膽管癌腫瘤微環境與免疫治療

陳 順， 王 俊

1 廣州中醫藥大學附屬中山中醫院(中山市中醫院) 普外科， 廣東 中山 528400；2 湖南省人民醫院 肝膽外科， 長沙 410005

膽管癌(cholangiocarcinoma，CCA)是起源于膽管上皮的惡性腫瘤，根據解剖位置可分為肝內膽管癌、肝門膽管癌和遠端膽管癌。CCA是原發性肝癌的一種，發病率僅次于肝細胞癌，近30年來的發病率在全世界范圍內呈明顯上升趨勢[1]。CCA發病隱匿，早期無明顯癥狀，但具有較強侵襲性，極易向膽管壁浸潤并侵犯周圍肝組織，多數患者確診時即為晚期，無法進行根治。對于早期CCA患者，行根治性肝切除術已是共識，然而，即使行根治性切除術，術后仍然極易復發和轉移，術后5年總體生存率為25%～40%，預后較差[2]。盡管肝內膽管癌、肝門膽管癌和遠端膽管癌具有各自獨特的發病機制、生物學特征和臨床表現，但在微環境構成方面具有相似的特點[3]。有研究[4-6]報道，CCA對放化療不敏感，這與其獨特的腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)有著密不可分的關系。CCA微環境具有豐富的間質纖維化特征，伴有大量浸潤性免疫細胞和腫瘤相關的成纖維細胞浸潤，這種促纖維增生的環境不僅促進腫瘤生長還導致腫瘤對治療的耐受性。同時，腫瘤進展很大程度上取決于TME中癌細胞與非癌組分之間的相互作用，不僅影響腫瘤的發展，而且影響其對治療干預的敏感性和抵抗性。目前，CCA TME相關轉化治療也尚處于探索階段，基于CCA的微環境尋找新的免疫轉化治療是極具潛力的研究方向，筆者就CCA TME和免疫治療近年的研究進展進行綜述，旨在為CCA的進一步研究與治療提供參考。

1993年，Loannnides等[7]首次提出TME概念，特指腫瘤發生、發展所處的局部環境，主要包括由腫瘤細胞、免疫細胞、基質細胞及其分泌性細胞因子以及細胞外基質等通過相互作用共同構成的有利于腫瘤生存、增殖、浸潤及轉移的特殊環境。TME是腫瘤異質性的決定因素，腫瘤細胞與周圍微環境彼此依存，相互影響，腫瘤細胞能夠釋放細胞外信號作用于TME，使其產生免疫耐受。同時，微環境中浸潤的免疫細胞也可以殺傷腫瘤細胞，防止其繼續增殖和轉移。CCA的TME是一個復雜的動態微環境，具有組織缺氧、低pH、間質高壓等特點，可以通過自身基質和外基質細胞分泌與CCA相關的調節介質來構建有利于腫瘤細胞自身發展的環境，也可以通過腫瘤細胞的自分泌和旁分泌方式改變周圍微環境，共同作用促進CCA的進展，并且可以增強CCA對轉化治療的耐受性。

1 CCA微環境特點

CCA的微環境特征是具有高度纖維化和低血管化的環境，微觀下呈現豐富的間質纖維化特征，并且具有大量的腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAF)并伴有促腫瘤和促炎癥免疫細胞浸潤[8-9]。CAF通過產生成纖維細胞特異性蛋白-1、成纖維細胞活化蛋白來誘導CCA細胞的增殖和侵襲，可直接促進腫瘤生長，也可以表達多種表型標志物，如平滑肌肌動蛋白，是CCA間質纖維化的主要細胞[10]。CAF釋放多種旁分泌介質，包括TGFβ1、肝細胞生長因子、表皮生長因子、結締組織生長因子、基質細胞衍生因子-1 (stromal derived factor-1，SDF-1)和細胞外基質成分，如骨膜素、生腱蛋白-C和骨橋蛋白，以及多種基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，如MMP1、MMP2、MMP3和 MMP9[11]。其中，骨膜素的過表達將激活胞膜上的ITGα5β1受體，從而通過PI3K/AKT通路促進CCA的侵襲[12]。此外，SDF-1因子也能夠通過與SDF-1/CXCR4蛋白相互作用來促進CCA的侵襲和轉移，MMP也可參與細胞外基質的降解與重塑。因此，CAF通過這些介質動態的重塑微環境以支持腫瘤生長和侵襲。此外，有研究[13-14]表明，CAF還可以通過影響抗腫瘤免疫細胞的活性和生存來介導TME的免疫抑制，極大的改變CCA患者預后。此外，大量證據表明CAF在調節TME在適應性免疫中的關鍵作用，其分泌大量的細胞因子、趨化因子和促血管生成因子被認為是主要產生免疫抑制的微環境[15]。CAF也表達高水平的纖維母細胞活化蛋白(fibroblastactivation protein，FAP)，這是一種膜結合的絲氨酸蛋白酶，參與細胞外基質的重塑，并且在高侵襲性上皮癌的腫瘤間質中也有FAP高表達[16]。有研究[17]報道，FAP表達確定了一部分CAF具有促炎癥基因上調表達，通過STAT3-CCL2信號通道在TME中募集髓系來源的基質細胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)來促進免疫抑制。MDSC不僅可以通過表達精氨酸酶-1(Arginase-1，Arg-1)和一氧化氮合酶2抑制細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷(NK)細胞活化，還通過免疫抑制細胞因子(如IL-6和IL-10)與調節性T淋巴細胞和巨噬細胞進行交互作用，從而促進腫瘤免疫逃避和免疫治療抵抗[18-19]。除此之外，CCA的TME中還包含有一種特異性的基質細胞充質干細胞，其不僅可以激活Hedgehog信號傳導途徑來促進CCA細胞的增殖與侵襲性，還可以產生誘導型一氧化氮合酶、Arg-1和活性氧，通過阻礙干擾素γ信號傳導途徑來削弱和抑制免疫細胞的抗腫瘤活性。

缺氧是腫瘤常見的生存環境。在無氧條件下，腫瘤細胞利用糖酵解途徑產生大量乳酸并提供能量供給腫瘤細胞，使其生存，這一過程也被成為Warburg效應。對于CCA來說，缺氧條件能夠通過上調三葉因子1、去整合素金屬蛋白酶12、整合素A5和BIRC5等腫瘤增殖相關蛋白的表達，下調UMPS和S100P等腫瘤黏附蛋白表達，進而促進CCA的侵襲和增殖[20]。缺氧還可以通過肝細胞生長因子受體/細胞外調節激酶信號通路來增強CCA的侵襲性[21]。

2 CCA免疫治療與微環境

CCA是高度異質性腫瘤，目前可用的標準化系統治療選擇極其有限，免疫轉化治療是近年來新興療法，尤其是程序性死亡受體1(programmed death-1，PD-1)的免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitor，ICI)、程序性死亡受體-配體1(PD-L1)、細胞毒性T淋巴細胞抗原4型(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)、癌癥疫苗和過繼細胞轉移組成的免疫療法，在過去10年中蓬勃發展，在癌癥治療中取得了巨大進步[22]。使免疫治療成為繼外科手術、化學治療、放射治療之后的又一大支柱。然而，免疫治療的目的是增強自然的抗腫瘤免疫反應，包括先天性細胞[中性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞(DC)、NK細胞等]和適應性細胞(T淋巴細胞和B淋巴細胞)浸潤進入TME[23]。在TME中，經過改善的免疫環境和免疫功能的塑造在預測免疫治療的反應性和確定新的治療策略方面具有巨大的臨床潛力。

圖1 CCA微環境特點

2.1 靶向治療TME 通過抑制腫瘤的進展和侵襲，靶向TME及相關細胞治療CCA具有巨大的臨床應用前景。與靜止的CAF相比，活化的CAF表達高水平的B淋巴細胞瘤-2基因，并且對該基因抑制劑Navitoclax(ABT-263)更敏感。小鼠動物模型實驗證明，Navitoclax可誘導CAF的凋亡，導致細胞外基質沉積、基質面積減少和腫瘤大小減少[24]。成纖維細胞生長因子受體是一種酪氨酸激酶受體，參與細胞增殖和血管生成，多種腫瘤中發現成纖維細胞生長因子受體2異常(包括融合、擴增、突變)，并在腫瘤發生過程中起驅動作用[25]。而CCA(尤其是肝內膽管癌)中，發現存在高頻成纖維細胞生長因子受體2融合[26]。目前，成纖維細胞生長因子受體抑制劑的Ⅱ期臨床試驗結果顯示：Infigratinib(BGJ398)、Derazantinib(ARQ087)、Pemigatinib(INCB054828)藥物在發生成纖維細胞生長因子受體融合突變的CCA患者中獲得較高疾病控制率[27-28]。TGFβ1是一種細胞因子，可激活造血干細胞和CAF，導致纖維化的發生。硫代乙酰胺 (thioacetamide，TAA)會導致肝纖維化，長期的TAA治療會誘發小鼠的CCA發生。給予一種抗TGFβ的單克隆抗體1D11，能夠中和3種TGFβ異構體，因此減少了TAA誘導的肝纖維化和小鼠CCA的發展,由此說明，通過抑制纖維生成和細胞外基質沉積，以造血干細胞或CAF為靶點可能預防或治療CCA[29]。除此之外，有研究[30]表明，采用從CCA腫瘤組織中分離出來的CAF培養基處理人CCA細胞系KKU-213和KKU-100細胞，可誘導CCA細胞分泌IL-6，從而促進腫瘤細胞增殖，表明CCA細胞和CAF之間存在一定關聯。然而，使用白藜蘆醇(一種天然的多酚化合物)預處理的CAF的培養基可以減少IL-6的分泌和腫瘤細胞的增殖以及遷移。由此表明，CAF可以作為治療靶點，以開發CCA的新療法。

已有研究[9]證明腫瘤相關浸潤巨噬細胞(tumor-associated macrophage，TAM)浸潤增加影響CCA預后，在CCA TME中，TAM由趨化因子cc配體2和集落刺激因子1從循環單核細胞中募集。TAM通過釋放TNFα和IL-6來調節TME以促進CCA生長[32]。由于TAM的促腫瘤作用，選擇性的靶向TAM抑制治療CCA擁有巨大的潛力。

MDSC是未成熟的髓系細胞，起源于骨髓，在外周血、淋巴組織并在TME中累積，具有強大的免疫抑制特性。此外，MDSC通過表達Arg-1和一氧化氮合酶2抑制細胞毒性T淋巴細胞和NK細胞活化，還可以通過免疫抑制性細胞因子(如IL-6和IL-10)與調節性T淋巴細胞(Treg)和巨噬細胞進行交互作用，從而促進腫瘤免疫逃避和免疫治療抵抗[33-34]。有研究[35]表明，肝X受體(LXR)/E型載脂蛋白質(Apoe)軸與MDSC的存活有關。同時，有小鼠模型實驗[36]表明，通過注射LXR激動劑(RGX-104/GW3965)，可以通過增強MDSC凋亡，顯著減緩黑色素瘤、膠質母細胞瘤和肺癌等幾種癌癥的生長和抑制腫瘤轉移。有研究[37]表明，LXR激動劑GW3965增強了PD-1的免疫檢查點抑制作用，達到治療性靶向TAM和MDSC的目的。目前，LXR激動劑(RGX-104/GW3965)正在進行Ⅰ期實體腫瘤患者的臨床試驗(NCT02922764)，進一步研究MDSC介導的免疫抑制的機制基礎，和靶向MDSC的藥物對CCA的治療潛力。

DC是可以激活T淋巴細胞的抗原呈遞細胞。有研究[38]指出，從健康人中分離出外周血單個核細胞，刺激其分化出DC與人CCA細胞株KKU-100細胞提取的蛋白裂解物或總RNA共同培育，與對照組相比，這些通過CCA細胞分離的DC可以誘導外周血單個核細胞分化，并增加CD3+CD8+T淋巴細胞數量，由CCA細胞分離出DC激活的淋巴細胞通過誘導KKU-213細胞的凋亡表現出抗癌作用，表明產生激活淋巴細胞的DC的治療潛力，因此靶向DC是一種十分有前景的免疫治療方法。

2.2 ICI 參與抗腫瘤免疫的T淋巴細胞活化后，其表面多種抑制性調節受體表達上調，與腫瘤細胞表面高表達的相應配體結合，對免疫反應產生抑制作用，下調腫瘤相關免疫反應的強度，這些在免疫反應中具有抑制性免疫調節作用的位點，被稱為免疫檢查點(immune checkpoint)。ICI是目前免疫療法研究熱點[39]，如PD-1的ICI、PD-L1、CTLA-4應用十分廣泛。CTLA-4和 PD-1都是由活化T淋巴細胞表達的免疫檢查點，可以通過下調活化T淋巴細胞的功能來抑制免疫反應，從而維持免疫平衡[40]。腫瘤細胞可以通過刺激這種負反應來提高其生存能力，ICI是通過阻斷這種抑制性反應，從而恢復免疫系統消滅癌細胞的功能。有研究[41-43]表明，在CCA腫瘤組織中，PD-1和PD-L1高表達與生存率呈負相關，以組織學分化差，TNM分期高為特點，且PD-L1高表達與腫瘤區域CD8+T淋巴細胞數量增多有關。在批準用于CCA的ICI Pembrolizumab(派姆單抗)，作用于PD-1靶點，正在進行Ⅱ期臨床試驗，試驗顯示可以顯著的改善患者總體生存率，并且可以改善客觀緩解錯配修復缺陷患者的比率。美國食品藥品監督管理局批準了派姆單抗可用于無法手術或轉移性實體腫瘤伴有客觀緩解錯配修復缺陷或高微衛星不穩定性的患者，該試驗包括4例壺腹癌和CCA患者[44-45]。在一項納入40例晚期難治性CCA的臨床研究中，派姆單抗用作二線治療的客觀有效率為10%，三線治療的客觀緩解率為12.5%，中位緩解時間為6.3個月；在進展性疾病患者中，1例隨后獲得完全緩解，中位無進展生存時間和總生存時間分別為1.5個月和4.3個月，每次接受治療的客觀應答與無進展生存時間和總生存時間顯著相關，可見派姆單抗檢查點抑制劑治療晚期CCA有一定的效果[46]。還有諸如納武單抗(Nivolumab)、德瓦魯單抗(Durvalumab)等ICI對于CCA等臨床試驗研究正在進行中，均證明了ICI對CCA的有效性[47-48]。

2.3 ICI聯合靶向藥物 有研究[49]表明，從肝內或肝門周圍CCA患者切除的腫瘤組織中分離淋巴細胞，分析淋巴細胞亞群發現CCA腫瘤組織中含有較多的Treg，而NK細胞、NK T淋巴細胞和CD3+、CD8+T淋巴細胞的數量較正常肝組織低，同時，與無腫瘤肝臟的淋巴細胞相比，CCA組織中的淋巴細胞表達高水平的共刺激受體糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體和共抑制受體PD-1和CTLA-4。使用糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體激動劑或PD-1、CTLA-4拮抗劑可增加CCA細胞衍生T淋巴細胞的增殖和功能。上述研究表明，靶向淋巴細胞聯合ICI，如PD-1、PD-L1軸，對CCA治療擁有巨大潛力，通過恢復巨噬細胞或T淋巴細胞的功能和誘導CCA細胞死亡可能導致新的CCA治療方法的發展。目前，針對 PD-1(NCT02703714、NCT02628067、NCT03111732)和針對PD-L1(NCT03201458、NCT03818997)的單克隆抗體阿特佐利珠單抗正在進行臨床試驗。

在一項開放、單臂、多中心Ⅱ期臨床試驗中，CAF的生長因子受體2抑制劑Pemigatinib(培米替尼)對存在生長因子受體2融合或重排的107例晚期CCA患者效果顯著，其中3例達到完全緩解，35例達到部分緩解，客觀緩解率達到35.5%，88例患者為病情穩定，反應持續時間為7.5個月[50]。在一項Ⅰ期臨床試驗中，派姆單抗聯合血管內皮生長因子受體2抗體Ramucirumab(雷莫蘆單孔)治療CCA，其中1例部分緩解，9例穩定，中位無進展生存時間和總生存時間分別為1.6個月和6.4個月[51]。透明質酸酶可以分解細胞外基質中的透明質酸，可有效發揮抗癌藥物在癌細胞中治療作用，增強抗腫瘤免疫效應，目前其正在臨床試驗中。組蛋白脫乙酰酶抑制劑具有免疫調節效應，可增加腫瘤細胞表達主要組織相容性抗原Ⅱ，抑制Treg和MDSC功能[52]，目前也正在進行試驗。

3 小結

CCA TME具有高度動態變化性，且具有高度纖維化和低血管化的環境特點，且含有大量免疫抑制成分如TAM和MDSC，因此放化療對CCA治療極其有限。大量研究證據表明微環境在CCA侵襲、轉移、增殖中發揮重要作用，其復雜多變的機制決定了CCA的異質性與惡性程度，免疫治療通過靶向微環境中自身基質和外基質細胞分泌的介質或腫瘤趨化因子抑制CCA的進展，目前針對CCA微環境的免疫治療的研究正在進行，并且已成為當前研究熱點，其結果令人期待。CCA TME更全面和完整的機制有待于進一步探索和完善，這將為更高效、更精確治療CCA患者帶來新的突破。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：陳順負責資料分析，撰寫論文；王俊負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。