基因編輯豬用于急性肝衰竭治療的路徑探討

淮國麗， 杜嘉祥， 潘登科

1 電子科技大學附屬醫院， 四川省醫學科學院·四川省人民醫院， 臨床免疫轉化醫學四川省重點實驗室， 成都 610072；2 成都中科奧格生物科技有限公司， 成都 610094

對于肝細胞癌或急性肝病等終末期肝病患者，肝移植是唯一的治療方式，但是供體的極度短缺嚴重影響了等待移植者生命的延續。近五年來，我國器官捐獻率有所上升，但是供肝和移植需求的比例仍嚴重失衡。2020年，我國共有17 897例患者接受移植，但是僅占等待移植患者的5%左右，這意味著有近95%的患者可能因為等待期間病情惡化等因素錯過移植機會或者被移出等待名單[1-2]。利用豬來源的供體肝和肝細胞被認為是潛在的解決器官緊缺問題的有效方案。1968年，Calne 等[3]首次嘗試野生型豬-非人靈長類動物的異種肝移植實驗，術后6～30 h內，7只狒狒中有4只死于大量出血，考慮其主要的死亡原因是超急性排斥反應(hyperacute rejection，HAR)。α-1,3-半乳糖苷轉移酶(α-1,3-galactosy transferase，GGTA1)的敲除(GTKO)使HAR問題基本被解決，但是移植物仍無法長期存活[4]。目前，研究者認為影響異種肝移植存活率的主要原因包括：移植物血栓性微血管病(thrombotic microangiopathy，TMA)，持續性血小板減少癥和全身性消耗性凝血功能障礙，且伴隨的體液和細胞介導的免疫排斥反應影響細胞肝移植物的長期生存[5]。此外，由于肝臟是一個具備合成功能的特殊器官，供體與受體的不相容性也會影響移植物的存活，因此，探索適用于異種肝移植的人源化肝臟也是解決異種肝移植問題的一個思路。根據影響異種肝移植術后影響移植物存活的因素，本文將從基因編輯豬和嵌合體2個角度進行綜述，并展望基因編輯豬和嵌合體豬在未來異種肝移植的臨床應用。

1 應對固有免疫的基因改造

1.1 HAR 從1968年Calne 等實施第1例野生型(WT)豬到非人靈長類動物的異種肝移植后的20年內，一些研究團隊完成了幾十例WT豬到非人靈長類動物的異種肝移植實驗。然而，受體的存活時間從未超過3 d，移植后均發生HAR，并且發現受體內出現內皮細胞損傷以及IgM、IgG和C3的沉積，受體的血管有血栓形成和出血性壞死等現象，由此推斷野生型豬作為供體很可能會造成移植失敗[3,6-8]。在2000年，Ramirez等[9]實施了第1例以表達衰減加速因子(CD55)的轉基因豬為供體，對狒狒進行原位異種肝移植，狒狒存活8 d并且肝移植物未表現出HAR的病理學特征，提示CD55可顯著限制補體活化并有效控制HAR強度。2005年，該團隊在供體豬內又轉入人補體調節蛋白-MAC抑制蛋白(CD59)和α-1,2-巖藻糖轉移酶(H-transferase)，將CD55/CD59/H-transferase供體肝移植至狒狒體內后，發現供肝未出現明顯的HAR且肝臟結構完整，但存活時間僅延長了13～24 h。以上基因編輯豬雖然對HAR有所改善，但并未實現延長移植物的存活時間[10]。隨后，大量研究發現供體豬的特異性抗原包括α-Gal才是導致HAR的主要因素。2010年，Esker等[11]首次使用α-Gal敲除(GTKO)且表達人膜輔因子蛋白(CD46)的小型豬作為供體開展異種肝移植，受體術后雖然出現了嚴重的血小板減少癥，但肝功能正常，且生存時間延長至7 d。

以上敲除GGTA1可有效改善HAR的發生，移植物的生存時間仍未明顯改善，有研究團隊嘗試獲得包括α-Gal抗原以內的抗原雙敲或者三敲豬來作為供體來改善豬和人的不相容性。Butler等[12]通過體外檢測發現胞苷單磷酸-N-乙酰神經氨酸羥化酶(CMAH)聯合GGTA1敲除即GGTA1-/-CMAH-/-豬肝竇內皮細胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)比GGTA1-/-與人血小板結合更少，提示抗原雙敲除比單敲除更能抑制體液免疫反應。此外， Cimeno等[13]利用體外灌注模型研究發現基因型為GTKO/hCD46/Neu5GcKO的豬肝，相較于GTKO/hCD46基因型而言，白蛋白表達水平更高，提示Neu5GcKO表型可降低抗原特異性，對移植物具有保護作用。盡管如此，有學者[14]認為GTKO和CMAHKO 雙敲豬仍不足以實現延長移植物的存活率。此后，Li等[15]利用CRISPE/CAS9技術敲除了永生化豬內皮細胞中4個主要異種抗原GTKO、CMAH、β-1,4-N-乙酰半乳糖胺基轉移酶(B4GALNT)和SLA-Ⅰ，在體外觀察人對抗原敲除豬的特異性反應，結果顯示，這4個抗原的敲除可以顯著降低豬細胞的抗原性，但是仍能激活人的自然殺傷細胞反應。

綜上所述，通過基因編輯技術對供體豬GGTA1、CMAH、β4galNT2和SLA-Ⅰ進行抗原雙敲除乃至多敲除可以降低異種肝移植的異種特異性反應，但若聯合人體調節補體蛋白的轉入包括CD46，CD55和CD59，異種肝移植術后排斥反應等引起的肝移植物損失可能會大有改善。但異種肝移植后的血小板減少癥等問題還需要通過其他相關基因的編輯來緩解，由此才能更進一步實現延長移植物生存時間的期望。

1.2 血小板減少癥 目前，豬到非人靈長類動物的異種肝移植試驗結果表明，異種肝移植術后的受體會很快出現移植物TMA，持續性血小板減少癥和全身性耗竭性凝血功能障礙，而這些問題也是影響異種肝移植存活時間的主要原因。所以，針對固有免疫細胞介導的血小板吞噬作用以及凝血相關蛋白激活的凝血級聯反應等問題，可以利用基因編輯技術對供體豬進行改造，來改善異種肝移植術后移植物丟失問題[1]。

在豬-非人靈長類動物的異種肝移植中，非人靈長類動物血小板會被豬肝移植物識別為“外來物”，并被豬 Kupffer細胞和LSEC吞噬[16]。CD47是一種在所有組織中普遍表達的Ig超家族的整合素相關蛋白，其與巨噬細胞和中性粒細胞表達的信號調節蛋白α結合，將Src同源區2蛋白酪氨酸磷酸酶1募集到磷酸化的免疫受體酪氨酸相關的抑制性基序，印上能夠調節自我吞噬的抑制信號(“不要吃我信號”)，該信號可減少巨噬細胞介導的調理細胞吞噬作用[17]。潘登科團隊[18]成功制備GTKO/hCD47巴馬小型豬，并驗證了hCD47的轉入可以減弱異種移植中由受體巨噬細胞引起的排斥反應。Zhang等[19]將GTKO/hCD7豬的肝臟移植到藏酋猴中，發現異位輔助移植后受者血流量穩定，受體沒有出現嚴重的凝血障礙或免疫排斥反應。由此可知，將人CD47在豬內皮細胞上的異位表達可以顯著減少人類巨噬細胞對異種細胞介導的吞噬作用。此外，Paris等[20]發現異種肝移植在數分鐘至數小時后會發生血小板減少癥，主要是由于豬LSEC識別并結合半乳糖b1-4N-乙酰基葡萄糖胺(Galb1,4-NacGlc)糖蛋白通過去唾液酸糖蛋白受體1(recombinant asialoglycoprotein receptor 1，ASGR1)介導發生結合和吞噬血小板，通過去唾液酸糖蛋白處理消除這種糖蛋白可降低血小板的吞噬作用。2015年，該團隊使用TALEN技術敲除供體豬的ASGR1基因，結果顯示ASGR1-/-豬肝臟在灌注期間吞噬的人血小板數少于家豬肝臟，說明供體豬ASGRI基因敲除可減少豬-人異種移植中血小板的吞噬，這對于異種肝移植中移植物的存活至關重要[21]。2016年，潘登科團隊[22]成功制備出GTKO/ASGR1KO五指山小型豬，為解決異種肝移植后的血小板減少癥這一問題提供了良好的基礎材料。

除了排除固有免疫細胞介導的吞噬作用，還可以改造與凝血功能有關的基因位點來改善異種肝移植后的凝血功能障礙等問題。組織因子(tissue factor，TF)是異種肝移植誘導的耗竭性凝血病的主要驅動因素，而TF途徑抑制因子(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)可抑制TF活性。Ahrens等[23]研究證實，與WT豬相比，TF的siRNA敲低豬的凝血時間顯著增加，血栓形成減少。據報道[24]，竇科峰院士團隊指出表達人TFPI的豬在臨床前試驗中已經出現了令人期待的結果。Pen等[25]體外檢測了原代細胞對狒狒或豬血小板的聚集能力，發現豬LSEC對狒狒小板的吞噬作用最為明顯，通過阻斷vWF和整合素黏附途徑可以阻止血發現小板聚集和吞噬作用。除此之外，向豬體內轉入人血栓調節蛋白(human thrombomodulin，hTM)細胞可以在體外顯著增強人活化蛋白C的表達[25]，但是來自hTM轉基因豬的器官在肝臟中的表達最低，需要進一步優化豬肝臟中的hTM表達來評估這個基因改造對肝異種移植的作用[26]。此外，多項研究表明還可以通過表達人類抗血栓或抗凝基因例如CD39[27]、內皮蛋白C受體(hEPCR)[28]來減輕凝血級聯激活引起的凝血功能障礙，提高異種移植的存活率。

通過對供體豬進行特定分子的改造可以減輕異種肝移植術后面臨的急性排斥反應以及血小板減少癥和TMA等凝血功能障礙等問題。為了改善豬移植物和人類免疫系統之間的免疫和生理分子不相容性，延長移植物的存活時間，可以通過單獨或聯合多種豬特異性抗原表位敲除、敲入人補體調節蛋白和凝血調節相關因子蛋白來開發基因工程豬[29]。2020年，竇科峰院士團隊開展了13基因改良豬到恒河猴的異種肝移植試驗，供體豬基因型為PERV-KO/GalT-KO/b4GalNT2-KO/CMAH-KO/hCD46/hCD55/hCD59/hb2M/hHLA-E/hCD47/hTHBD/hTFPI/hCD39(PERV-KO/3-KO/9-TG)，移植物術后存活26 d，該研究驗證了13基因豬可以抑制異種移植排斥和受體凝血異常，但此9基因的摻入并未完全避免異位輔助肝移植對異種移植物的損害[24]。此外，Cimeno等[13]通過體外灌注模型發現 ，GalTKO/hCD46/Neu5GcKO比GTKO/hCD46/hCD55/hEPCR/hTFPI/hCD47的豬肝的白蛋白表達水平更高。上述研究提示，雖然選擇聯合多種基因組合可以改善移植物的存活，但是基因組合并不一定是越多越好。因此，篩選較優的基因型組合非常重要。此外，Shah等[30]利用無pCMV的GTKO豬作為供體，并給予外源性人體凝血因子和共刺激阻滯劑調整抑制劑方案，術后受體未出現排斥、炎癥或TMA，且實現了移植物存活時間長達29 d，這無疑為未來加速肝移植走向臨床應用提供了一個有效的治療思路。

2 人源化肝臟嵌合體豬

免疫排斥是異種移植中現存的主要障礙，但這主要針對功能性單一的器官，如本身承載較少的代謝和分泌的心臟、腎臟等[31]。而對于具有復雜性功能的器官，如肝臟、肺臟等，為實現移植物的長期存活，除了解決免疫排斥問題外還需對其他功能性基因進行人源化改造。目前的基因工程技術雖已取得一些突破性進展，但一次性定向改造所有基因仍是一項極具挑戰的研究工作。目前，在豬體內培育人源化器官是一種較為可行的解決方案。

根據目前的研究，已經可以制備物種相近的嵌合體動物。2010年，美國和日本的研究團隊[32-33]完成了大小鼠嵌合個體的制備，并成功在小鼠體內培育出大鼠的胰腺。但目前可成功培育物種差異大的嵌合個體較少。2017年，美國研究團隊[34]開展了豬人嵌合體胚胎實驗，觀察時間為3～4周，結果表明人細胞占比約為1/100 000。2019年，我國研究團隊[35]成功制備了2只豬猴嵌合體，新個體中嵌合的藏酋猴細胞比例為1/10 000～1/1000，雖然該比例仍很低，但這標志著嵌合體研究的巨大進步。即便異種嵌合體研究的目的是服務于人，且可以解決器官資源短缺問題，但仍會受到倫理道德的約束。例如在歐美部分國家，人體器官的嵌合體研究是被允許的，但在人與動物的嵌合體中，人細胞不能進入到動物的生殖系統和大腦中[36]。為了避免以上問題，可通過影像學結合手術的方式，對胚胎期仔豬的肝臟部位定向注射人源干細胞，由于人源干細胞提前轉入了條件性自殺性基因，在進入其他組織時人源干細胞將會啟動自殺程序，可以防止在非肝臟部位形成嵌合體[37]。

目前，嵌合體發育遇到的主要障礙是不同物種細胞間不能很好地形成免疫耐受，這一問題可通過培育免疫缺陷動物來提高嵌合比例。白介素受體亞基γ(interleukin 2 receptor subunit gamma，IL2RG)、重組激活基因(Recombination activating gene，Rag)1和Rag2是激活特異性免疫的關鍵基因，敲除后個體表現為T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞缺失且缺乏補體活性，通過這種方式可以獲得一種重度免疫缺陷個體[38-39]。由于免疫缺陷動物的培育還需要在無菌環境下結合剖腹產手術完成，特別是臨床級別的醫用供體豬制備，所以此手術需在無指定病原體(designated pathogen free，DPF)超潔凈級設施內開展。此外，對肝臟先天性損傷的豬胚胎進行人干細胞嵌合，能夠在豬體內制備人源化肝臟。延胡索酸乙酰乙酸水解酶基因(fumarylacetoacetate hydrolase，FAH)的缺失將導致肝細胞中酪氨酸的毒性代謝產物無法正常代謝，持續性積累會引發肝損傷，造成Ⅰ型遺傳性酪氨酸血癥[40-41]。但在沒有干預措施下，FAH基因敲除豬在妊娠期間即會導致胚胎致死，因此需要依賴特定的藥物才能保證出生和存活。

綜上所述，利用基因編輯技術在無菌環境下制備的GTKO/FAHKO/Rag2KO/IL2RGKO小型豬可以作為直接培育人源化器官的來源，這種方式也是解決異種肝臟移植物不能長期存活的一種可行方案。然而，培育人源化肝臟嵌合體豬是異種肝移植的技術高地，存在嵌合細胞占比低等問題。并且，該培育方式尚存較多技術難點，包括基因編輯技術、克隆技術和胚胎定向注射干細胞技術等均存在較大的挑戰。此外，FAH敲除豬的藥物維持劑量、剖腹產仔豬的人工培養方案等還需要進行深入研究，加之DPF凈化設施的必要性，使整體研究投入較大且實驗存在較多的不確定性。以上技術難點及其他各方面問題均制約了該方案的開展。但相信隨著異種腎臟、心臟的移植逐步進入臨床研究階段并取得一定成果，將有更多的研究者致力于異種肝臟移植研究，人源化肝臟嵌合體豬也將成功培育。

3 小結與展望

隨著基因編輯技術的發展，可以通過對供體豬進行基因改造和利用人源化細胞獲得肝臟嵌合體來解決異種肝移植后的免疫排斥及生理功能不匹配的雙重問題。首先，對于未來用于異種肝移植供體豬的基因型組合，筆者認為α-Gal，Neu5Gc對于抑制急性排斥反應是抗原敲除的必要選擇，CD47以及ASGR1是抑制異種肝移植術后血小板減少癥等的必需基因，對于人源補體調節蛋白可以采取單個或多個轉入。與此同時，最重要的是要補充人體凝血因子及共刺激阻斷劑等免疫抑制劑方案。通過以上方式不僅有希望大大改善異種肝移植的排斥反應，且可以延長移植物的存活時間，使得基因編輯豬可以更好地發揮“橋接過渡”的作用。其次，在無菌環境下利用基因編輯技術制備GTKO/FAHKO/Rag2KO/IL2RGKO小型豬可作為直接培育人源化器官的來源，這種方式是解決移植物長期存活問題的另一途徑。雖然，目前培育人源化肝臟嵌合體豬面臨著嵌合細胞占比低，基因編輯及克隆技術等問題。但隨著越來越多研究者的關注和研究，相信人源化肝臟嵌合體豬和理想的多基因編輯豬也將被成功培育，以突破異種肝移植目前存在的障礙，推動異種肝移植向臨床應用更靠近一步，為等待肝移植的患者和家庭帶來福音。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：淮國麗負責獻收集，撰寫論及修改；杜嘉祥參與基因編輯部分內容的指導和修改；潘登科提供章思路，指導撰寫及修改。