SIRT-1、Beclin-1、LC3在宮頸鱗癌組織中的表達及臨床意義

王 艷，況 蕾，王 晴，武宸宇，張 蓓

宮頸癌是我國婦女常見的女性生殖道惡性腫瘤，具有發病率高、發現不及時、治療手段有限和預后差等特點。目前宮頸癌的具體發病機制尚不明確，多數患者與人乳頭瘤病毒(HPV)感染有關。越來越多的研究表明，自噬功能異常亦參與宮頸癌的發病[1]。自噬是一種常見的程序性死亡，是自噬溶酶體降解大部分胞質內容物的一種分解代謝過程。Beclin-1和LC3能夠分別參與自噬形成的最初階段和自噬泡的延長、閉合，是自噬活性的經典指標[2]。有研究發現，HPV-16 E6/E7能通過加速宮頸癌細胞起始階段的自噬通量來維持適當激活的自噬，即在癌變早期階段，HPV會反饋性上調細胞自噬活性，具有抑制細胞癌變的作用，而隨著腫瘤體積增大或病情進展，癌細胞增殖失控，血液供應不足，則可能通過啟動自噬適應環境，從而促進宮頸癌的發展[3]。沉默信息調節因子家族-1(SIRT-1)可通過啟動腫瘤細胞自噬，促進癌癥的發生和發展[4]。目前有關SIRT1、Beclin-1、LC3在宮頸鱗癌組織中的表達及臨床意義研究尚少，因而本研究擬探討上述指標在正常宮頸組織、宮頸上皮內瘤變(CIN)1級、CIN 2～3級以及浸潤性宮頸鱗癌標本中的表達情況并明確其與宮頸鱗癌患者臨床病理及預后的關系。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2014年8月—2015年8月徐州市中心醫院婦科行手術治療后經病理科存檔的標本患者為研究對象，包括正常宮頸組織、CIN 1級、CIN 2～3級及宮頸鱗癌組織各50例。其中正常宮頸組織取自因子宮肌瘤或其他非宮頸疾病行子宮全切術的住院患者。納入標準：組織病理學診斷明確；有剩余組織可供行免疫組化染色。排除標準：宮頸鱗癌患者術前接受放療、化療等治療；術后失訪；臨床或病理資料無法分析者。

1.2方法

1.2.1臨床資料收集：通過電子病歷系統收集宮頸癌患者的臨床和病理資料，包括年齡、國際婦產科聯盟(FIGO)分期、腫瘤分化程度(高分化、中低分化)、HPV-16/18感染狀態以及有無淋巴結轉移等。對所有患者行電話隨訪，隨訪終點為全因死亡，隨訪時間為從確診至出現終點事件或末次隨訪(2022年1月)的時間間隔。若患者失訪，則記錄末次隨訪時間和狀態為刪失數據。

1.2.2免疫組化檢測方法：將所有組織標本石蠟包埋、每個蠟塊4 μm厚連續切片，常規梯度乙醇脫水后行高溫下抗原修復。滴加3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性。加入兔抗人Beclin-1(Proteintech公司，11306-1-AP)、LC3 A/B(Affinity公司，AF5402)和SIRT-1(Affinity公司，df6033)，4 ℃過夜，滴加山羊抗兔IgG抗體-辣根過氧化物酶多聚體工作液，DAB顯色，封片和拍照。由2名經驗豐富的病理科醫師對切片獨立進行評估。采用半定量評分標準，對細胞染色比例及強度分別進行評估[5]。陽性細胞率≤5%、5%～25%、25%～50%、50%～75%和>75%分別記為0、1、2、3和4分。染色強度無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別記為0、1、2和3分。每張切片中至少選取10個高倍(400×)視野進行陽性細胞比例分析，每個視野中應至少計數100個細胞，根據其陽性細胞百分比進行評分。若染色強度得分×陽性細胞率得分<4分則判定為陰性，而≥4分則判定為陽性。

1.3觀察指標 觀察各組Beclin-1、LC3和SIRT-1免疫組化染色情況及與宮頸鱗癌臨床病理特征關系，分析上述指標之間的相關性及影響預后的相關因素。

1.4統計學方法 應用SPSS 22.0軟件分析數據。計數資料以率(%)表示，采用χ2檢驗。相關性采用Spearman相關性分析。宮頸鱗癌患者預后的影響因素應用單因素和多因素Cox回歸分析。α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1SIRT-1、Beclin-1及LC3在各類宮頸組織中的表達情況 在正常宮頸組織，SIRT-1多為陰性，而Beclin-1和LC3多為陽性。隨著CIN的發生及進展，SIRT-1陽性率逐漸增高，而Beclin-1和LC3的陽性率逐漸降低，SIRT-1、Beclin-1和LC3組間整體比較差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。正常宮頸組織、CIN 1級組織、CIN 2～3級組織和宮頸鱗癌組織SIRT-1、Beclin-1和LC3陽性表達情況見圖1。

表1 SIRT-1、Beclin-1及LC3在不同宮頸組織中的表達情況[例(%)]

2.2SIRT-1、Beclin-1和LC3表達與宮頸鱗癌臨床特征的關系 SIRT-1陽性率在年齡≥50組、FIGO Ⅲ～Ⅳ期組、中低分化組及淋巴結轉移組顯著升高，Beclin-1和LC3陽性率在FIGO Ⅰ～Ⅱ期組和無淋巴結轉移組顯著升高(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 SIRT-1、Beclin-1和LC3表達與宮頸鱗癌臨床特征的關系(例)

2.3宮頸鱗癌組織中SIRT-1與Beclin-1、LC3表達的相關性 宮頸鱗癌組織中SIRT-1與Beclin-1和LC3呈顯著負相關(r=-0.62、-0.57，P<0.001)。

2.4影響宮頸鱗癌患者預后的單因素和多因素分析 納入的50例末次隨訪時共33例(66.0%)死亡，中位隨訪時間30(23～42)個月。單因素分析表明，年齡≥50歲、FIGO Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移、SIRT-1陽性及Beclin-1陰性是宮頸鱗癌預后不良的危險因素(P<0.05，P<0.01)。見表3。Cox多因素分析表明，年齡≥50歲、FIGO Ⅲ～Ⅳ期和SIRT-1陽性是宮頸鱗癌患者預后不良的獨立危險因素(P<0.05，P<0.01)。見表4。

表3 影響宮頸鱗癌患者預后的單因素分析(例)

表4 宮頸鱗癌患者預后不良的危險因素Cox回歸分析

3 討論

SIRT-1本質上屬于脫乙酰酶，從組蛋白和非組蛋白中去除乙酰基是其主要生物學功能。此外，研究還表明，SIRT-1能夠通過調控眾多細胞內因子廣泛參與細胞的增殖、凋亡、衰老及新生血管生成等[6-7]。本研究結果顯示，SIRT-1在正常宮頸組織中表達較少，在CIN及宮頸鱗癌組織中表達明顯增加，表明SIRT-1上調可能參與了宮頸鱗癌的發生。張惠文等[8]證實，SIRT-1在正常宮頸、低級別CIN、高級別CIN及宮頸癌組織中的陽性率分別為0、15.38%、37.14%和40.00%，本研究結果與其報道相似。SINGH等[9]研究亦發現隨著宮頸病變程度的加重，SIRT-1的表達水平亦逐步上調。

SIRT-1與宮頸鱗癌組織分化程度低、FIGO分期高、淋巴結轉移及預后不良有關，提示其可能參與了宮頸鱗癌的組織分化、轉移等重要的病理生理學過程。WANG等[10]研究表明，SIRT-1表達與HPV-16 E7蛋白呈顯著正相關，敲除SIRT-1后宮頸癌細胞的增殖、遷移和浸潤能力顯著降低。另有研究表明，敲除SIRT-1后能夠誘導宮頸癌細胞凋亡，而其本身能夠抑制宮頸癌細胞對HPV的抵抗力[11]。

Beclin-1是自噬調控基因，能夠與Ⅲ型磷酸肌醇-3-激酶結合，形成能夠與多種蛋白質相互調節的核心復合體參與細胞自噬的調控。LC3分為LC-3A和LC-3B兩種亞型，前者于細胞質中常規表達，后者在細胞發生自噬時表達于自噬體膜上。有學者通過Western Blot方法證實Beclin-1和LC-3蛋白含量隨著宮頸CIN病變嚴重程度的增加而逐漸下降[12]，本研究結果與其一致。本研究發現，Beclin-1、LC-3與宮頸癌FIGO分期和淋巴結轉移有關，與CHENG等[13]報道結果一致。然而，ZHU等[14]報道Beclin-1、LC-3與FIGO Ⅰ～Ⅱ期宮頸鱗癌分化程度、淋巴結轉移等病理學特征無明顯相關性。本研究單因素分析發現，Beclin-1與宮頸癌患者預后不良有關，但是其在多因素分析中并無統計學意義，分析原因可能為本研究樣本量較少等因素導致。既往有大量文獻報道，Beclin-1和LC3等自噬相關蛋白表達水平與多種惡性腫瘤預后相關[15-17]，孟志英等[18]發現，Beclin-1陽性的宮頸癌患者生存期長于Beclin-1陰性者。因此未來有必要增加樣本量對Beclin-1與宮頸癌患者預后的關系作進一步探討。

綜上所述，隨著宮頸病變嚴重程度的進展，SIRT-1表達量明顯增加，而自噬相關蛋白Beclin-1和LC3表達顯著下降，三者與FIGO分期、淋巴結轉移等有關，且SIRT-1高表達與宮頸鱗癌預后不良有關。提示SIRT-1、Beclin-1和LC3在宮頸鱗癌的發生、進展、轉移中扮演重要的角色，可能作為評估宮頸鱗癌預后的生物學標志物。