A2、B2、C2對叢毛紅曲霉MK產量的影響達到極顯著水平；交互項AC對叢毛紅曲霉MK產量的影響達到顯著水平。F值的大小能夠反映出各因素對MK產量的影響程度，根據F值可知，3種外源誘導物對叢毛紅曲霉MK產量的影響的大小順序為A（MnSO4·H2O）>B（Na2MoO4·2H2O）>C（ZnSO4·7H2O）。

根據回歸擬合方程，做每2個因素對MK產量影響程度的響應面三維圖，并對3組對比因素（AB、AC與BC）進行響應面模擬分析，結果見圖12。

圖12 各因素交互作用對MK產量的影響Fig.12 Interactive effects of variables on MK yield

如圖12所示，BC圖形的曲面向上凸起，表明了在兩因素的影響下，存在最大值。AB與AC的兩兩因素之間交互作用的顯著性較弱，而BC的兩兩因素間交互作用的顯著性較強。

2.2.2 外源誘導物最優組合的預測及驗證

通過回歸模型的預測，當MnSO4·H2O添加量為1.20 mg/g、Na2MoO4·2H2O 添加量為 1.00 mg/g、ZnSO4·7H2O添加量為2.80 mg/g，在此條件下，叢毛紅曲霉固態發酵的MK產量預測值為622.25 mg/kg。為驗證模型預測的可靠性，根據預測的3種外源誘導物最佳添加量組合，進行3次平行試驗，其MK產量平均為631.10 mg/kg，與預測的MK產量無顯著差異，說明響應面法優化得到的外源誘導物最優組合的參數可靠。

3 結論

該試驗研究了11種外源誘導物對叢毛紅曲霉固態發酵MK產量的影響。結果表明，在適當的添加量下，11種外源誘導物對叢毛紅曲霉的MK產量都有一定的提高效果，其中，ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O 和Na2MoO4·2H2O 3種誘導物對MK產量的提高效果最顯著，分別比對照組提高了1.4倍、1.1倍、1.3倍。響應面優化結果表明，外源誘導物的最優組合為1.20 mg/g MnSO4·H2O、1.00 mg/g Na2MoO4·2H2O 和 2.80 mg/g ZnSO4·7H2O，其 MK 產量可達 631.10 mg/kg，與回歸方程預測的MK產量無顯著差異。