膽汁酸代謝在原發性膽汁性膽管炎發病機制中的作用

賈皖婷， 劉曉曉， 邰文琳

昆明醫科大學第二附屬醫院 檢驗科， 昆明 650032

原發性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis,PBC)屬于膽汁淤積性肝病的一種，常在具有自身免疫遺傳易感性的中老年女性中發生。免疫細胞對線粒體丙酮酸脫氫酶復合體的E2亞單位(E2 subunit of pyruvate dehydrogenase complex，PDC-E2)失去免疫耐受性,導致靶向性膽道損傷,并且具有典型的血清學反應：抗線粒體抗體陽性[1]。以往PBC屬于罕見疾病,但近年來發病率逐年增高。2021年,一項針對自身免疫性肝病的流行病學調查[2]顯示,PBC的發病率從0.84/10萬到2.75/10萬不等，另有研究[3]顯示與其他國家相比,中國和日本的PBC患病率較高,然而目前PBC發病機制仍處于探索階段。自身免疫紊亂、膽汁淤積損傷是PBC肝內小膽管損傷的兩大因素，但膽管上皮細胞(biliary epithelia cells, BEC)的自身免疫紊亂是繼發于膽汁酸代謝紊亂，或者膽汁酸穩態破壞是繼發于自身免疫攻擊，仍然是懸而未決的問題[4]。毋庸置疑的是，膽汁淤積誘導的炎癥和纖維化在臨床上占主導地位[5]。因而PBC治療主要側重于改善膽汁淤積。基于PBC膽汁淤積的臨床特點以及膽汁酸代謝治療的優越性，現將PBC中膽汁酸代謝的研究進展介紹如下。

1 膽汁酸生理

膽汁酸是膽汁的重要有機成分,對其合成及轉運的嚴格調節是目前治療膽汁淤積性肝病的重要策略。通過經典和替代途徑在肝臟中直接合成的膽汁酸屬于初級膽汁酸，包括膽酸(cholic acid, CA)和鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid, CDCA)。CDCA和CA屬于游離型膽汁酸，疏水性高，容易自由通過細胞膜，對細胞造成毒性損傷。CDCA和CA會與甘氨酸和牛磺酸結合生成相應的結合膽汁酸以提高其水溶性。初級膽汁酸進入小腸后還會在腸菌的作用下脫氧生成次級膽汁酸：脫氧膽酸和石膽酸(lithocholic acid, LCA)及其結合膽汁酸。哺乳動物中,膽汁以初級膽汁酸、結合膽汁酸為主。膽汁酸的轉運需要眾多蛋白的參與，包括膽鹽輸出泵、多藥耐藥蛋白(multi-drug resistance protein, MDR)、腸細胞頂端鈉依賴性轉運蛋白、回腸膽汁酸結合蛋白、有機溶質轉運蛋白(organic solute transporter, OST)α/β、有機陰離子轉運多肽(organic anion transporting polypeptide, OATP)等，95%的膽汁酸都會經過轉運，在發揮其作用后再次回到肝臟，這就是能夠將膽汁酸利用最大化的腸肝循環。正常濃度范圍內的膽汁酸可以促進脂質的消化與吸收,溶解膽固醇,同時也是許多細胞內核激素受體和膜受體的天然配體,是調控肝細胞功能的關鍵信號分子。膽汁酸代謝物也具有重要生理功能，有學者[6-7]發現，石膽酸衍生物可以通過調節輔助性T淋巴細胞(Th)17和調節性T淋巴細胞的分化，來維持腸道免疫平衡。

2 參與膽汁酸代謝的受體

參與膽汁酸代謝的受體及其下游信號通路與PBC高度相關。膽汁酸代謝過程中的關鍵核受體有：法尼醇 X 受體(farnesoid X receptor, FXR)[8]、孕烷 X 受體(pregnane X receptor, PXR)、維生素 D 受體(vitamin D receptor, VDR)、過氧化物酶體增殖物激活受體 (peroxisome proliferators-activated receptors, PPAR)。參與膽汁酸代謝的膜受體主要有成纖維生長因子受體4和G蛋白偶聯受體(takeda G protein-coupled receptor 5，TGR5)。

2.1 法尼醇X受體(FXR) FXR是一種僅由膽汁酸激活的核激素受體,幾乎參與膽汁酸合成、轉運及吸收的全過程。目前被批準用于治療PBC的藥物：奧貝膽酸(obeticholic acid,OCA),其作用便在于可以高效激動FXR。FXR與膽汁酸結合后,會調節許多膽汁酸代謝相關分子，包括小異二聚體伴侶、成纖維細胞生長因子19 (fibroblast growth factor 19, FGF19)、膽鹽輸出泵、OSTα/β、細胞色素P450家族成員7A1(cytochrome P450 7A1, CYP7A1)等,從而有效維持膽汁酸代謝平衡。膽汁酸還可以通過FXR依賴方式抑制半胱氨酸的分解，調節肝臟對氧化損傷的敏感性[9]。FXR的缺失會導致總膽汁酸升高和肝臟損傷。在PBC患者的肝組織中，也觀察到FXR mRNA水平的降低[10]。這些現象說明，FXR改變參與PBC的發生發展，FXR可以成為控制PBC膽汁酸代謝紊亂的關鍵靶點。

2.2 過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR) PPAR是一種核激素受體，其抗膽汁淤積特性主要與其調節膽汁酸合成、轉運和解毒的作用有關,并具有一定的抗炎特性。3種 PPAR亞型 PPARα、PPARβ/δ 和 PPARγ被不同基因編碼，并在代謝活躍的組織中差異表達。其中PPARα主要在肝細胞上表達，PPARα激活可以減少膽汁酸流入膽道，增加膽汁酸由肝臟流向門靜脈，抑制膽汁酸合成[11]。PPARα 介導的多種酶的上調還可以促進膽汁酸的解毒,包括 CYP3A4、UDP 葡萄糖醛酸基轉移酶家族和磺基轉移酶 2A1,它們與有毒的疏水性膽汁酸結合,增強其溶解度,促進膽汁酸的尿液和糞便排泄。PPARα還誘導MDR3的表達,它使磷脂酰膽堿轉運穿過小管膜,磷脂酰膽堿的小管排泄增加,保護BEC免受膽鹽刺激和隨后膽汁淤積性損傷。PPARδ因其在肝細胞、膽管細胞、Kupffer細胞和肝星狀細胞上的分布的獨特性,被認為具有調節PBC中膽汁淤積、炎癥和纖維化損傷的潛力[12]。一種對PPARδ有高選擇性的強效激動劑：seladelpar，正在進行Ⅲ期臨床試驗,該藥除了調節肝細胞膽汁酸合成外,還可通過膽管細胞上的轉運蛋白調節膽汁酸的吸收和分泌[13]，在seladelpar治療1年后對PBC患者進行評估，可以發現患者癥狀負擔和生化反應均得到持續改善[14]。因此，PPAR激動劑具有調節PBC膽汁淤積的特性，并且這種特性引起了人們對利用該途徑進行藥物開發的興趣。

2.3 孕烷X受體(PXR) PXR在肝臟、腸道和腎臟中高度表達,主要參與解毒。當它被激活時,會與維甲酸X受體形成異二聚體,并調節在膽汁酸代謝以及外源性藥物解毒中起重要作用的基因的轉錄,增強毒素溶解度并促進膽汁排泄。PXR在膽汁酸代謝中的主要作用是幫助膽汁酸解毒和溶解，以及通過上調MDR1和 多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance-associated protein , MRP)調節膽汁酸流出[15]。用富含膽固醇和膽酸的飲食喂養PXR缺失小鼠,會出現與肝炎和肝細胞損傷有關的高病死率[16],這說明PXR參與膽汁酸代謝，并具有保護肝臟的作用。目前已有以PXR為靶點的PBC治療方案，例如使用PXR激動劑利福平，可有效治療PBC患者的瘙癢問題[17]。PXR的另一配體維生素K，因其在肝內膽汁淤積中的作用，在中國已被用作治療膽汁淤積性肝纖維化，在日本也被用于治療PBC患者的骨質疏松癥，但維生素K 在膽汁淤積相關疾病中的應用仍存在爭議[18]。

2.4 維生素D受體(VDR) VDR是腸道膽汁酸感受器的一種，是次級膽汁酸LCA的受體。VDR激活會抑制 Th1細胞因子產生、促進 Th2細胞因子產生[19],從而減少對效應T淋巴細胞的應答，抑制炎癥反應。VDR的激活還會誘導CYP3A在體內的表達，對肝臟和腸道中的LCA起到解毒作用。一項來自中國的薈萃分析[20]顯示，VDR ApaI基因多態性與PBC風險相關，尤其是在亞洲人群中。另有研究[21]發現，在PBC中，VDR顯著降低，并提出由此導致的VDR信號通路的減少可能在PBC的發病機理中起重要作用。因為該受體的激活與抗炎[22]、抗膽汁淤積和抗纖維化作用有關，所以被認為是PBC的一個潛在靶標。

2.5 參與膽汁酸代謝的膜受體 膽汁酸調節也通過膜結合受體發生。例如, 成纖維生長因子受體4與FGF19結合,抑制CYP7A1介導的膽汁酸合成。TGR5是第一個確定的膽汁酸特異性細胞表面受體, 是CDCA和LCA的天然配體,激活TGR5可具有抗炎效果，因為激活TGR5可以抑制Kupffer細胞產生的促炎細胞因子。TGR5激活還可促進膽管細胞分泌HCO3-，維持BEC堿性保護傘，防止膽管破壞。利用TGR5-/-小鼠還發現，參與膽汁酸合成和轉運的各種酶和蛋白質的肝臟mRNA表達在TGR5-/-中高于野生型小鼠，尤其是膽汁酸合成中的限速酶CYP7A1[23]，表明TGR5對膽汁酸合成及轉運均具有調控作用。結合TGR5的抗炎作用、對BEC的保護作用，以及其調控膽汁酸代謝的作用，有理由認為TGR5是PBC發病機制的重要一環。

3 膽汁酸代謝參與PBC發病

在PBC中，膽汁酸合成及代謝失調已被證實[24]。PBC患者的膽汁酸代謝特點主要有：(1)伴隨疾病進展，膽汁酸水平逐漸增加[25]；(2)PBC 患者血清和糞便膽汁酸成分發生改變[26]；(3)PBC患者參與膽汁酸代謝的轉運體和核受體存在異常表達和位移。

目前認為，陰離子交換器2(anion exchanger 2, AE2)缺陷是促成膽汁酸代謝變化的主要原因之一,AE2是一種位于BEC頂膜的Cl-/HCO3-交換體,它可以將HCO3-泵出細胞，而膽汁 HCO3-的分泌將會產生管腔堿性“傘”，避免非極性疏水膽鹽單體的質子化，防止膽汁酸侵入膽管細胞并誘導細胞毒性。研究[27]表明PBC患者肝臟和外周血單核細胞標本中的AE2 mRNA水平降低。免疫組織化學研究[28]表明PBC小葉間BEC頂膜的AE2染色減少,證實了PBC患者中AE2表達缺陷。AE2缺失會使HCO3-分泌不足,BEC堿化不足, 細胞內pH升高,這不僅會導致BEC對疏水性膽汁酸的防護作用受損,還會使膽汁堿化降低,膽鹽極性不滲透膜的形式遭到破壞,有毒膽汁酸滲透到BEC內，誘導BEC凋亡，引發膽汁淤積。AE2基因敲除小鼠中可以觀察到PBC患者的大多數癥狀,例如抗線粒體抗體升高,IgM水平升高,免疫調節紊亂,進行性膽汁淤積和非化膿性膽管炎。熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)和糖皮質激素聯合治療可以提升肝內AE2表達并改善肝內膽汁淤積,這些現象均證明AE2表達減低參與PBC致病機制。研究[29]發現，AE2的降低與表觀遺傳學有很大關系。miR-506在PBC肝臟中顯著上調，并集中表達在肝內膽管細胞，且miR-506與人類特異性 AE2-UTR-3′ mRNA 的部分序列互補,表明miR-506是導致AE2下調直接因素。miR-506在膽管細胞中的過表達會減少AE2的表達和活性,導致PDC-E2的過表達,損害線粒體能量代謝并促進氧化應激、內質網應激和膽汁酸誘導的細胞凋亡[30]。而miR-506基因恰恰位于X染色體上,這可能與女性在PBC中占主導地位有關。此外，在PBC中增高的疏水性膽汁酸也會抑制BEC中AE2的表達[31]。可見,AE2下調導致膽汁淤積，膽汁淤積又會進一步抑制AE2表達，促進PBC的發生發展。

PBC患者肝臟中參與膽汁酸代謝的轉運體和核受體的表達及定位異常主要與遺傳、膽汁淤積條件下作出的適應性改變有關。與正常肝臟相比，PBC肝臟中，將膽汁由門靜脈重吸收入肝的 NTCP、OATP1B1和OATP1B3表達下調[32]，將膽汁排出肝細胞的MRP3表達上調，OSTα/β 在正常肝細胞中不表達或低水平表達，在PBC患者中上調，這些變化可能與膽汁淤積情況下細胞作出的適應性改變有關，除了PBC患者膽汁酸轉運體表達發生改變外，在 PBCⅢ期中也觀察到了MRP2定位發生改變[32]，而這種變化可能與PBC即將發生黃疸相關。PBC患者膽汁酸轉運體和核受體表達變化除了與患者膽汁淤積情況下造成的適應性改變有關外，還與遺傳和表觀遺傳因素有一定關系，研究發現,在PBC患者中,參與膽汁酸代謝的基因存在一定改變。對315例日本PBC患者11個候選膽汁酸合成相關基因進行單核苷酸多態性分析,發現CYP7A1及其轉錄激活因子基因變異可能導致膽汁酸合成增加,淤積于肝臟,最終導致PBC進展[33]。在以往功能未知的MPR9最近也被發現其基因突變可能與膽汁淤積性肝病有關[34]。miR-21下調也參與PBC膽汁酸代謝紊亂,通過微陣列技術發現PBC患者的miR-21升高[30], miR-21會下調FXR和一些關鍵的膽汁酸轉運蛋白,進而導致膽汁酸代謝紊亂[35]。

腸道微生物也被證實參與PBC膽汁酸代謝改變[36-37]，主要在于對膽汁酸組成成分的改變。肝臟和腸道依靠腸肝軸進行雙向交流，而膽汁酸是雙方交流的必要介質。腸道微生物群通過調節代謝和免疫反應在膽汁淤積性肝病的發病機理中起重要作用，然而，疾病的進展也可能影響腸道微生物群的組成，從而加劇膽汁淤積的進展,由此提出膽汁酸-腸道微生物群-膽汁淤積的三角形致病模型[38]。已經發現PBC患者的腸道通透性增加，細菌易位，菌群組成發生改變。脂磷壁酸，一種革蘭陽性菌細胞壁成分，在PBC患者血清中增加，說明PBC患者腸道通透性增加[39]。一項中國橫斷面研究[40],將79例未接受過治療的PBC患者的腸道微生物譜與114例健康對照者的腸道微生物譜進行了比較,報告了12個屬的物種豐富度改變與PBC強相關；此外,通過分析這12個屬,可以識別疾病狀態,這表明PBC具有獨特的微生物組特征。在這樣的條件下，一項來自中國PBC患者的研究[26]表示，PBC患者表現出從初級到次級以及從結合膽汁酸到非結合膽汁酸的轉化減少，被認為可能是由于微生物代謝功能失調導致脫羥基失敗。正是由于對PBC中存在膽汁酸與腸道微生物相互作用的理解，馬雄團隊[41]表示，膽汁酸-微生物相互作用可能是治療PBC的一個方向。對PBC膽汁酸譜的研究將有助于對PBC進行診斷和分級，以及對PBC發病機制有進一步理解。

4 膽汁酸代謝參與PBC治療

4.1 UDCA UDCA是首個被美國食品藥品監督管理局批準的,用于所有診斷為PBC患者的一線藥物。研究[42]證明UDCA可有效改善患者病死率和肝移植率,并且該益處與患者性別、年齡、疾病階段無關。但仍有大約40%的PBC患者對UDCA的生化反應欠佳，有學者[43]采取聯合免疫抑制治療以提高臨床療效。UDCA是一種親水性二羥基膽汁酸,來源于CDCA在結腸中細菌的7β差向異構化作用,并通過結腸黏膜被動吸收進入循環膽汁酸池。UDCA增加了膽固醇向膽汁酸的代謝轉化,并降低了膽汁脂質中的膽固醇分數。目前已經提出幾種UDAC治療PBC的作用機制,包括用外源性UDCA富集親水性膽汁酸池,替代在膽汁淤積環境中積累的內源性疏水性有毒膽汁酸；通過上調BEC表面的AE2表達形成碳酸氫根保護傘；通過減少主要組織相容性復合體Ⅰ類和Ⅱ類蛋白的肝細胞及膽汁表達進行免疫調節,減少適應性免疫介導的損傷；此外,UDCA誘導肝組織中的一氧化氮合酶并以S-亞硝基谷胱甘肽的形式促進MRP2介導的小管分泌一氧化氮,對BEC表現出有效的抗凋亡作用。

4.2 奧貝膽酸(OCA) 膽汁酸作為FXR激活劑,其活性強度取決于疏水的類固醇核心和類固醇周圍的極性羥基之間的平衡,膽汁酸疏水性越強,激動FXR的能力就越強。與疏水性CDCA(一種有效的FXR活化劑)相比,其親水性差向異構體UDCA幾乎沒有FXR活性。OCA的開發是通過對CDCA進行修飾,在碳6上引入一個額外的乙基,使其疏水性提高,從而使OCA對FXR的激動作用是CDCA的100倍。目前OCA屬于PBC治療的二線藥物,會在患者對UDCA反應不佳的情況下使用。使用小劑量OCA便可明顯改善PBC生化膽汁淤積[44]，并且OCA可以增加PBC患者結合膽汁酸從肝細胞向膽管的轉運，使肝細胞暴露于潛在的細胞毒性膽汁酸的時間減少[45]，OCA Ⅲ期臨床試驗數據分析表明，在UDCA治療無效的患者中應用OCA，其ALP、ALT和膽紅素水平較對照組均有顯著下降，表明患者膽汁淤積現象得到改善[46]。但OCA也有一些缺點難以克服，膽汁酸FXR激動劑遵循內源性膽汁酸的腸肝循環,其固有的藥代動力學和藥效學特征與肝臟和腸道中膽汁酸代謝的變異性以及潛在的肝功能相關[47]，這可能會限制OCA的治療效果。其次，包括OCA在內的第一代FXR激動劑,由于其類固醇疏水核心的存在,導致其水溶性差,因此在親脂性配體結合位點的生物利用度差(<10%)。并且有研究[48]提出，使用OCA與肝臟失代償增加有關，這可能與OCA是FGF19的誘導劑，而FGF19是一種與肝細胞癌發生相關的生長因子有關。臨床上發現OCA給藥出現瘙癢，這可能與OCA除了靶向FXR外,還靶向了TGR5有關,因此,提高OCA對FXR的選擇性可能對減輕這種不利影響尤為重要。由于以上原因，非甾體類FXR激動劑目前正在被開發，其中Tropifexor表現出對肝功能損傷患者的良好耐受性[49],已經進入PBC患者的Ⅱ期臨床試驗，結果表明Tropifexor可以有效改善生化水平，并降低瘙癢。

4.3 貝特類藥物 貝特類藥物是PPAR的有效激動劑，非諾貝特被歸類為PPARα激動劑，苯扎貝特被認為是對三種同工型具有相似親和力的泛PPAR激動劑，其中苯扎貝特更多用于PBC治療。目前貝特類藥物僅被美國食品藥品監督管理局批準為降脂劑,但其在降低膽汁淤積的血清生化標志物，即ALP和GGT水平方面的作用已有數十年的報道。一項納入11個研究的薈萃分析[50]表明,與單獨使用UDCA相比,苯扎貝特聯合治療可改善肝臟生化指標和瘙癢,但在癥狀或全因病死率方面未發現統計學差異,因此，苯扎貝特常被用作對UDCA反應不良時的聯合治療藥物。除前文提到的seladelpar外，elafibranor(一種雙PPARα/δ激動劑)也在治療PBC中表現出很大潛力，一項Ⅱ期臨床試驗研究[51]表明，elafibranor通常安全且耐受性良好，可以有效改善患者ALP、膽紅素等生化指標。在接受貝特類藥物治療的患者中報告的不良事件有肌痛、血清轉氨酶水平升高、肌酐水平升高。血清轉氨酶升高可能與轉氨酶產生基因的誘導有關,而不是真正的肝毒性,肌酐水平上升可能與肌肉產生的肌酐增加而不是腎小球濾過率降低有關。在使用貝特類藥物的過程中需要注意,貝特類可以取代白蛋白中的華法林并延長凝血酶原時間,因此建議減少華法林劑量[52]；使用貝特類藥物可導致對他汀類藥物毒性的敏感性增加,建議在接受貝特類藥物的患者中更密切地監測這種毒性[53]。非諾貝特和鈣調神經磷酸酶抑制劑之間的相互作用會增加腎毒性的風險,因此必須密切監測腎功能。秋水仙堿與貝特類藥物同時使用會帶來橫紋肌溶解的風險[54]。即使貝特類藥物是一種有希望的輔助治療,但國際上仍未批準用于治療PBC患者,其在失代償期肝病患者中的應用還未得到充分研究。盡管如此，仍然能看到該類藥物在治療PBC中的可能性。

5 結語

綜上所述，膽汁酸代謝變化參與PBC疾病發生發展的始終,miR-506在PBC中的上調使AE2缺陷，導致BEC堿性屏障受損,毒性膽汁酸滲透BEC造成BEC損傷和抗原PDC-E2的暴露。腸道微生物菌群與膽汁酸相互作用，在疾病狀態下，由于腸道屏障的破壞，細菌易位，組成結構發生改變，隨之影響著膽汁酸成分的變化和肝臟炎癥反應。加之膽汁酸代謝過程的關鍵受體FXR、PXR、VDR等表達減少,限速酶CYP7A1表達增多,這些因素共同促進了PBC膽汁淤積的發生。維持膽汁酸代謝平衡對于治療PBC具有重要價值。目前PBC的發病機制還未完全闡述清楚,但目前的研究證據可以說明PBC是在“多重打擊”下發生的，從膽汁酸代謝角度出發,聯合免疫學角度,將有助于為PBC的發生發展提供新觀點。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：賈皖婷負責文獻查找、閱讀及文章撰寫；劉曉曉對研究思路有關鍵貢獻；邰文琳負責文章修改。