肝硬化門靜脈高壓癥患者脾切除后早期血栓形成與Janus激酶-信號轉導和轉錄激活因子信號通路的關系

王 歡， 申曉旭， 陳良琪， 龔天蘭

貴州醫科大學附屬醫院 感染科， 貴州 550002

肝硬化門靜脈高壓癥指的是由于肝組織過度纖維化導致門靜脈系統壓力增加從而引發的一系列癥候群，是臨床肝硬化患者的常見病和多發病[1]。目前對于肝硬化門靜脈高壓的手術治療方式，主要為脾切除聯合賁門周圍血管離斷術[2]。而患者術后形成門靜脈血栓是肝硬化門靜脈高壓患者脾切除術后發生的嚴重并發癥之一。報道[3-4]顯示，患者術后門靜脈血系統血栓的發生率可高達22.2%～37.5%，但是由于大部分患者發生門靜脈血栓后早期臨床癥狀不明顯，導致患者治療不及時，治療效果不佳，從而可能危及患者生命安全。目前，關于患者術后發生門靜脈血栓的機制尚未闡明，研究患者術后門靜脈血栓發生機制，對于術后門靜脈血栓的預防和治療具有著重要價值。本研究探討分析肝硬化門靜脈高壓患者脾切除后血栓形成情況與Janus激酶-信號轉導和轉錄激活因子信號通路的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年3月—2020年4月在本院因肝硬化門靜脈高壓行脾切除斷流術患者198例作為研究對象，其中，男117例、女81例，年齡23～75歲，平均年齡(48.93±11.54)歲；BMI(22.97±3.16)kg/m2。乙型肝炎肝硬化患者135例、丙型肝炎肝硬化患者32例、酒精性肝硬化患者22例，原發性膽汁性肝硬化患者7例，特發性門靜脈高壓患者2例。

術后隨訪3個月，根據患者術后是否發生門靜脈血栓將其分為血栓組(n=41)和非血栓組(n=157)。采用彩超檢測門靜脈血栓情況，采用SIEMENS ACUSON S2000彩色多普勒超聲診斷儀，3.0～5.0 MHz寬頻凸陣探頭，清晨空腹左側臥位，于右上腹肋間斜切面監測門靜脈主干及分支血栓情況。所有患者均在術后1周、出院前行腹部彩超檢測，任何一次檢查出血栓均納入血栓組。

1.2 納入標準與排除標準 納入標準：(1)術前均經臨床診斷為肝硬化門靜脈高壓癥，且經胃鏡檢查證實患者存在食管胃底靜脈曲張，曲張靜脈直徑5 mm以上或可見紅色征(曲張靜脈表面出現鞭痕樣、櫻桃紅樣或血泡樣改變)時行試管靜脈套扎聯合胃底靜脈硬化劑注射；(2)消化道無出血史；(3)符合脾切除斷流術手術指征，包括脾功能亢進以及脾大引起的白細胞、血小板減低,食道靜脈紅斑，且術前評估可耐受手術治療；(4)肝功能Child-Pugh分級A～B級；(5)患者及其家屬自愿簽署知情同意書。

排除標準：(1)合并肝癌或其他惡性腫瘤患者；(2)術前合并凝血功能異常(包括凝血四項指標、血小板、血栓彈力圖異常)或術前已經有血栓形成；(3)由于其他原因需要進行抗凝治療患者；(4)術前合并機體重要器官功能障礙；(5)術后發生胰瘺、腹腔出血或合并嚴重感染等相關并發癥患者；(6)術后3個月內因非門靜脈血栓并發癥死亡患者。

1.3 方法

1.3.1 術后處理方法 患者均行脾切除術，且均由本院同一組手術醫護人員執行，于左肋緣下作切口切除腫大脾臟，離斷食管下段至少6 cm及以上半胃漿膜層全部血供，胃冠狀靜脈、左膈下靜脈以及胃短靜脈等，包括與上述血供靜脈伴行的同名動脈以及迷走神經干。用細線間斷縫合胃大下彎前后壁漿膜，使其漿膜化。

術后給予患者門靜脈血栓預防抗凝措施，包括術后12 h開始應用低分子肝素，200 IU/kg體質量/12 h皮下注射，連續注射5 d；進食后停用低分子肝素，改用口服華法林2.5 mg/d抗凝治療6個月，抗凝目標為：凝血酶原活動度50%～70%，國際標準化比值1.25～1.50。當術后血小板超過正常值上限后單用或者聯合使用抗血小板藥物治療，包括雙嘧達莫、阿司匹林以及噻氯匹定等，直至血小板恢復正常值后停止使用。

1.3.2 臨床資料收集 收集并記錄患者臨床資料，包括姓名、性別、年齡、肝功能Child-Pugh分級、是否為病毒性肝炎、靜脈曲張嚴重程度分級、術前內鏡下治療、是否合并門靜脈高壓性胃病、手術前后門靜脈直徑、手術前后門靜脈流速差、手術前后門靜脈壓力差、脾容量(經腹部B超檢查測量)、腹水量、手術時間、術中出血量、BMI、術后7 d血清C反應蛋白(CRP)、視覺模擬評分(VAS)。

1.3.3 JAK-STAT通路表達檢測 分別于術前1 d、術后7 d，抽取兩組患者清晨空腹靜脈血，采用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，采用Trizol試劑提取外周血單個核細胞中總RNA，并用紫外分光光度計檢測總RNA純度和濃度。按照逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，將逆轉錄后的cDNA儲存于-20 ℃冰箱內備用。引物由Invitrogen公司合成，引物序列為，JAK2上游引物：5′-TTCTACATGGGGGGATAG-3′，下游引物：5′-TAAGTATGGAAACCCTCTAA-3′；STAT3上游引物：5′-GGTTAGAACCCTACACGAAG-3′，下游引物：5′-CTACAGA GCCCACTATCCG-3′；β-actin上游引物：5′-CGTGGACATCCGCAAA GAC-3′；下游引物：5′-AAGAAAGGGTGTAACGCACT-3′。采用實施熒光定量PCR法進行檢測，反應條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共完成35個循環。以β-actin作為內參基因，采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達量。

2 結果

2.1 單因素分析 血栓組41例患者經治療后，血栓均消失。血栓組患者術前門靜脈直徑、術后門靜脈直徑、門靜脈流速差、脾容積均顯著高于非血栓組(P值均<0.05)(表1)。

2.2 兩組手術前后JAK-STAT通路表達 術后兩組患者外周血單個核細胞JAK2 mRNA及STAT3 mRNA相對表達量較術前顯著升高(P值均<0.05)，同時血栓組患者JAK2 mRNA及STAT3 mRNA相對表達量升高程度明顯高于非血栓組(P值均<0.05)(表2)。

2.3 多因素Logistic回歸分析 對上述比較具有統計學意義的各因素進行多因素logistic回歸分析，結果顯示，門靜脈流速差、術后JAK2 mNRA、術后STAT3 mRNA及術前門靜脈直徑為影響患者術后門靜脈血栓發生的重要因素(P值均<0.05)(表3)。

2.4 ROC曲線分析術后JAK2 mRNA、STAT3 mRNA對門靜脈血栓的預測價值 采用ROC曲線分析患者術后JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相對表達量對門靜脈血栓預測價值，結果顯示，ROC曲線下面積分別為0.850、0.787(表4，圖1)。

3 討論

肝硬化門靜脈高壓主要臨床表現為脾腫大以及脾功能亢進，同時伴有腹水、便血、嘔血等。目前對于肝硬化門靜脈高壓患者行脾切除的目的主要包括：改善脾功能亢進而引起的血小板減少，減少門靜脈血流、降低門靜脈高壓，改善食管胃底靜脈曲張，減少消化道再次出血傾向[5-6]。目前研究[7]顯示，對于肝硬化門靜脈高壓患者采取脾切除術治療，其臨床效果顯著，既能有效降低患者門靜脈壓力，又能有效糾正機體脾功能亢進狀態。

表2 兩組患者手術前后JAK-STAT通路表達

表1 單因素分析

表4 術后JAK2 mRNA、STAT3 mRNA對門靜脈血栓預測價值ROC曲線分析

圖1 ROC曲線分析術后JAK2 mRNA、STAT3 mRNA對門靜脈血栓的預測價值

血小板是血液的有形成分之一，有一定的形態和體積，是由骨髓巨核細胞質裂解而來的無核細胞，血小板可通過釋放凝血因子、黏附以及聚集等功能在止血過程中發揮重要作用[8-9]。對于肝硬化患者，由于脾功能亢進、脾臟腫大以及患者血液中存在抗性血小板抗體或抗巨核細胞抗體，而導致機體血小板數量減少，同時加之存在骨髓抑制從而引起血小板功能的減退[10-11]。而脾切除后，患者血液流變學可出現血液黏滯度增加，機體呈現高凝狀態，同時血小板可出現反跳性增高，因此患者術后容易出現門靜脈血栓等相關并發癥，對患者治療預后造成嚴重影響[12-13]。

血栓形成作為圍術期的常見并發癥之一，研究[14-15]認為，血栓形成是一個涉及多基因、多系統的過程，深入分析血栓形成相關基因及其調控途徑，對于及時診斷和有效治療血栓的形成具有重要意義。JAK/STAT信號通路是細胞因子信號轉導的重要途徑之一，該信號可將細胞膜感受到的信號直接傳遞至核內，從而激活靶基因的轉錄[16-17]。動物實驗[18]結果顯示，JAK/STAT信號通路參與大鼠術后深靜脈血栓的形成過程，認為JAK/STAT信號通路末端效應基因的異常表達，可調控血管內皮細胞功能而影響血管內皮細胞的凋亡和周期等，同時JAK/STAT信號通路可能通過氧化應激、炎癥通路等作用而促進術后深靜脈血栓的形成。關于肝硬化門靜脈高壓患者術后門靜脈血栓形成是否有JAK/STAT信號通路的參與，尚無相關研究報道。

本研究比較了可能影響患者術后血栓形成的各因素，結果顯示，除了術前門靜脈直徑、術后門靜脈直徑、門靜脈流速差、脾容積兩組比較具有差異外，研究可見兩組患者手術前后JAK/STAT信號通路主要基因JAK2 mRNA及STAT3 mRNA表達也出現了明顯變化。初步驗證了JAK/STAT信號通路可能參與患者術后門靜脈血栓的形成，與筆者推測結果一致。此外，通過多因素Logistic回歸分析顯示，術后JAK2 mRNA及STAT3 mRNA表達水平進入回歸模式，可能是影響患者術后門靜脈血栓發生的重要因素；此外，采用ROC曲線分析患者術后JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相對表達量對門靜脈血栓預測價值，結果顯示，ROC曲線下面積分別為0.850、0.787(P<0.05)。提示患者術后JAK/STAT信號通路的激活可能是門靜脈血栓形成的重要機制之一，術后JAK/STAT信號通路狀態可有效預測門靜脈血栓的形成，有望成為患者術后門靜脈血栓預防和治療的潛在生物學途徑，但是其具體的作用途徑和下游影響基因，還需要進一步研究深入探討分析。

倫理學聲明：本研究方案于2017年12月23日經由貴州醫科大學附屬醫院倫理委員會審批，批號：倫(審)2017-12-89。所納入患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：王歡負責課題設計，資料分析，撰寫論文；申曉旭參與收集數據，修改論文；陳良琪、龔天蘭負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。